Name: 히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 배우세요 히스톤 수정의 풍부함과 위치를 결정하는 크로마틴 면역침전법을 Saccharomyces cerevisiae에서. 이 방법은 유전자 발현 조절과 크로마틴 역학을 연구하는 연구자들에게 필수적인 도구를 제공합니다.

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저자는 유용한 토론에 대 한 녹색 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 NIH 교부 금 R03AG052018와 E.M.G.에 R01GM124342에 의해 부분적으로 지원

1. 미리 바인딩합니다 자성 구슬에 항 체
<ol>
	<li>단백질 A/G 자석 구슬을 잘 혼합 하 고 1.5 mL 튜브에의 한 immunoprecipitation (IP) 샘플 당 자석 구슬 20 µ L를 전송. 참고: pipetting 구슬, 넓은 구멍, 낮은 고정 팁 사용.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 구슬 가진 튜브를 놓고 구슬 튜브에 수집을 허용 합니다. 제거는 상쾌한.</li>
	<li>워시 3 번 감기 Tris 버퍼 염 분 (TBS) (50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl)의 1 mL와 구슬.</li>
	<li>구슬 및 항 체의 적절 한 금액에 TBS의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 8 rpm에 회전 참고: 많은 히스톤 PTM 항 체에 대 한 IP 당 항 체의 1-3 µ g은 충분 합니다. 그러나, 적정 실험은 적절 한 농도 결정 하기 위해 권장 됩니다. 잘 특징이, 상업 히스톤 PTM 항 체에 대 한 권장된 농도 정확 하 고 게시 된 보고서 또는 제품 문학에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 비즈를 놓고는 상쾌한을 제거 합니다. Tbs.의 1 mL와 함께 그들을 씻어합니다</li>
	<li>20 µ L IP 샘플 당 TBS의 플러스는 추가 5 µ L (pipetting 오류)의 경우 tbs.의 구슬 resuspend 참고: 구슬 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 단기 사용까지.</li>
</ol>
2. 성장 효 모 세포
<ol>
	<li>적절 한 긴장에의 한 식민지와 YPD (10% 효 모 추출 물, 펩 20% 및 20% 포도 당)의 10 mL를 접종 하 고 하룻밤 220 rpm에서 떨고 인큐베이터에서에서 30 ° C에서 그것을 성장.</li>
	<li>600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 효 모 문화는 분 광 광도 계를 사용 하 여. OD600 문화를 희석 100 ml YPD 새로운 플라스 크에서 0.2 =.</li>
	<li>중간 로그 단계를 도달할 때까지 220 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 세포를 성장 (OD600 = 0.6-0.8).</li>
</ol>
3. 생체 내에서 dna 단백질의 가교
<ol>
	<li>문화 중순 로그 단계에 도달, 1% 포름알데히드의 최종 농도 대 한 매체에 직접 37% 포름알데히드의 2.7 mL를 추가 합니다. 25 ° C (또는 상 온)에서 통에 플라스 크를 전송 하 고 15 분 동안 50 rpm에서 그것을 흔들어.</li>
	<li>매체에 2.5 M 글리신의 5 mL을 추가 하 고는 포름알데히드를 풀기 위해 5 분 동안 실 온에서 50 rpm에서 떨고 계속.</li>
	<li>병을 원심 회전 4 ° c.에서 5 분에 대 한 5800 x g에서 셀을 셀 전송 상쾌한을 가만히 따르다.
	<ol>
		<li>차가운 TBS의 45 ml에서 그들을 resuspending에 의해 세포를 세척 하 고 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브로 전송. 4 ° c.에 3 분 동안 2800 x g에서 튜브를 회전 제거는 상쾌한.</li>
		<li>세척 감기 10 mL에 세포 세포의 용 해 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 1% nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 4 ° C에서 저장 된) 칩.</li>
		<li>2800 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 스핀 제거는 상쾌한. 참고: 셀 액체 질소로 냉동 고 추가 처리까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 효 모 Lysates 확인
<ol>
	<li>1mm phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 찬 칩 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 효 모 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1:1,000 희석 셀 resuspend 유리 구슬의 200 µ L을 포함 하는 2.0 mL 스크류 캡 튜브에 정지를 전송.</li>
	<li>4 ° C에서 고속 교 반 장치를 치고 구슬 셀 전송 및 구슬 30 6 번 이길 각 s. 각 구슬 구타 사이 적어도 1 분 동안 얼음에 셀을 계속.</li>
	<li>젤 팁을 로드를 사용 하 여 1.5 mL 튜브에는 lysate 전송. 원심 lysate 15500 x g 4 ° c.에 20 분에서</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 펠 릿 MNase 소화 버퍼의 250 µ L에서 resuspend (10 mM Tris HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 m m MgCl2, 21 m m CaCl2, 1 %NP-40, 4 ° C에서 저장 된) 부드럽게 위아래로 pipetting으로.</li>
	<li>반응에 MNase의 2.5 µ L를 추가 합니다. 반전 하 여 그들을 부드럽게 혼합 4-6 시간 및 즉시 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 그것을 품 어. 참고: MNase의 새로운 주식을 사용 하는 경우 다이제스트 조건 최적화 되어야 합니다. 프로토콜에 대 한 10 단계를 참조 하십시오.</li>
	<li>즉시 반응을 중지 10 mM EDTA의 최종 농도 0.5 M EDTA의 5 µ L을 추가 하는 얼음에 튜브를 놓습니다. 반전에 의해 그들을 부드럽게 혼합.</li>
	<li>원심 15500 x g 4 ° C에서 15 분에 반응 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송. 참고: 수용 성 (소화) chromatin는 상쾌한에 있을 것입니다. 펠 릿에는 아무것도 소화 하 고 불용 성 세포 파편을 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) 히스톤 수정
<ol>
	<li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 각 MNase 출시 chromatin 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 8 일회용 큐 벳 플러스 테스트할 각 단백질 샘플 1 추가 베트의 각 하 Bradford 시의 1 mL를 추가 합니다.
	<ol>
		<li>2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>브래드 퍼 드 시 약의 1 mL에 BSA의 다음 농도 달성 하기 위해 적절 한 볼륨 추가: 0 μ g/mL, 0.5 μ g/mL, 1 μ g/mL, 2 μ g/mL, 4 μ g/mL, 6 μ g/mL, 8 μ g/mL와 10 μ g/mL. 추가 큐 벳을 MNase 출시 chromatin 분수의 2 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>Parafilm의 작은 조각으로 각 베트의 상단을 커버 하 고 반전 있는 큐 벳 4-6 회 솔루션을 잘 혼합. 15 분 동안 실 온에서 큐 벳을 품 어.</li>
		<li>595에서 흡 광도 측정 표시 광 분 광 광도 계를 사용 하 여 표준 곡선과 실험 샘플에 대 한 nm. 참고: 사용 하지 않고 BSA 베트 (0 μ g/mL) 빈 첫 번째 측정 이전 분 광 광도 계.</li>
		<li>BSA의 다른 농도 분 광 광도 계와 관련 된 소프트웨어 또는 스프레드시트 소프트웨어에 대 한 흡 광도 값을 사용 하 여 표준 곡선을 플롯. 표준 곡선 및 희석 요소 사용 (1: 500)에 따라 각각 chromatin 분수 샘플의 단백질 농도 계산 하 흡 광도 값을 사용 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>각 IP에 대 한 1 mL의 최종 볼륨을 도달 칩 세포의 용 해 버퍼 사용 MNase 출시 chromatin 분수에서 총 단백질의 50 µ g을 추가 합니다. 참고: lysate 당 하나 이상의 IP를 설정 하는 경우 만들은 lysate의 마스터 믹스와 칩, 세포의 용 해 버퍼 및 IP에 대 한 개별 튜브에 aliquot 1 mL.</li>
	<li>입력된 샘플으로 처리할 수 있는 IP 믹스에서 100 µ L을 제거 합니다. 7.1 단계까지-20 ° C에서 입력된 샘플을 동결. 참고: 모든 나머지 chromatin 샘플 수 있습니다-20 ° C에서 냉동 수 있으며 필요한 경우 후속 IP에 대 한 사용.</li>
	<li>미리 바인딩된 각 IP 샘플에 항 체로 자기 단백질 A/G 구슬의 20 µ L를 추가 합니다.</li></ol>3 h (표준)에 대 한 8 rpm에서 샘플을 회전 또는 (선호) 하는 경우 4 ° c.에 하룻밤

6. 워시 IPs 및 히스톤 DNA 복합 Elute
<ol>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 구슬 튜브 측에 수집 하자. 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다. 씻어 아래 버퍼의 각각의 1 mL와 연속적으로 구슬.
	<ol>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 8 rpm에 회전 하 고, 마그네틱 스탠드에 비즈를 배치 하 고, 상쾌한, 제거 하 고 다음 버퍼를 추가 하 여 각 세척을 수행: 2 x-칩 세포의 용 해 버퍼, 2 x-높은 소금 워시 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 500 m m NaCl, 1 mM EDTA 1 %NP-40, 4 ° C에 저장), 1 x-LiCl/세제 워시 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 250mm LiCl, 1 mM EDTA, 1 NP-40%, 1% 나트륨 deoxycholate, 4 ° C에 저장), 1 x-테 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 4 ° C에서 저장 된), 및 1 x-테.</li>
		<li>마지막 테 세척, 구슬 구슬의 대부분 다른 0.5 mL 튜브를 세척 하 고 나머지 구슬 전송 하 테의 전송 테의 0.5 mL를 사용 하 여 새로운 튜브를 전송할.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>갓 만든된 칩 차입 버퍼 (1 %SDS, 1mm NaHCO3)의 250 µ L를 추가 합니다. 짧게 솔루션 소용돌이입니다. 실 온에서 15 분 동안 8 rpm에서 샘플을 회전 합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 구슬 수집 합니다. 신중 하 게 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬 피하십시오. 참고:는 eluate immunoprecipitated 단백질 및 관련된 DNA를 포함 한다.</li>
	<li>구슬에 칩 차입 버퍼의 또 다른 250 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 15 분 동안 8 rpm에서 샘플을 회전 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 포함 하는 첫 번째 차입 튜브는 상쾌한 전송. 필요한 경우, 구슬 방해를 피하기 위해 모든 IPs에 대 한 작은 볼륨 (240 µ L)를 제거 합니다.</li>
</ol>
7. 역 단백질-DNA Crosslinks
<ol>
	<li>입력된 샘플을 해 동 하 고 각 입력에 칩 차입 버퍼의 400 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>모두 입력 및 IP 샘플, 반전 또는 튜브를 flicking 여 잘 5 M NaCl, 20 mg/mL glycogen의 5 µ L 및 가수분해 K. 믹스 20 mg/mL의 12.5 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 밤새 65 ° C 물 욕조에 샘플을 품 어.</li>
</ol>
8. 정화 하 고 DNA를 집중
<ol>
	<li>입력 및 IP 샘플 10 mg/mL RNase A의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C 물 욕조에 샘플을 품 어.</li>
	<li>수성 솔루션을 페 놀: chlorofrom:isoamyl 알코올 (25:24:1 PCI)의 600 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 그들을 회전 합니다.
	<ol>
		<li>새로운 튜브에 수성 층을 제거 합니다. PCI의 600 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 합니다. 새로운 튜브에 수성 층을 전송. 주의: 증기 두건 및 PCI 작업할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용 합니다. 기관 지침에 의해 지시 하는 대로 액체와 고체 폐기물을 처분.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.1 x 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트의 DNA를 침전 시키기 위하여 감기 100% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 반전 튜브 4-6 회 솔루션을 잘 혼합. 하룻밤-20 ° C에서 품 어.
	<ol>
		<li>4 ° c.에 20 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.</li>
		<li>차가운 70% 에탄올의 1 mL에 펠 릿을 세척. 4 ° c.에서 10 분 동안 15500 x g에서 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.</li>
		<li>약 20 분 (때까지 완전히 건조) 후드에서 펠 릿 건조 IP 샘플 nuclease 무료 물 50 µ L에서 resuspend 그리고 nuclease 무료 물 100 µ L 입력된 샘플을 resuspend. 정량 Pcr 수행까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 양이 많은 PCR (정량) 풍부한 게놈 지역 검색
<ol>
	<li>뇌관의 각 집합에 대 한 정량 마스터 믹스를 확인 합니다. 한 반응 2 x qPCR 믹스의 5 µ L, 20 µ M 앞으로 뇌관의 0.25 µ L 및 20 µ M 역 뇌관의 0.25 µ L를 포함 한다. 참고: 적절 한 뇌관 디자인 및 정량 실험을 위한 테스트 설명 다른14,,1516.</li>
	<li>각 DNA 샘플에 대 한 DNA 마스터 믹스를 확인 합니다. 한 반응 DNA의 0.5 µ L 및 nuclease 무료 물 4.0 µ L를 포함 한다.</li>
	<li>384 잘 정량 접시에 각 잘을 5.5 µ L의 적절 한 뇌관 마스터 믹스와 적절 한 DNA 마스터 믹스의 4.5 µ L를 추가 합니다. 참고: 각 음에 뇌관 믹스의 5.5 µ L를 추가 시작 합니다. 4.5 µ L의 DNA 혼합을 추가 하기 전에 실내 온도에 1 분 동안 200 x g에서 접시를 회전 합니다.</li>
	<li>접시와 상 온에서 1 분 동안 200 x g에서 스핀을 인감을 준수 합니다.</li>
	<li>정량 Pcr 실시간 정량 시스템을 사용 하 여 다음 조건 수행: 95 ° C 3 분;에 대 한 10 95 ° C의 40 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s; 녹는 곡선 65 ° C ~ 0.5 ° C 증가, 5와 95 ° C s.</li>
	<li>각 뇌관 쌍 계산는 정량에 사용 하는 5% 입력된 샘플을 기준으로 IP 샘플의 백분율 입력 합니다. 기술 PCR triplicates의 의미를 사용 하 여 계산을 수행 하. 참고: 경우 상당한 변이에서 관찰 PCR triplicates 마스터 믹스 구성, pipetting 오류 및 384-잘 접시에 우물 사이의 교차 오염에 주의와 정량 Pcr을 반복 하는 것이 좋습니다.<ol>
		<li>원시 Cq 값에서 희석 비율을 대표 하는 사이클의 수를 빼서 Cq 100%에 대 한 입력 값을 조정 합니다. 참고: 5% 입력 20-fold,는 4.32 사이클 (로그2 20 = 4.32)와의 희석 비율을 나타냅니다.</li>
		<li>%2로 입력 계산 ^ (Cq입력 -CqIP) 100을 곱한.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. (권장 하기 전에 첫 번째 전체 칩 실험) MNase 다이제스트 조건 결정
<ol>
	<li>2.1 이전 프로토콜의 4.4 통해 단계. 충분히 lysate chromatin 포함 된 펠 릿의 MNase 소화의 여러 샘플을 생성 하는 프로토콜을 확장. 4.4 단계에서 MNase 소화 버퍼의 1.25 mL에 산 탄을 resuspend. 5 샘플 튜브는 각 약 수 MNase 소화 버퍼에 resuspended chromatin 펠 릿의 250 µ L를 포함 합니다.</li>
	<li>0, 1.5, 2.5, 5 추가 각 튜브를 MNase의 µ L. 반전 하 여 그들을 부드럽게 혼합 4-6 시간 및 즉시 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.</li>
	<li>즉시 얼음에 튜브를 배치 하 고 10mm 최종 농도 0.5 M EDTA의 5 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li></ol>반전 하 여 솔루션을 부드럽게 혼합.
	<li>4 ° C에서 15 분 동안 15500 x g에서 튜브 원심 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송.</li>
	<li>1% 최종 농도 (10% 주식 솔루션의 25 µ L)와 NaHCO3 1.5 mL 튜브에 샘플을 0.1 m M 최종 농도 (1 M 재고 솔루션의 25 µ L)에 SDS을 추가 합니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 샘플 5 M NaCl, 5 µ L의 glycogen, 그리고 20 mg/mL 가수분해 K의 12.5 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 품 어 그들 65 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>10 mg/mL RNaseA의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>수성 해결책에 PCI의 300 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 회전 합니다.
	<ol>
		<li>새로운 튜브에 수성 층을 제거 합니다. PCI의 300 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 회전 합니다. 새로운 튜브에 수성 층을 전송.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.1 x 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트 (보통 ~ 30 µ L)의 DNA를 침전 시키기 위하여 감기 100% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 반전 튜브 4-6 회를 잘 섞어. 밤새-80 ° C 1 시간 또는-20 ° C에서 튜브를 품 어.
	<ol>
		<li>4 ° c.에 20 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.</li>
		<li>차가운 70% 에탄올의 1 mL에 펠 릿을 세척. 4 ° c.에서 10 분 동안 15500 x g에서 회전</li>
		<li>펠 릿 후드 약 20 분에서 (또는 때까지 완전히 건조) 건조 보자. Nuclease 무료 물 30 µ L에 산 탄을 resuspend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>염료를 로드 하는 DNA를 추가 하 고 2 %agarose 20 µ L을 실행 시각화 하 젤 소화 DNA.</li>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 절차는 immunoprecipitation에 의해 효 모 세포에 수정 된 히스톤과 관련 된 DNA의 효율적인 복구에 대 한 수 있습니다. 이것은 정량 Pcr 증폭 지역 농축 결정 관심 영역 또는 특정 히스톤 수정의 소모는 뇌관을 사용 하 여 옵니다. 개발 되 고 있는 방법으로 거의 20 년 전에 불구 하 칩 히스톤 수정 상태 다른 게놈 영역에 다양 한 조건 하에서 조사 정의 분석 결과 남아 있습니다. 칩 결합 차세대 시퀀싱 기술 게놈 넓은 규모6,7에 히스톤 수정 심문 수 있습니다, 비록 비용 및 필요한 데이터 분석이 방법의 일부 실험실 설정에 그들의 사용을 제한할 수 있습니다. 또한, 이러한 epigenomic 실험 종종 뒤에 칩 정량의 게놈 일부 loci에서 히스톤 수정 상태 관측 유효성을 검사 하 게 결합 됩니다. 물리적으로 히스톤 표시 (또는 다른 단백질) 게놈 내의 특정 위치에 연결 하 고 다른 환경...

히스톤의 동적 포스트 번역 상 수정 (PTM) 녹음 방송, 복제, DNA 수리1,2를 포함 하 여 많은 DNA 템플릿 프로세스에 대 한 주요 규제 메커니즘입니다. 풍부 하 고 이러한 프로세스와 부수적인 수정된 히스톤의 정확한 지 방화를 결정 하는 능력은 따라서 셀에 서로 다른 조건 하에서 그들의 규칙을 이해 중요 합니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)의 개발을 주로 dna, 단백질의 상호 작용의 생 화 확 적인 연구에서 특히 생체 외에서 방법 화학 crosslinkers를 사용 하 여 비롯 된 방법으로 평가 하는 필요와 결합 된 동적 자연 단백질 DNA 상호 작용에서 vivo에서 그리고 게놈3,,45의 특정 지역에서. 정량 PCR (정량) 및 시퀀싱 기술의 발전 또한 양적 비교와 전체 게놈, DNA 단백질 상호 작용에서 해 부를 위한 강력한 도구를 만드는 걸쳐 칩 실험을 수행 하는 기능을 확장 했다 여러 수준입니다.
현재, 칩은 연구 그룹 게놈의 chromatin 중재 규정에 관심이 필요한 메서드 수정된 히스톤과는 특정 genomic 소재 시 에 사이의 물리적 링크를 직접 심문 없습니다 유사한 방법으로 vivo. 다음 세대 시퀀싱 게놈6,7 통해 히스톤 수정 지도를 사용 하 여이 방법의 변이 사용할 수 있지만 이러한 접근 다른 과학적인 질문 및 그들의 규모, 비용을 해결할 수 있습니다. 그리고 기술 리소스 일부 연구 그룹에 대 한 제한 될 수 있습니다. 또한, 대상된 칩-정량은이 보완 하기 위해 필요한 접근 방법을 모두를 제공 하 여 epigenomic 데이터 집합에서 결과 유효성을 검사 하 고 시퀀싱 전에 칩 프로토콜 최적화. 그러나 질량 분석 기반 접근,8,,910,11, 등장 게놈 지역 연관 표시는 또한 히스톤의 완전 한 보완을 식별이 접근 제한이 몇 가지는 게놈의 지구를 탐색할 수 및 그들이 필요한 전문 기술 및 계측을 모든 연구 그룹을 사용할 수 없습니다. 따라서, 칩 풍부 및 히스톤 수정 epigenetics, chromatin의 게놈 기능 규정에 관심이 모든 연구 단체에 대 한 다양 한 조건에서의 배포를 분석 하는 기초 방법에 남아 있다.
여기, 신진 누 룩을 사용 하 여 칩 모델 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 히스톤 PTMs chromatin에서의 분포를 조사 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 다양 한 칩 프로토콜 누 룩 개발 하 고 다양 한 모델 시스템12,13에 적용의 핵심 구성 요소에 의존 합니다. 수정된 히스톤과 DNA는 셀에서 간의 상호 작용은 포름알데히드와 가교에 의해 유지 됩니다. Lysate 준비 다음 염색 질 조각은 micrococcal nuclease와 소화에 의해 균일 하 게 크기의 조각으로 solubilized는. Immunoprecipitation 수정된 히스톤의 상업적 또는 실험실에서 생성 된 항 체와 함께 수행 되 고 모든 관련된 DNA 분리 및 정량 (그림 1)를 사용 하 여 게놈 지역에서 농축에 대 한 분석. 많은 히스톤 수정에 대 한이 프로토콜에서 얻은 DNA의 양을 정량 하 여 25 개 이상의 다른 게놈 loci를 테스트 하기 위해 충분 하다.
이 칩 방법은 매우 다양 한 여러 개의 돌연변이 체 긴장 또는 환경 조건, 단일 히스톤 수정 배포 모니터링을 위한 또는 wildtype 세포 게놈 loci의 숫자에 여러 개의 히스톤 수정 테스트입니다. 또한, 프로토콜의 수많은 구성 요소 중 높은-또는 미 천 한-풍부한 히스톤 부호의 최적화를 쉽게 조정 가능 하다. 마지막으로, 싹 트는 효 모에 수정 된 히스톤의 칩을 수행 크게 다른 시스템에서 사용할 수 있는 항 체 특이성에 대 한 주요 컨트롤을 사용 하 여 기회를 제공 한다. 즉, 효 모 종자 수 수정에 대 한 타겟으로하는 히스톤 잔류물에서 점 돌연변이 생성 되 고, 어떤 경우에는 특정 히스톤 잔류물에 수정 catalyzes만 단일 효소 (예. 히스톤 lysine methyltransferases)입니다. 따라서, 칩 중 히스톤 돌연변이 또는 효소 삭제 긴장 시험의 범위는 비 특정 바인딩 항 체의 발생 그리고 거짓 긍정적인 결과 생성 하에서 수행할 수 있습니다. 이 컨트롤은 새로 개발 된 항 체에 특히 중요 하 고 심지어 다른 시스템에서 사용 하기 전에 보존된 히스톤 수정에 대 한 항 체 특이성을 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 보완 (예: 모노-디-, 트라이-메 틸), 다른 수정 상태 사이에서 구별 하는 항 체 특이성을 테스트 하려면 다른 방법 수정된 펩 티 드의 배열 조사 등 수행 하는 히스톤의 서쪽 오 점 또는 nucleosomes 정의 수정입니다. 전반적으로, 싹 트는 효 모에 칩 게놈 전체 PTMs 히스톤의 역학을 평가 하 고 그들의 규칙을 경 세 하는 메커니즘을 해 부에 대 한 강력한 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>효모 추출물</td><td>연구 제품 국제 (RPI)</td> <td>Y20025-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>연구 제품 국제 (RPI)</td> <td>P20250-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>ThermoScientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC12007-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoScientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>4-노닐페닐-폴리에틸렌 글리콜</td><td>시그마-알드리치</td><td>74385</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20899-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoScientific</td><td>AC413271000</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>Amresco</td><td>M107-1KG</td><td></td></tr><tr><td>데옥시콜산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>30970-100G</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>효모 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>VWR</td><td>10190-076</td><td></td></tr><tr><td>25 Phenol:24 클로로포름:1 이소아밀 알코올</td><td>VWR Life Science</td><td>97064-824</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가없는 물</td><td>VWR</td><td>100720-992</td><td></td></tr><tr><td>소코칼 뉴클레아제</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004797</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>ThermoScientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P50220-0.1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>R6513-50MG&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; Bradford 분석 시약</td><td>ThermoScientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; BSA 표준 2 mg/mL</td><td>ThermoScientific</td><td>23210</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; H4</td><td>EMD 밀리포어</td><td>04-858</td><td></td></tr><tr><td>&알파; H4K16ac</td><td>EMD 밀리포어</td><td>ABE532</td><td></td></tr><tr><td>&알파; H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; H3K4ME2</td><td>액티브 모티프</td><td>39142</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; High Rox qPCR 믹스</td><td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR 믹스</td><td>ACC-PR2000-L-1000</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A/G 자석 비즈</td><td>ThermoScientific</td><td>88803</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 튜브용 자기 스탠드</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-21359</td><td></td></tr><tr><td>산성 세척 유리 비즈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Microtube Homogenizer</td><td>Benchmark</td><td>D1030</td><td></td></tr><tr><td>씰링 링이 있는 2.0mL 나사 캡 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763837-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-288</td><td></td></tr><tr><td>큐벳</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-476-476</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>384-Well PCR 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-1384W</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Gyratory Floor Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model G10</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr></tbody></table>

히스톤 수정 saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin immunoprecipitation (칩)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Acetylation, 메 틸 화, 인 산화, 같은 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTMs), 동적으로 추가 하거나 셀에서 수신 하는 신호에 대 한 응답에서 이러한 마크를 제거 하는 효소에 의해 통제 된다. 이러한 PTMS 유전자 식 제어 등 프로세스의 규정을 주요 참여자 이며 DNA 복구. Chromatin immunoprecipitation (칩) 풍요로 움과 응답 셀에 다양 한 섭으로 게놈에 걸쳐 많은 히스톤 PTMs의 지역화 해 부를 위한 경 음악 접근 되었습니다. 여기, 싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 에서 post-translationally 수정된 히스톤의 칩을 수행 하기 위한 다양 한 방법을 설명 합니다. 이 방법은 단백질 및 효 모 문화의 포름알데히드 처리를 사용 하 여 DNA의 가교에 의존 구슬 치고, micrococcal nuclease에 의해 chromatin 파편의 가용 화 및 히스톤 DNA의 immunoprecipitation에 의해 효 모 lysates의 세대 단지입니다. DNA의 히스톤 마크와 관련 된 정화는 게놈에 걸쳐 여러 loci에서 그것의 농축을 평가 하기 위해 정량 PCR 분석에 복종 하 고. Wildtype에 돌연변이 효 모 히스톤 부호 H3K4me2와 H4K16ac의 지역화를 조사 하는 대표적인 실험 데이터 분석 및 해석 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 다양 한 히스톤 PTMs 적합 하며 다른 돌연변이 체 긴장 또는 그것에 게 다른 조건 하에서 chromatin 역학에서 변경 내용을 조사 하기 위한 훌륭한 도구를 만드는 다양 한 환경 스트레스의 존재를 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜의 한 핵심 구성 요소는 단계 10에서 설명한 녹는 조각으로는 염색 질을 소화 하는 데 사용 된 micrococcal nuclease (MNase)의 농도 최적화입니다. 이것은 관심의 게놈 영역에서 히스톤 수정 배포에 대 한 고해상도 데이터를 얻기 위해 중요입니다. MNase 적정 수용 성 염색 질 분수에 디 nucleosomes의 작은 금액으로 주로 모노 nucleosomes를 달성 하기 위해 가장 적합 한 농도 결정 하기 위해 수행 되어야 한다. 이 구상 될 수 있다 DNA를 추출 하 여 chromatin 포함 된 펠 릿의 MNase 소화와 수행 agarose 젤 전기 이동 법 (그림 2). 여기에 사용 되는 MNase의 준비에 20 단위 / µ L에서 효소의 2.5 µ L 주로 모노 nucleosomes 생산과 따라서이 금액 칩 사용 되었다.
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여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

이 염색질 면역 증식 프로토콜의 전반적인 목표는 발아 효모 게놈 전체에 걸쳐 정의된 영역에서 히스톤 변형의 풍부함과 국소화를 결정하는 것입니다. 이 방법은 히스톤 변형이 유전자 발현 제어와 어떻게 연결되는지, 이러한 변형이 다양한 환경 조건에 따라 어떻게 변화하는지와 같은 염색질 조절의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 한 번에 다양한 히스톤 변형과 여러 E 균주를 조사하는 데 사용할 수 있는 매우 다재다능한 프로토콜입니다.이 방법은 히스톤 변형에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 에피토프 태그 또는 사용 가능한 항체를 사용하여 다른 염색질 결합 단백질을 조사하는 데에도 적용할 수 있습니다. 효모 세포를 성장시켜 이 절차를 시작하고, 각 적절한 균주의 단일 콜로니로 10ml의 YPD 배지를 접종하고, 밤새 220rpm의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 30도로 성장시킵니다. 다음 날 배양물의 600나노미터 또는 OD600에서 광학 밀도를 측정한 후 새 플라스크에서 100mL의 YPD에 0.2의 OD600으로 배양물을 희석합니다.섭씨 30도의 진탕 인큐베이터에서 220rpm의 진탕 인큐베이터에서 중간 로그 단계에 도달할 때까지 세포를 성장시킵니다. 배양액이 중간 로그 단계에 도달하면 2.7ml의 37%포름알데히드를 각 플라스크의 배지에 직접 첨가하여 1%포름알데히드의 최종 농도를 얻습니다. 플라스크를 실온의 셰이커에 옮기고 50rpm으로 15분 동안 흔듭니다.배지에 5ml의 2.5몰 글리신을 첨가하고 실온에서 50rpm으로 5분 동안 계속 흔들어 포름알데히드를 냉각시킵니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세척합니다. 마지막 탈수 후 상등액을 제거하고 효모 용해물을 계속 만듭니다.1밀리리터의 저온 염색질 아미노 침전 또는 ChIP 용해 완충액에 1밀리몰 PMSF 및 1:1000 희석된 효모 프로테아제 억제제 칵테일로 세포를 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 200마이크로리터의 유리 구슬이 들어 있는 2.0ml 나사 캡 튜브로 옮깁니다. 세포를 비드 박동 장치로 옮겨 섭씨 4도에서 고속 교반을 수행합니다.30초 동안 구슬을 치고 1분 동안 얼음을 찢습니다. 총 6번의 비드 비트를 치고, 각 30초 비트 비트 사이에 최소 1분 동안 세포를 얼음 위에 유지합니다. 겔 로딩 팁을 사용하여 용해물을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.15, 20 분 동안 4 섭씨 온도에 500 g에 용해물을 원심 분리

chromatin-immunoprecipitation-chip-histone-modifications-from

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation (칩)가 신호 전달 경로에 의해 유도 전사 조절 염색질 템플릿 동적 변경을 연구하는 데 사용됩니다 방법을 설명합니다.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

마그나포테 오리자에서 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석

이 프로토콜은 신진 효모인 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 네이티브 염색질 맥락에서 관심 있는 단일 복제 유전자 자리를 정제하기 위해 부위 특이적 재조합을 기반으로 하는 유전자좌 특이적 염색질 분리 방법을 제시합니다.

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

배우세요 히스톤 수정의 풍부함과 위치를 결정하는 크로마틴 면역침전법을 Saccharomyces cerevisiae에서. 이 방법은 유전자 발현 조절과 크로마틴 역학을 연구하는 연구자들에게 필수적인 도구를 제공합니다.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

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