Name: 미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 애벌레에서 혈구를 추출하여 병원체 침입을 3D 이미징으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 미생물학 연구에서 세포 감염 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 표현 하는 mCherry Coxiella burnetii의 주식을 제공 하기 위한 박사 로버트 Heinzen에 감사입니다. 우리는 비행 주식 제공 무척 추 동물 무지개 빛깔 바이러스 6 및 블루밍턴 재고 센터 제공을 위한 닥터 루이스 테 세이 라 감사 합니다. 이 프로젝트는 NIH 부여 R00 AI106963 (A.G.G.)와 워싱턴 주립 대학에 의해 부분적으로 투자 되었다.

1. 감염 비보 전
<ol><li>매체 및 장비<ol>
<li>무 균 조건 하에서 준비 신선한 초파리 Hemocyte 분리 매체 (작성자) 75% 슈나이더의 초파리 를 포함 보통 25%로 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 필터 살 균 그것.</li>
		<li>레이어는 stereomicroscope에서 10 cm x 10 cm 파라핀 영화의 2-3 조각.</li>
		<li>유리 모 세관을 준비 합니다. 최대의 55%를 모 세관 끌어당기는 히터를 설정 합니다. 약 10 µ m의 날카로운 포인트를 모 세관 튜브를 당겨.</li>
		<li>백필 미네랄 오일 모 세관입니다.</li>
		<li>Nanoinjector (그림 1A)에 채워진된 모 세관 튜브를 조립 하 고 집게 (그림 1B) 끝을 끊어서 융합된 세관 팁을 엽니다. 팁의 외부 직경은 hemocytes의 쉬운 이해를 위한 100 µ m 이어야 한다.</li>
		<li>모 세관 튜브 끝에서 가능한 많은 기름 추출 다음 작성자와 작성. 최대 촬영 hemolymph와 오일의 테두리 쉽게 시각화, 포함 석유와 작성자 사이 공기 거품 (그림 1B').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph 추출<ol>
<li>선택 3rd 탈피 초파리 애벌레 안쪽에서 음식의 벽 집게를 사용 하 여 부드럽게 리 바이 알 및 100 µ m 여과기 (그림 1C)에 그들을 배치. 3rd 탈피 애벌레는 성인 여성에 의해 누워 비옥한 계란을 다음 3-6 일 찾을 수 있습니다. 참고: 이러한 실험 사용 유전자 형, w1118; P {w+ mCHml GAL4.Δ =} 2, P {w+ mCUAS-2xEGFP =} AH2, 이후이 동물에서 hemocytes 표현 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 현미경으로 세포의 식별에 도움.</li>
		<li>애벌레에 붓는 살 균 물의 5 mL와 5 미 장소 작업 지우기에 여과기 과잉의 물을 제거 하는 여과기를 흔들어 (그림 1C').</li>
		<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 애벌레를 전송 합니다. 5 CO2 가스와 함께 그들을 anesthetize (그림 1D).</li>
		<li>등-면 (그림 2A) 최대 stereomicroscope, 아래 파라핀 필름에 애벌레를 놓습니다.</li>
		<li>제자리에 후부 표 피 중단을 장소 애벌레 후부 시체에 가볍게 모 세관 유리 정밀한 날카로운된 집게 (그림 2B)를 사용 하 여 엽니다.</li>
		<li>Hemolymph 파라핀 필름 (그림 2C)에 흐르는 것을 허용 한다.</li>
		<li>파라핀 영화에 한 번에 20-50 애벌레에서 hemocytes를 포함 하는 hemolymph의 풀을 확인 합니다.</li>
		<li>소요는 유리를 사용 하 여 풀링된 hemolymph nanoinjector (그림 2D)에 모 세관. 참고: hemolymph의 약 10-20 µ L을 하 고 있어야 합니다.</li>
		<li>작성자 (그림 2E)의 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 관으로는 hemolymph를 꺼냅니다.</li>
		<li>반복 단계 1.2.4)-1.2.9) 애벌레의 모든 일괄 처리에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemocytes의 수를 계산 합니다.<ol>
<li>죽은 세포 얼룩 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 5 µ L 플라스틱 부드럽게 작성자와는 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 hemocytes 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 hemocytes를 포함 하 여 작성자의 5 µ L를 전송 하 고 부드럽게 혼합.</li>
		<li>1:1 Trypan 파랑: hemocyte 혼합물에서 셀의 10 µ L는 hemocytometer에 플라스틱.</li>
		<li>라이브 hemocytes는 하지로 얼룩진 Trypan 블루는 hemocytomter의 4 모서리 필드의 각을 계산 하는 수식을 사용 하 여 밀리 리터 당 hemocytes의 농도의 수를 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> 여기서 X는 밀리; 당 라이브 hemocytes의 농도 a, b, c, 그리고 d는 필드의 각 4 (Trypan 블루 제외 결정)로 라이브 셀 수는 hemocytometer에 계산. 셀 계산의 총 수의 2에 의해 Trypan 블루 셀의 1:1 희석 때문입니다. Trypan 푸른 물 셀 죽으로 간주 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
비보 전 감염<ol>
<li>Timepoints 및 생물에 따라 세포와 시드를 우물의 수 복제 각 실험에 필요한 결정 합니다. 5.0 × 104 hemocytes는 RNA와 단백질 정화 감염 다음 필요한.</li>
		<li>작성자는 다음 수식을 사용 하 여 감염에 대 한 희석에 병원 체의 볼륨을 계산: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> 어디 감염 (MOI)의 다양성은 바이러스의 수 또는 박테리아 세포 당 원하는. 참고: 사용 하는 나는 개별 실험 및 분석 실험 수행에 따라 다릅니다. 여기, 10 게놈 등가물 (GE) / C. burnetii, Listeria의 10 CFU/셀 또는 IIV6의 1 TCID50/cell의 셀이 사용 되었다.</li>
		<li>튜브에 바이러스 성 또는 세균성 볼륨에 작성자의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 24-잘 접시의 각 음에 대 한 병원 체 매체의 500 µ L를 준비 합니다.</li>
		<li>장소는 12 m m 24-잘 접시의 우물에 덮개 유리 (두께 1) 라운드.</li>
		<li>24-잘 접시의 우물에는 hemocytes를 포함 하 여 작성자를 분할.</li>
		<li>잘에서 hemocytes에 병원 체 매체의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1000 x g 5 분 동안에 격판덮개 원심</li>
		<li>1 h 28 ° c.에 대 한 접시를 품 어 모든 15 분 부드럽게 앞, 다음 5 오른쪽 왼쪽 뒤에서 접시 기울기 손으로 s.</li>
		<li>침공/첨부 파일 단계 1.4.8의 1 h), 후 부드럽게 병원 체 매체에서 플라스틱 세척 신선한 작성자와 hemocytes 그리고 신선한 작성자의 500 µ L 리필.</li>
		<li>원하는 시간에 대 한 감염된 hemocytes를 품 어. 이러한 실험, C. burnetii에서-또는 IIV6에 감염 된 hemocytes는 24 시간, 및 Listeriaincubated-감염된 hemocytes 1, 2, 또는 4 h 알을 품는.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vivo에서 감염
<ol><li>감염<ol>
<li>따뜻한 실 온 15 분 접시에서 초파리 과일 주스 천 배지 이전 만들어집니다20을설명 합니다.<ol>
<li>물과 압력솥의 700 mL를 agar의 30 g 추가 40 분 동안 그것.</li>
			<li>메 틸 paraben 절대 에탄올 10 mL에 0.5 g을 녹.</li>
			<li>과일 주스 농축의 300 mL에 메 틸 paraben 솔루션을 추가 합니다.</li>
			<li>신속 하 게 압력가 한 솔루션으로 농축 혼합 하 고 10 × 35 mm 페 트리 접시에 5 mL을 분배.</li>
			<li>후 15 분 동안 냉각 판, 4 ° c.에서 그들을 저장합니다</li>
		</ol>
</li>
		<li>3rd 탈피 애벌레 1.2.1 단계 준비)-1.2.3).</li>
		<li>한 천 배지에서 효 모 반죽을 놓습니다. 애벌레 (그림 3A) 건조를 피하기 위해 마이그레이션할 수 한 천 배지에서 잘 컷을 확인 합니다. 파라핀 영화 (그림 3B, C)를 사용 하 여 집게를 들고와 0.001 m m 지적된 텅스텐 바늘을 조립.</li>
		<li>높은 titer mCherry의 50 µ L 플라스틱 표현-C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL)를 파라핀에 스테레오 현미경 영화 하 고 애벌레 박테리아의 수영장.</li>
		<li>박테리아의 수영장으로 애벌레를 놓습니다. 텅스텐 바늘 (그림 3D) 애벌레를 찌 르 기. 한 천 배지 (그림 3E)에 애벌레를 전송 합니다.</li>
		<li>한 접시에 나머지 병원 체 매체 전송 및 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인.</li>
		<li>원하는 시간 후 감염 (그림 3F)까지 습 한 공기에는 접시에 애벌레 계속. 이 실험에서 C. burnetii-24 h에 대 한 접시에는 감염 된 애벌레.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph 추출 및 hemocytes의 도금<ol>
<li>준비 단계 1.1 다음과 같은 장비와 매체).</li>
		<li>장소는 12 m m 24-잘 접시의 우물에 덮개 유리 (두께 1) 라운드. 우물에 작성자의 500 µ L 플라스틱</li>
		<li>에서 추출 하는 hemolymph 단계 1.2.4 감염 된 애벌레)-1.2.8).</li>
		<li>그럼 다음에 hemolymph를 추출 단계 2.2.2).</li>
		<li>2.2.3 반복) 및 2.2.4) 애벌레의 여러 일괄 처리에 대 한.</li>
		<li>1000 x g 5 분 동안에 격판덮개 원심</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 시각화
<ol><li>담합 및 얼룩<ol>
<li>우물에서 라운드 커버 유리에 hemocytes 수 있도록, 후 부드럽게 각 우물에서 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>부드럽게 정착된 hemocytes의 각 음에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 200 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 20 분 동안 hemocytes를 품 어.</li>
		<li>4% 제거 PFA 부드럽게 0.1%를 포함 하는 PBS의 200 µ L을 추가 하 고 트라이 톤 X-100 그리고 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 각 잘 하. 실 온에서 10 분 동안 hemocytes를 품 어.</li>
		<li>PBS를 제거 하 고 부드럽게 200 µ L의 ' 1 × 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 각 영역을 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 10 분 동안 hemocytes를 품 어.</li>
		<li>DAPI 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 각 우물에 PBS를 추가. 실 온에서 5 분 동안 hemocytes를 품 어.</li>
		<li>유리 현미경 슬라이드에서 antifade 설치 매체의 10 µ L를 드롭.</li>
		<li>각 우물에서 PBS를 제거한 후 덮개 유리 잘 지적 집게를 사용 하 여 24-잘 접시에서 제거 합니다. 부드럽게 유리 슬라이드에 아래로 hemocytes antifade 장착 매체에 커버 유리 넣습니다.</li>
		<li>어두운 하룻밤에 그것을 배치 하 여 건조를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocal 영상<ol>
<li>DAPI, EGFP, 및 mCherry의 세 가지 컬러 이미징 공초점 현미경을 구성 합니다. 다음 설정 사용: (예) 405 DAPI 여기 nm, 방출 (em) 415-480 nm; 488 전 EGFP nm, em 493-564 nm; 587 ex mCherry nm, em 597-700 nm.</li>
		<li>현미경과 63 X를 사용 하 여 샘플에 초점에 샘플 배치 / 1.4 수 가늠 구멍 (NA) 목표. 이미징에 대 한 보기 필드에에서 원하는 hemocytes를 찾습니다.</li>
		<li>샘플의 적절 한 노출을 달성 레이저 파워 및 검출기 이익 조정 합니다. 여러 z-비행기 노출 수준 전체 샘플 두께 적합 한지를 확인 하십시오.</li>
		<li>전체 hemocyte의 z 축에서 위쪽 및 아래쪽 위치를 찾아. Z 단면에 대 한 시작 및 끝 위치도이 위치를 설정 합니다.</li>
		<li>검색 줌 이미지는 hemocyte에 포함 된 영역을 사용 합니다. 3 X의 확대/축소 요소는 자주 사용 하 고 있다.</li>
		<li>X-y 평면에서 1024 x 1024 픽셀 등 적절 한 해상도 이미지 시리즈와 z 차원에서 0.3 µ m 간격을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D 모델 재구성 참고: 오픈 소스 소프트웨어는 3D 모델 재구성에 대 한 대부분의 아래에 설명 된 함수를 수행 하는 존재 합니다.<ol>
<li>3D 모델 재구성 confocal 현미경과 관련 된 소프트웨어에 z sectioned 이미지 시리즈 파일을 가져옵니다.</li>
		<li>DAPI와 mCherry C. burnetii 는 EGFP hemocyte 표현에 표현 스테인드 핵의 공동 지역화를 표시 하는 셀을 선택 합니다. 자르기만 단일 셀을 포함 하도록 이미지 시리즈.</li>
		<li>3D 뷰어 옵션 소프트웨어의 사전 패키지 된 알고리즘을 사용 하 여 3D 모델을 재구성을 선택 합니다. 3D 표현 혼합, 표면, 및 혼합된 옵션 중 원하는 유형을 선택 합니다. 이 방법에서는, hemocytes, 핵, 및 C. burnetii 표시 됩니다 표면 모델을 사용 하 여.</li>
		<li>마우스 버튼을 누른 화면 커서를 드래그 하 여 보기의 다양 한 위치에서 3D 복원된 셀을 관찰 합니다. 셀 방향 및 이미지를 최적화 하기 위해 모델된 광원의 위치를 조정 합니다. 불투명도, 최소 및 최대 임계값, 스 페 큘 러, 주위, Shineness, 및 감마에 대 한 다른 옵션 이미지를 최적화 하기 위해 존재 합니다.</li>
		<li>횡단면은 hemocyte의 내부 내용을 시각화를 클리핑 및 단면 명령을 사용 하 여 모델을 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 유전자 및 단백질 분석에 대 한 응용 프로그램
<ol><li>후속 qRT-PCR를 위한 세포를 lyse 다음 IIV6 및 Listeria, 감염 또는 서쪽 오 점 분석 앞에서 설명한 다음 제조업체의 지침과21 . 참고: qRT-PCR를 위한 뇌관 및 서쪽 오 점을 위해 항 체에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	<li>증폭된 제품의 적절 한 길이 있도록 agarose 젤 전기 이동 법, 앞에서 설명한22로 PCR 제품 분석.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

잘 이해 하려면 어떻게 호스트 세포 감염 될, 이전 안 된 병원 체와 세포 유형 조합4에 실험 하는 경우에 특히 셀, 병원 체의 지역화를 명확 하 게 중요 하다. 동안 감염에 따라 세포질 응답 캐스케이드 공부 생산 병원 체 침입을 나타낼 수 있습니다, 이미징 및 세포 응답 데이터의 조합 병원 체 침입 및 감염을 필수적 이다. 호스트 세포에 병원 체의 2 차원 이미지를 보여 주는 보고서 생산적인 감염을 표시 하는 경향이 있다, 몇 가지 질문 수 호스트 세포에서 초기 병원 체 침입의 타이밍에 대하여 남아 있다. 따라서, 3D 모델을 2D 이미지의 z-섹션 검색에서 재건 이러한 질문을 해결 하 고 호스트 세포 (그림 4 및 5)에 병원 체 위치를 나타내는 수 있습니다. 그러나, 기본 hemocytes를 사용 하 여 제한 셀 문화에 그들의 장 수 이다. 이전 보고서 상태 셀 문화 미디어에서 hemocyte 생존은만 8 h<sup cl...

초파리 melanogaster 타고 난 면제1의 연구에 대 한 기초가 튼튼한 모델 생물 이다. 타고 난 면역 반응 동안 hemocytes 병원 체 도전 하 응답에서 중요 한 역할을 재생합니다. Hemocytes는 캡슐화 기생충, 곰 팡이, 바이러스, 그리고 세균성 감염2,3중 phagocytic 행동을 통해 병원 체 퇴치에 중요 한 기능을가지고 위한 중요 합니다.
최고의 호스트의 병원 성 미생물 감염에 타고 난 면역 반응 이해, 그것은 병원 체 감염 시 호스트 셀을 침공 하는 방법을 시각화 하는 것이 중요. 이 시각화의 메커니즘의 이해에 기여 한다. 병원 체 세포내 지역화의 세부 사항 및 세포질 응답, 이러한 데이터는 감염 하는 미생물이 작용 하는 세포 세포 호스트 응답에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 따라서, 영상 현미경 검사 법에 의해 후 3D 모델 재구성 호스트 세포에 병원 균의 정확한 위치를 확인 하려면 유용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 Coxiella burnetii (C. burnetii), Q 열, 기본 초파리 hemocytes에 둘 다 인간과 동물 건강에 심각한 위협이 포즈 동물 매개 질병의 원인이 되는 대리인의 침공 시각. 최근에, 그것은 초파리 는 Biosafety 수준 2 9 마일 단계 II (NMII) 복제 4 C. burnetii 의 긴장과이 긴장은 초파리4를 복제할 수는 를 나타내는에 취약 입증 되었다 초파리 C. burnetii 병 인을 공부 하는 모델 생물으로 사용할 수 있습니다.
이전 연구는 호스트의 타고 난 면역 반응 검사를 hemocytes를 사용 했습니다. Hemocytes 형태학 관찰5,,67, 형태학 분석2,8, 먹어서 분석2,3, qRT-PCR2 사용 되었습니다. , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent 분석10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 및 immunohistochemistry9,14. 초파리 S2 세포, 다양 한 생체 외에서 실험에 사용할 수도 있지만 immortalization 및 잠재적인 기존의 바이러스 감염 그들의 행동15,16변경. S2 세포 같은 불멸 하 게 셀 라인, 반대로 1 차 셀의 사용 수 있습니다 타고 난 면역 기능 연구에 대 한 시스템에서 전체 유기 체의 더 대표. 또한, hemocytes에서 vivo에서, 추출, 이전 감염 다른 호스트 단백질 및 조직, 비보 전 감염 전에 hemocytes의 추출에 비해 우위를 셀 수 있습니다. 다른 방법의 수는 hemocytes 살아8,17,,1819계속 시간의 짧은 기간에 hemocytes의 충분 한 수를 이용 되어 있다.
이 연구에서는 hemocytes C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria), 또는 무척추동물 무지개 빛깔의 병원 성 미생물 감염에 대 한 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 하는 방법 소개 6 (IIV6) 바이러스입니다. Vivo에서 및 비보 전 hemocyte 감염에 대 한 방법을 설명합니다. Vivo에서-와 ex vivo-감염된 hemocytes confocal 현미경 검사 법으로 구상 되었고 C. burnetii 의 3D 모델을 구축 하는 데 사용. 또한, 프로토콜을 사용 하는 추출, ex vivo-감염된 hemocytes 유전자와 단백질 식에 사용 된 분석 실험. 특히, IIV6 및 Listeria감염의 정도 검사, 총 RNA 또는 단백질 했다 격리 qRT-PCR 또는 서쪽 오 점 분석에 대 한 셀에서. 함께 찍은, 프로토콜 빠르게 3rd 탈피 애벌레와 기본 hemocytes, vivo에서 또는 전 비보감염 증거에서 hemocytes의 높은 숫자를 수집 하는 메서드를 제공 합니다에 대 한 적합 한 플랫폼 미생물 병원 체 감염 연구 그리고 현미경 검사 법, transcriptomics, proteomics 등 해당 다운스트림 분석.

<table><tbody><tr><td>슈나이더의 Drosophila 미디엄&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&nbsp; (하이클론)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>필터(0.22 &마이크로; L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>스트레이너(100 &마이크로; m)</td> <td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr> <tr><td>실체 현미경</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr> <tr><td>유리 모세관</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr> <tr><td>모세관 풀러</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>나노인젝터</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>겸자</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO2 delivery 장치</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Coxiella burnetii - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Drosophila 과일 주스 플레이트</td><td>콜드 스프링 하버 프로토콜</td><td></td><td>2.1)</td></tr><tr><td>http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full 한천</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>메틸 파라벤</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch's 100% 포도 주스 냉동 농축액, 340mL</td><td>아마존</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>페트리 접시, 10 x 35mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>효모, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) 물 2부를 첨가합니다. 효모 (v / v)의 1 부분</td></tr> <tr><td>텅스텐 바늘</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr> <tr><td>집게</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr> <tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr> <tr><td>트리톤 X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr> <tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>안티페이드 마운팅 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>컨포칼 마이크로솝</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X 백색광 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3D 이미징 재구성 소프트웨어</td><td>Leica</td><td>LASX 3D 시각화 모듈</td> <td>포함3.3)</td></tr> <tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr> <tr><td>무척추 동물 무지개 빛깔 바이러스 6 (IIV6)</td> <td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>strain: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987)는 50 &micro를 함유하는 Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences)에서 성장하였다; g/ml 스트렙토마이신 30 &deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA 분해</td></tr><tr><td>cDNA 합성 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA 합성</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R</td></tr> <tr><td></td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd</td></tr> <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- GAA GCG, TTT CTC, CAA ACG -AG</td></tr> RpII_qRTPCR_rev <tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green qRT-PCR 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes 항체</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>안티 액틴 항체 토끼</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>안티 토끼 IgG (H + L), HRP Conjugate</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>웨스턴 블롯</td></tr>에서 생산</tbody></table>

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 hemocytes의 추출

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

초파리 melanogaster 의 병원 성 감염 시 hemocytes 감염을 통해 면역 반응에 중요 한 역할을 재생합니다. 따라서,이 프로토콜의 목표, 즉 hemocytes의 특정 면역에 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 개발 하는 것입니다. 여기, 3 × 10에 제시 된 방법을 사용 하 여6 라이브 hemocytes ex vivo 감염에 대 일 분에서 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 얻을 수 있습니다. 또는, hemocytes는 감염 된 vivo에서 구명 hemocyte 추출에 의해 감염 된 후 24 시간에 3rd 탈피 애벌레의 주사를 통해 하실 수 있습니다. 이러한 감염된 1 차 셀 고정, 스테인드, 고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 그럼, 3D 표현 병원 체 침입을 결정적으로 보여 이미지에서 생성 되었습니다. 또한, qRT-PCR에 대 한 높은-품질 RNA 병원 체 mRNA 다음의 탐지를 위해 얻어질 수 있다 감염, 그리고 충분 한 단백질 서쪽 오 점 분석에 대 한 이러한 셀에서 추출할 수 있습니다. 함께 찍은, 우리 병원 체 침입의 확실 한 조정 및 세균성과 바이러스 성 병원 체 종류와 hemocyte 추출 위한 효율적인 방법 초파리 에서 충분 한 라이브 hemocytes를 사용 하 여 감염의 확인 하는 방법 제시 vivo ex vivo에서 감염 실험의 애벌레

수집 3 × 10에 ex vivo 감염에 대 한 hemocytes 살고6 hemocytes 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 되었다. 우리의 방법 개발, 다양 한 다른 기술 시도 했다. 개별 애벌레 해 부까지 1.5 h 걸릴 것 이라고 하 고 ~ 8000 셀의 평균이 방법18, 대부분의 컬렉션의 끝에 의해 살아 있던을 사용 하 여 얻은 했다. 다음, 우리는 hemocytes를 포함 하는 hemolymph를 추출 하려고, 한 번 사용 하 여 표 피와 유리 모 세관 튜브19, 하지만 모 세관 막힌 되었다 20 애벌레에서 소재와 hemolymph 하지 못했습니다 유리에 의해 효율적으로 채택 될 모 세관입니다. 마지막으로, 우리는 기계적으로 미세 집게12, 일괄 처리 당 ...

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

이 기술은 세포 감염 및 미생물학 분야의 주요 질문, 예를 들어 혈구가 초파리의 전반적인 면역 반응에 어떻게 기여하는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전에 감염된 유충을 사용하여 실험실에서 수행 할 수 있다는 것입니다. 대안적으로, 감염되지 않은 유충의 혈구를 생체 외 감염에 사용할 수 있습니다.컨포칼 현미경의 복잡성과 3D 모델 재구성 옵션으로 인해 이미징 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 프로토콜을 시작하려면 실체 현미경 아래에서 10cm x 10cm 파라핀 필름 2-3개를 겹겹이 쌓습니다. 다음으로, 모세관 극성 히터를 최대 55%로 설정하여 유리 모세관을 준비합니다.모세관 튜브를 약 10마이크로미터의 날카로운 지점으로 접습니다. 모세관을 미네랄 오일로 다시 채웁니다. 채워진 모세관 튜브를 나노 주입기에 조립합니다.그리고 집게로 팁을 부러뜨려 융합된 모세관 팁을 엽니다. 모세관 끝에서 가능한 한 많은 오일을 배출한 다음 튜브에 초파리 혈구 분리 배지(DHIM)를 채웁니다. 혈림프 오일의 경계를 쉽게 시각화하려면 오일과 DHIM 사이에 기포를 포함하십시오.집게를 사용하여 식품 바이알의 내벽에서 10/3의 instar 초파리 유충을 부드럽게 골라 100마이크로미터 여과기에 넣습니다. 유충에 멸균수 5ml를 붓고 여과기를 5초 동안 흔듭니다. 스트레이너를 작업용 물티슈에 올려 여분의 물을 제거합니다.유충을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 CO2 가스로 5초 동안 마취합니다. 그런 다음 등쪽이 위를 향하도록 하여 실체 현미경 아래의 파라핀 필름에 유충을 놓습니다. 유리 모세관을 유충 뒤쪽 몸체에 가볍게 올려 놓고 제자리에 고정하고 가는 뾰족한 집게를 사용하여 뒤쪽 큐티클 열기를 방해합니다.혈림프가 파라핀 필름으로 흐르도록 합니다. 파라핀 필름에 한 번에 20-50 개의 유충을 포함하여 혈림프 풀을 만드십시오. 나노인젝터의 유리 모세관을 사용하여 고인 혈림프를 흡수합니다.500마이크로리터의 DHIM이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 혈림프를 배출합니다. 포도 주스 한천 접시에 효모 페이스트를 놓습니다. 유충이 건조를 피하기 위해 이동할 수 있는 한천을 미세하게 자릅니다.파라핀 필름을 사용하여 집게를 잡고 0.001mm 뾰족한 텅스텐 바늘을 조립합니다. 실체 현미경으로 파라핀 필름에 50 마이크로 리터의

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

초파리 혈림프는 혈액과 간질액의 역할을 하며 유충과 성충 단계에서 몸 전체를 순환합니다. 이 비디오는 순환 세포를 정량화하기 위해 유충 혈림프를 수집하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

큐티클 파괴: 초파리 유충에서 혈림프를 수집하는 방법

출처: Hiroyasu, A., D 외, 미생물 감염을 위한 초파리 흑가스터 유충에서 혈구 추출 및 분석. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 초파리 유충을 박테리아 방울에 넣고 텅스텐 바늘로 찌르는 과정을 시연합니다. 유충은 홈이 있는 영양분이 풍부한 한천 플레이트 위에서 배양되어 숙주-병원체 상호작용을 연구합니다.

초파리 유충에서 세균 감염 확립

출처: 히로야스, A. 외. 미생물 감염 및 분석을 위한 Drosophila melanogaster 유충에서 혈구 추출. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 Coxiella burnetii에 감염된 초파리 흑위 혈구의 고해상도 공초점 영상을 시연하여 병원체 위치를 3D로 시각화하여 세포 내 감염 역학과 숙주-병원체 상호작용을 상세히 분석할 수 있게 합니다.

병원체에 감염된 초파리 혈구의 고해상도 공초점 영상

이 비디오는 초파리 유충의 조혈 주머니에서 혈구 재접착을 평가하는 혈구 교란 분석을 보여줍니다. 기계적 교란은 상주 혈구를 방출하여 순환 혈구 수를 증가시킵니다. 회복 후, 상주 혈구의 재부착이 확인되어 가역성을 보여줍니다.

조혈낭에 대한 적세포 재부착을 평가하기 위한 Hemocyte Disturbance Assay

Drosophila melanogaster는 선천성 면역 체계와 감염 및 질병의 생리학적 결과를 연구하기 위한 뛰어난 모델 유기체입니다. 이 프로토콜은 강력하고 정량적으로 반복 가능한 박테리아 감염을 D. melanogaster에 전달하는 방법과 이후에 감염 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 방법을 설명합니다.

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에<em&gt; 초파리 melanogaster의</em

초파리 혈액 세포 또는 혈구는 거주 부위와 순환 사이를 순환합니다.  유충에서 상주(고착성) 혈구는 유도성 미세환경인 Hematopoietic Pockets에 국한되는 반면, 순환하는 혈구는 혈림프에서 자유롭게 움직입니다. 이 프로토콜의 목표는 행동적으로 다르지만 상호 변화하는 이 두 가지 혈구 집단의 표준화된 분리 및 정량화입니다.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

초파리와 포유류의 조혈 시스템은 조혈을 연구하기 위해 초파리에게 매력적인 유전 적 모델을 만들고, 많은 일반적인 기능을 공유 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 면역 조직 화학의 주요 애벌레 조혈 기관의 해부 및 장착을 보여줍니다. 우리는 또한 순환 혈구 세포와 고착 결정 세포 등 다양한 애벌레 조혈 구획을 분석하는 방법을 설명합니다.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

이 프로토콜은 소아 세포토균에 젊고 숙성된 Drosophila 멜라노가스터 혈구세포의 능력을 평가하고 정량화하는 데 사용되는 phagocytosis의 생체 내 분석방법을설명합니다.

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

초파리 멜라노가스터 성인 파리는 숙주 항미생물 선천적 면역 반응 및 미생물 감염 전략의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하기 위한 모델 유기체로서 광범위하게 활용되고 있다. D. melanogaster 유충 단계를 추가 또는 대안 모델 시스템으로서 촉진하기 위해, 애벌레 주입 기술이 기술된다.

초파리 멜라노가스터 유충 주입 프로토콜

학습하세요 Drosophila melanogaster 애벌레에서 혈구를 추출하여 병원체 침입을 3D 이미징으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 미생물학 연구에서 세포 감염 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

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