히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

이 염색질 면역 증식 프로토콜의 전반적인 목표는 발아 효모 게놈 전체에 걸쳐 정의된 영역에서 히스톤 변형의 풍부함과 국소화를 결정하는 것입니다. 이 방법은 히스톤 변형이 유전자 발현 제어와 어떻게 연결되는지, 이러한 변형이 다양한 환경 조건에 따라 어떻게 변화하는지와 같은 염색질 조절의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 한 번에 다양한 히스톤 변형과 여러 E 균주를 조사하는 데 사용할 수 있는 매우 다재다능한 프로토콜입니다.

이 방법은 히스톤 변형에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 에피토프 태그 또는 사용 가능한 항체를 사용하여 다른 염색질 결합 단백질을 조사하는 데에도 적용할 수 있습니다. 효모 세포를 성장시켜 이 절차를 시작하고, 각 적절한 균주의 단일 콜로니로 10ml의 YPD 배지를 접종하고, 밤새 220rpm의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 30도로 성장시킵니다. 다음 날 배양물의 600나노미터 또는 OD600에서 광학 밀도를 측정한 후 새 플라스크에서 100mL의 YPD에 0.2의 OD600으로 배양물을 희석합니다.

섭씨 30도의 진탕 인큐베이터에서 220rpm의 진탕 인큐베이터에서 중간 로그 단계에 도달할 때까지 세포를 성장시킵니다. 배양액이 중간 로그 단계에 도달하면 2.7ml의 37%포름알데히드를 각 플라스크의 배지에 직접 첨가하여 1%포름알데히드의 최종 농도를 얻습니다. 플라스크를 실온의 셰이커에 옮기고 50rpm으로 15분 동안 흔듭니다.

배지에 5ml의 2.5몰 글리신을 첨가하고 실온에서 50rpm으로 5분 동안 계속 흔들어 포름알데히드를 냉각시킵니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세척합니다. 마지막 탈수 후 상등액을 제거하고 효모 용해물을 계속 만듭니다.

1밀리리터의 저온 염색질 아미노 침전 또는 ChIP 용해 완충액에 1밀리몰 PMSF 및 1:1000 희석된 효모 프로테아제 억제제 칵테일로 세포를 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 200마이크로리터의 유리 구슬이 들어 있는 2.0ml 나사 캡 튜브로 옮깁니다. 세포를 비드 박동 장치로 옮겨 섭씨 4도에서 고속 교반을 수행합니다.

30초 동안 구슬을 치고 1분 동안 얼음을 찢습니다. 총 6번의 비드 비트를 치고, 각 30초 비트 비트 사이에 최소 1분 동안 세포를 얼음 위에 유지합니다. 겔 로딩 팁을 사용하여 용해물을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

15, 20 분 동안 4 섭씨 온도에 500 g에 용해물을 원심 분리하십시오. 상층액을 버리고 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 250마이크로리터의 소코코 뉴클레아제 분해 완충액에 다시 현탁시킵니다. 각 반응에 2.5마이크로리터의 소구균 뉴클레아제를 추가합니다.

4-6회 뒤집어서 부드럽게 섞은 후 즉시 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후 튜브를 얼음 위에 놓고 5ml의 0.5몰 EDTA를 첨가하여 최종 농도 10mm의 EDTA를 만들고 반전으로 부드럽게 혼합하여 반응을 중지합니다. 15, 500g에서 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리기.

그런 다음 각 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 가장 일관된 결과를 얻으려면 각 아미노 침전에서 동일한 농도의 단백질이 사용되도록 하는 것이 중요합니다. 아미노 침전 횟수 또는 IP 반응에 따라 각 소구균 뉴클레아제에서 방출된 염색질 분획 및 ChIP 용해 완충액의 마스터 믹스를 만들고 총 단백질 50마이크로그램을 함유한 1밀리리터를 개별 튜브에 할당합니다.

각 IP 믹스에서 100마이크로리터를 제거하여 입력 샘플로 처리합니다. 나중에 사용할 수 있도록 입력 샘플을 섭씨 20도에서 동결합니다. 또한 각 면역침전에 대해 항체에 결합된 동일한 양의 비드가 사용되는지 확인하는 것도 중요합니다.

와이드 보드 피펫 팁을 사용하여 각 IP 샘플에 항체가 사전 결합된 20마이크로리터의 자성 단백질 AG 비드를 추가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 8rpm으로 3시간 동안 회전시킵니다. IP가 완료되면 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 튜브 측면에 비드가 모이도록 합니다.

피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 비드에 ChIP 용해 완충액 1ml를 추가하고 섭씨 4도에서 8rpm으로 5분 동안 회전합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 상층액을 제거합니다.

이러한 방식으로 표시된 횟수 동안 다음 버퍼로 비드를 연속적으로 세척합니다. ChIP 용해 완충액, 고염 세척 완충액, LiCl/세제 세척 완충액 및 TE. 마지막 TE 세척으로 0.5ml의 TE를 사용하여 대부분의 비드를 새 튜브로 옮긴 다음 0.5ml의 TE를 사용하여 튜브를 세척하고 나머지 비드를 옮깁니다. 각 튜브에 갓 만든 ChIP 용출 완충액 250마이크로리터를 추가하고 용액을 짧게 와류로 만듭니다.

샘플을 실온에서 15분 동안 8rpm으로 회전시킵니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 상등액을 새 튜브로 조심스럽게 옮기고 비드를 피하십시오.

비드에 250마이크로리터의 ChIP 용리 완충액을 더 추가합니다. 샘플을 실온에서 15분 동안 8rpm으로 회전시킵니다. 조심스럽게 비드를 방해하지 않고 상층액을 첫 번째 용리액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.

이전에 수집된 입력 샘플을 해동하고 각 입력 샘플에 400마이크로리터의 ChIP 용리 완충액을 추가합니다. 단백질 DNA 가교 결합을 역전시키려면 튜브를 뒤집거나 튕겨서 20마이크로리터의 5몰 염화나트륨, 5마이크로리터의 글리코겐 및 12.5마이크로리터의 Proteinase K.Mix를 잘 추가합니다. 섭씨 65도의 수조에서 하룻밤 동안 샘플을 배양합니다.

이 절차를 시작하려면 적절한 부피의 QPCR 믹스, 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 결합하여 각 프라이머 세트에 대한 QPCR 마스터 믹스를 만듭니다. 한 반응에 0.5 마이크로리터의 DNA와 4.0 마이크로리터의 뉴클레아제 자유수가 포함된 각 DNA 샘플에 대해 DNA 마스터 믹스를 만듭니다.384 웰 QPCR 플레이트의 각 웰에 5.5 마이크로리터의 적절한 프라이머 마스터 믹스를 추가합니다. 200g에서 실온에서 1분간 접시를 돌립니다.

그런 다음 4.5마이크로리터의 적절한 DNA 마스터 믹스를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 200g에서 실온에서 1분간 돌립니다. 실시간 QPCR 시스템을 이용하여 3분 동안 95°C, 10초간 95°C의 40 사이클, 30초 동안 55°C의 용융 곡선, 65°C에서 95°C의 용융 곡선, 5초 동안 0.5°C씩 증가한다.

이 프로토콜의 핵심 구성 요소 중 하나는 염색질을 용해성 단편으로 소화하는 데 사용되는 마이크로코커스 뉴클레아제의 농도를 최적화하는 것입니다. 다양한 양의 소구균 뉴클레아제로 염색질 펠릿을 분해한 후 분리된 DNA의 아가로스 겔 전기영동에서 나온 이 예시 결과는 마이크로리터당 20단위에서 2.5마이크로리터의 효소가 주로 단뉴클레오솜을 생성했음을 보여줍니다. 이 대표적인 ChIP 실험은 야생형 및 set1 녹아웃 세포에서 히스톤 메틸 마커 H3K4me2 및 히스톤 H3에 대한 항체를 사용했습니다.

Set1 녹아웃 세포에는 표시를 촉매하는 메틸 전이효소가 부족합니다.막대는 표시된 낮은 sci에서 H3K4me2의 상대적 농축을 나타냅니다. 야생형 균주는 set1, PMA1 및 ERG11의 직접 표적으로 알려진 두 유전자의 5개 프라임 말단에서 H3K4me2에 대한 명확한 농축을 보인 반면, set1 녹아웃 세포에서는 신호가 관찰되지 않았습니다. 예상대로 TEL07L에서는 H3K4me2 마크의 농축이 없었고, SPR3의 발현도 set1에 의해 조절되는 것으로 보고되었으나, 이러한 결과는 PMA1 또는 ERG11과는 다른 메커니즘에 의해 조절이 발생할 가능성이 있음을 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 4일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 대조군으로 특이성에 사용되는 항체를 주의 깊게 테스트하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 사용 가능한 경우 QPCR에서 양극 및 음성 제어 영역을 모두 프로브해야 합니다.

이 절차에 따라 히스톤 변형의 분포에 의해 게놈을 결정하기 위해 GP 염기서열분석과 같은 다른 방법도 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 잘 통제된 실험을 통해 고유한 게놈 영역에서 다양한 히스톤 변형 수준을 일관되게 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.