혈액 기반 ROS1의 검출을 위한 테스트 및 RET Ribonucleic 산 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 순환에서 퓨전 성적표

이 절차의 전반적인 목표는 전혈 샘플에서 종양 유래 순환 리보 핵산의 액적 디지털 PCR에 의한 분리 및 특성화입니다. 이 방법은 종양학 진단 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 순환 RNA 및 혈액 샘플에서 종양 유래 유전자 융합 transcipts를 검출하는 방법.

이 기술의 주요 장점은 저주파 및 혈액 샘플에 존재하는 RNA 변이체의 안정화, 추출 및 검출을 위해 고도로 최적화된 방법을 사용한다는 것입니다. 혈액 기반 검사는 신속한 결과를 제공할 수 있는 최소 침습 기술을 활용할 수 있는 이점과 함께 기존 조직 생검을 보완합니다. 이 방법은 임상적으로 중요한 돌연변이와 NSCLC에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 전혈에서 순환하는 RNA 분자의 접근 가능하고 빠른 식별이 필요한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

역전사 반응을 위한 순환 RNA는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 공여자의 혈액 샘플에서 분리됩니다. 무작위 프라이머를 포함하여 상업적으로 이용 가능한 역전사 반응 키트를 사용하여 농축된 순환 RNA 샘플을 cDNA로 변환합니다. no reverse transciptase control 샘플과 no RNA control 샘플을 포함합니다.

역전사 반응이 완료되면 시판되는 DNA 농축기 스핀 컬럼을 사용하여 반응 혼합물에서 cDNA를 분리합니다. 이 단계는 효소, 프라이머 및 유리 데옥시뉴클레오티드 삼인산의 제거를 용이하게 합니다. cDNA가 PCR 반응에서 즉시 사용되지 않을 경우 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오.

이 절차를 수행하는 동안 폐기 실험실 가운과 니트릴 장갑을 착용하고 전용 시약 준비 구역을 마련하십시오. 연속적인 빛은 프로브에 부착된 형광 염료를 광표백할 수 있으므로 빛으로부터 보호하기 위해 프로브를 덮으십시오. 먼저 이 표에 표시된 대로 20 마이크로리터의 최종 반응 부피에 대해 PCR 혼합물을 준비하되 아직 cDNA를 첨가하지 않습니다.

다음으로, 덮개가 있고 빛으로부터 보호되는 혼합물을 별도의 사전 증폭 영역에 있는 PCR 클린 후드로 운반합니다. 혼합물을 PCR 플레이트에 분배합니다. 테스트할 cDNA를 PCR mix에 추가합니다.

탈착식 플레이트 실러로 플레이트를 덮습니다. 플레이트를 잠시 원심 분리하여 우물 바닥에서 샘플을 수집합니다. 접시 셰이커에 넣고 낮은 온도로 10초간 믹싱합니다.

플레이트를 다시 짧게 원심 분리하여 우물 바닥에서 샘플을 수집합니다. 수동 액적 생성을 수행하기 전에 플레이트 밀봉기를 제거하십시오. 샘플을 로딩할 때 피펫 팁의 기포를 최소화하고 나중에 액적 손상을 방지하기 위해 카트리지에서 플레이트로 액적을 천천히 옮기는 것이 중요합니다.

PCR 혼합물 20마이크로리터를 액적 생성 카트리지의 샘플 웰로 조심스럽게 옮깁니다. 70마이크로리터의 방울 생성 오일을 추가합니다. 고무 개스킷으로 덮고 카트리지를 수동 액적 발생기로 옮겨 액적 생성을 시작합니다.

액적 생성 후에는 제조업체에서 권장하는 팁을 사용하여 액적을 새 PCR 플레이트로 옮깁니다. 팁 끝을 액적 카트리지 또는 플레이트에 건드리지 않도록 각각 5-6초에 걸쳐 천천히 액적을 흡인하고 분주합니다. 호일 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하십시오.

다음 설정을 사용하여 열 순환기에서 PCR을 수행합니다. 열 순환기 실행이 완료된 후 액적 판독기를 사용하여 플레이트를 읽습니다. 제어 장치 및 샘플의 위치를 식별하는 리더 소프트웨어용 플레이트 레이아웃을 생성하고 소프트웨어에 로드하여 판독을 시작합니다.

플레이트 판독 결과는 시판되는 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 먼저 분석 메뉴로 이동하여 2차원 또는 2D 진폭 플롯을 확인합니다. 액적 데이터를 검사하여 데이터의 전반적인 품질을 평가합니다.

이벤트 메뉴를 사용하여 허용된 총 이벤트 번호에 대한 데이터를 평가합니다. 우물당 10, 000개 이상의 이벤트가 있어야 합니다. 그렇지 않은 경우 추가 문제에 대해 데이터를 신중하게 평가해야 합니다.

다음으로, 혐오스러운 형광 진폭이 있는지 데이터를 확인합니다. 반복 샘플 간의 상당한 진폭 차이와 농도 차이는 샘플의 취급 또는 혼합 불량을 나타냅니다. 45도 축에 스프레이 패턴이 있는 액적 클러스터를 기록해 두는데, 이는 품질이 좋지 않은 액적 또는 문제가 있는 샘플을 나타냅니다.

양성 대조군, 역전사효소 대조군 및 RNA 대조군이 없는 데이터에 대한 데이터를 먼저 검사합니다. 모든 대조군 샘플을 선택하고 적절한 임계값을 위해 2D 플롯으로 클러스터 품질을 검사하면 액적 클러스터 간의 명확한 분리가 분명해야 합니다. 각 분석 변형에 대해 control well을 기반으로 임계값을 설정합니다.

십자선 도구를 사용하여 2D 플롯에 임계값을 설정하여 x축의 대조 유전자 집단과 이중 음성 액적 집단을 분리하고 y축의 변이 유전자 집단(존재하는 경우)을 분리합니다. 단일 샘플에 대한 각 리플리컨트 웰의 일부 사본. 마지막으로, 테스트 결과를 감지된 variant copy의 수로 표현합니다.

세포주를 사용하여 전체 인간 야생형 RNA의 배경에서 희석된 SDC4-ROS1 융합 및 CCDC6-RET 융합을 발현하며, 각 융합 변이체에 대해 0.2% 변이 빈도로 설정된 검출 한계. 표적 세포주 유래 RNA에서 5% 떨어진 제제는 검출되지 않았으며, 이는 분석 특이성을 입증했습니다. 분석적 멀티플렉스 RNA 표준물질은 같은 날 3회 실행에 걸쳐 고농도, 중농도 및 저농도로 측정되었습니다.

3일 연속으로 3회 운행, 2명의 독립 운영자와 함께 운행합니다. 그 결과는 관심 있는 융합 전사체와 내부 대조 유전자 GUSB를 모두 정확하게 검출하는 것을 보여줍니다. 임상 샘플의 각 바흐는 또한 positive control, no reverse transcriptase control 및 no RNA template control로 실행되었습니다.

Fusion 변형은 y축을 따라 표시되고 GASB는 x축에 표시됩니다. 21일 동안 배치 대조군을 평가했을 때, 모든 실행에서 ROS1 및 RET에 대해 융합 양성 방울과 GUSB 대조군 유전자 방울이 관찰되었습니다. 역전사효소가 없는 대조군 내의 오염, RNA가 없는 대조군 내의 오염, 액적의 공유 및 유착, 최적화되지 않은 PCR 조건 또는 PCR 억제가 있는 경우 대표적인 차선의 결과가 표시됩니다.

일단 마스터하면 이 전체 프로토콜을 약 12시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 RNA 및 인간 혈액 표본을 취급하기 위한 모범 사례를 사용하는 것이 중요합니다. RNA를 분리한 후, 새로운 융합 변이체의 식별과 같은 추가 질문에 답하기 위해 차세대 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 전혈 및 혈장에서 순환 RNA를 분리한 다음 RET 및 ROS1과 같은 순환 중인 희귀 변이체를 식별하기 위해 회수된 RNA를 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후, 이 기술은 전혈에서 임상적으로 작용 가능한 돌연변이를 검출할 수 있는 길을 열었습니다. 그리고 우리는 순환 중에 과도하게 발현된 전사체를 검사하기 위해 이러한 방법을 확장했습니다.