Name: 사기 질 기관 이용과 환경에 노출 된 쥐의 악의 니에서의 마이크로 해 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 배우세요 쥐의 법랑질 기관을 미세 해부하여 아멜로블라스트 활동을 연구하는 방법을. 치아 상피를 세포 분화 단계별로 분리하여 면역조직화학 분석을 가능하게 합니다. 이 기법은 법랑질 병리 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품 Odontological 연구 (IFRO) 대학 파리 디드로, 프랑스 국립 건강 연구소 및 의료 연구 (INSERM), 그리고 프랑스 연구소에 의해 투자 되었다.

현재 연구에 사용 된 모든 동물 관리 및 농업 (A-75-06-12)의 프랑스 내각에서 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 유지 되었다.
1. 동물 유독 노출
<ol><li>이 프로토콜을 수행 하기 전에 필요한 기관 승인을 하 고 모든 동물 보호 지침을 준수 해야 합니다.</li>
	<li>Ameloblast 분 비 단계 및 ameloblast 성숙 단계에 조사 하는 molecule(s)의 영향을 테스트 하기 위해 다른 실험 그룹의 헌법을 수 있도록 연구 프로토콜의 디자인을 적용 합니다. 여기, 남성 Wistar 쥐의 4 개 그룹 불 (NaF) 조합에서 또는 하지 BPA (그림 1A)2에 그들의 노출에 따라 구성 되었다. 모든 동물 관찰 하 고 하루 65 (그림 1B)에 해 부 했다.</li>
</ol>2. Hemi-Mandibles 성인 쥐에서의 해 부
<ol><li>CO2 질, 선택적으로 시체의 나머지 부분에서 별도 머리를 잘린 다음으로 쥐를 안락사. CO2 전용된 상자16에서 5 분에 쥐를 노출 합니다.</li>
	<li>#11 메스를 사용 하 여 더 낮은 앞 니에 쉽게 접근할 낮은 입술에서 모든 피부를 제거 합니다.</li>
	<li>같은 메스와 약간의 압력 두 더 낮은 앞 니 사이 절 개 하 고는 mandible 두 개의 반쪽으로 분할 됩니다.</li>
	<li>턱, 분리를 메스로 일시적인 악의 공동 잘라내어 hemi mandible 정밀한 핀셋으로 잡고.</li>
	<li>메스와 주변 부드러운 조직 고 모든 근육, 힘 줄, 인 대는 뼈가 완전히 깨끗 한 때까지 스 크레이 퍼를 사용 하 여 제거.</li>
</ol>3. 니17,18 의 격리
<ol><li>신중 하 게 블레이드는 니의 주요 종 축에 평행 하 게 배치 하 여 뼈 떨어져 면도. 자 궁 경부 루프 근처 니 끝까지 니 (근 끝)의 끝 근처 뼈 능선에서 시작 합니다. 절 개 모션 원심 방향에 인접에서 진행 됩니다.</li>
	<li>에 게 첫 번째 컷 distally hemi mandible의 gonion를 제거 하 고 쉽게 자 궁 경부 루프 또는 ameloblasts ( 그림 2에서 레드 라인)의 분 비 단계 손상 없이 니 이륙 허가를 메스로 자 궁 경관 루프.</li>
	<li>어 금 니, 두 번째 아래 두 번째 컷을 확인 하 고 뼈와 고 니의 중간 표면 사이 메스를 삽입. 모든 기저 뼈를 들어올리면는 니 바깥쪽으로 회전 하 고에 나 멜을 피하기 위해 그것을 신중 하 게 벗어 기관 조직 손상 정밀한 핀셋을 사용 하 여.</li>
</ol>4. 마이크로-의 해 부 눈 렌즈 아래에 나 멜 기관
<ol><li>피 펫을 사용 하 여 니에 염 인산 염 버퍼 (PBS 1x)의 200 µ L을 드롭. 고급 핀셋으로 니 위로 향하도록 입술 표면 가져가 라. 메스는 무색 조직의 주황색 부분 사이 표시를 확인 합니다. 이 마크는 나중에 볼 (그림 2)는 기본 백색 반점에 해당 합니다.</li>
	<li>굴 삭 기 또는 해당 도구와 분 비 단계 (무색) ameloblasts, 그리고 성숙 단계 (오렌지) ameloblasts 대 니의 끝을 메스 마크에서에 해당 하는 꼭대기 끝을 메스 마크에서 세포 표면을 다쳤어요.</li>
	<li>이전 설명된19로 전환 단계로 해당 2 mm 조직을 제거 합니다. 사기 질 기관 절 개는 mesenchyme 하 여 오염을 방지 하는 동안에 고 니를 열지 마십시오.</li>
	<li>앞에서 설명한20로 니 (그림 2)의 꼭대기 부분에 바로 위치한 자 궁 경부 루프를 잘라.</li>
	<li>추가 조사 ( 재료의 표참조)에 대 한 10% 포 르 말린 또는 세포 솔루션에 그것을 수집 합니다.</li>
</ol>5. 추가 조사에 대 한 분리 된 사기 질 기관 직물의 수집
<ol><li>200 µ L PBS 1 X 버퍼는 니에 드롭.</li>
	<li>#11 메스 블레이드, 신중 하 게 분리, 버퍼에 점차적으로 치과 상피 세포 별도로 이전 메스 마크의 도움으로 각 단계에 대 한.</li>
	<li>셀 RNA 및 단백질 추출, 단백질 및 RNAs ( 재료의 표참조)의 적 출을 허용 하는 세포 해결책을 사용 하 여 조직을 넣어. 참고: 조직-굴 삭 기는 튜브에 하 고 다음 셀 균질 혼합물을 얻기까지 연 삭 하 여 고품질 RNAs를 준비 합니다. 혼합물은 앞에서 설명한2,,817제조업체의 절차에 따라 RNA 및 단백질 추출에 대 한 준비. 일반적으로, 약 5-10 µ g 총 RNAs 및 150 µ g 총 단백질 각 준비를 획득 했다.</li>
	<li>조직학 분석에 대 한 immunohistochemistry (IHC), 그리고 현장에서 교 잡 (ISH)는 2 h, 그 후에 PBS 1 X에서에서 4 ° C에서 저장소에 대 한 10% 포 르 말린에 셀 레이어를 넣어. 조직 수 포함할 수 왁 스/파라핀 또는 조직에 10 월 냉동된 섹션에 대 한.</li>
	<li>EMP 기사는 니 고급 핀셋으로 걸릴. 공기 (약간의 탈수)에 짧은 노출 후 하얀 점이 사기 질 강화 작용의 개시를 나타내는 니 입술의 가운데 부분 주위에 표시 됩니다. 이 백색 반점 / 해당 하는 전환-초기 성숙 단계의 ameloblasts, 그래서 그것을 사용 표시기로 EMPs21의 추출.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

변경 된 ameloblast 활동 또는 방해 ameloblast 확산, 차별화, 그리고 성숙 프로세스 리드 돌이킬 수 없는 사기 질 결함을, 차례로,에 나 멜 결함의 특성은 변경의 이해 도움이 될 수 있습니다. amelogenesis 중 ameloblast 활동입니다. 따라서, 고립 된 사기 질 기관에 학문은 사기 질 결점 든 그들의 근원, 환경 또는 유전을 선도 병 적인 이벤트를 명료 하 게 하는 결정.
이 기술은 원래 Hiller 그 외 여러분 에 의해 설명 하 고 17 와 로빈슨 외. 18에 나 멜 기관 분화의 각 단계에 특정 효과 입증 하는 데 사용 됩니다. 다음 EMP 기사19,,2425에...

많은 발달에 나 멜 결함 환경 유독 또는 부적 절 한 생활 스타일1,2,,34에서 발생할 수 있습니다. 이벤트 및 현재 설명한 절차를 사용 하 여 amelogenesis의 분자의 여러 유독 노출의 조기 표식으로 결과 나 멜 결함의 사용을 촉진 것입니다 그리고 건강의 역사를 다시 구성 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 때에 나 멜은 synthetized1,2주 기간 동안 각 환자. 에 나 멜 합성 ameloblast 활동5에 따라 네 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 단계 regroups 전조 세포 및 pre-ameloblast 확산. 두 번째 단계 동안 차별화 된 ameloblasts에 나 멜 매트릭스 단백질 (EMPs), 주로 amelogenin, enamelin 및 ameloblastin, 마지막에 나 멜의 두께 결정 하는 분 비. 따라서, EMP 합성의 중단에 나 멜의 정량적 결함 이끌어 낸다. 전체에 나 멜 두께의 증 착 후 성숙 단계는 시작 됩니다. 이 단계 동안, 인회석 crystallite 성장 폭과 두께에 최대 96% 무게에 의해 생물 학적 조직에 높은 강화 비율을 도달 하는 나 멜을 수 있습니다. 질적 성숙 단계 이어질 동안 발생 하는 방해 이벤트 결함 사기 질. 마지막으로, ameloblasts 설치류, 염색 라고도 후 성숙의 단계를 입력 하 고 돌이킬 수 없는, 돌이킬 수 없는 (있을 경우)에 나 멜 결함을 만드는 치아 분화 동안 apoptosis를 받 다, 따라서 결함의 잠재적인 회고전 기록 제공 ameloblast 고 강조입니다. 설치류, amelogenesis 그들 amelogenesis의 일반적인 과정을 공부 하기 적합 한 모델을 만드는 그들의 앞 니는 지속적으로 성장 하 고, 까다로움과 이벤트의 유사한 순서를 따른다. 따라서, amelogenesis의 중단에 나 멜 품질 및 수량, 방해 이벤트의 기간에 따라 변경 발생합니다. 그런 의미에서 다이옥신, 납, 그리고 내 분 비 방해 화학 물질 (EDCs) 비스 페 놀 A (BPA), genistein, vinclozolin, 등에 노출에 나 멜 hypomineralizations,12,3 생성 하기 위해 표시 되었습니다. ,6,,78. 비대칭 흰색 불투명 반점이 쥐 태아 기간 출생1후 첫 달 동안 낮은 복용량 BPA 복용량에 노출의 앞 니에 확인 되었다. 이 나 멜 결함 쥐, 그리고 인간 어 금 니 니 hypomineralization (MIH)의 그에 유사한 임상, 구조, 및 생 화 확 적인 특성을 공유합니다. MIH는 최근 설명된 치과 나 멜 병 병 인 아직도 남아 있는 많은 인과 요인에도 불구 하 고 불분명9,10 에9,10,11 가상 데 ,12.
환경 요인으로 인해 또 다른 중요 한에 나 멜 hypomineralization 병리학은 치과 fluorosis (DF), 과도 한 불 소 흡수의 결과 이다 (> 0.1 m g/k g/일)13,14. 불 소의 주요 소스는 식 수를 보충 하거나 자연스럽 게 불 소 강화입니다. 불 소는 또한 종종 치과 카 리에 스를 방지 하기 위해 처방 이지만 예방 복용량만 50% 보다 낮은 독성 하나 (0.05 mg/kg/day). MIH와 DF, 환경 요인에 노출에서 결과로 두 자주 pathologies EDCs2 등 다른 유독 함께 하는 불 소의 hypomineralizing 효과의 potentiation 인해 특성화 하는 데 필요한 공통 기능을 제공할 수 있습니다. 또는 amoxicillin15.
쥐 사기 질 기관의 ameloblasts 다른 분화 단계에서 포함 된 마이크로 해 부는 ameloblast 활동을 방해 하 고에 나 멜 치아 분화 후 진단 결함을 일으킬 수 있는 분자의 행동의 메커니즘을 이해 하는 데 도움이 됩니다. 즉,에 나 멜 진 식과에 나 멜 매트릭스 구성 환경 유독 때문의 변화 특성에 유독, 노출의 역사의 재구성 있으며 공개에 대 한 환경 안전 모니터링을 용이 하 게 건강입니다.

<table><tbody><tr><td>비스페놀 A</td><td>시그마 알드리치, 세인트루이스 미주리</td><td>239658</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 10%</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>트라이 시약</td><td>Euromedex, 프랑스</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>RLT 버퍼</td><td>Qiagen, Les Ulis, France</td><td>74126</td><td>RNeasy Protect Mini Kit</td></tr><tr><td>Androgen receptor 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)</td><td>sc-816</td><td>토끼 다클론 항체</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>EUOMEDEX</td><td>ET330. 불</td><td></td></tr><tr><td>화나트륨 (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>S-1504</td><td></td></tr><tr><td>파라플라스트 레귤러</td><td>라이카 마이크로시스템, 낭테르 세덱스,&nbsp; France</td><td>39601006</td><td>텍스트 조직에서 was/parafin이라고 함</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, France</td><td>411243</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 핸들 - 12.5 cm</td><td>PHYMEP, Paris, France</td><td>10035-12</td><td></td></tr><tr><td>곡선 메스 블레이드</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>해부 나이프 - 세밀한/직선 팁</td><td>PHYMEP, 파리, 프랑스</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>원형 나이프</td><td>PHYMEP, 파리, 프랑스</td><td>10059-15</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 n&deg; 11 Swann-Morton</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, France</td><td>233-0024</td><td></td></tr><tr><td>쌍안경</td><td>Leica biosystems, Nanterre cedex,&nbsp; 프랑스</td><td>MZFLIII</td><td></td></tr></tbody></table>

사기 질 기관 이용과 환경에 노출 된 쥐의 악의 니에서의 마이크로 해 부

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

환경 상태와 생활의 방법에서 발생 하는 나 멜 결함은 그들의 높은 보급 때문에 공중 보건 우려. 이러한 결함 세포 라는 ameloblasts, 사기 질 기관에에 나 멜 합성에 대 한 책임의 변경 된 활동에서 발생할. Amelogenesis, 동안 ameloblasts 확산, 차별화, 그리고 죽음의 이벤트의 구체적이 고 정확한 시퀀스를 따릅니다. 지속적으로 성장 하는 앞 니 쥐 생리 및 병 적인 조건에 ameloblast 활동 및 분화 단계를 공부 하 적당 한 실험 모델입니다. 여기, 마이크로 해 부 이용과 환경에 노출 된 쥐의 사기 질 기관에 안정적이 고 일관 된 방법을 설명 합니다. 마이크로 해 부 치과 epithelia 포함 분 비 및 성숙 단계 ameloblasts 질적 실험 immunohistochemistry 분석 등 현장에서 교 잡, 뿐만 아니라와 같은 정량 분석에 대 한 사용할 수 있는 실시간 정량 Pcr, RNA-seq, 그리고 서 부 럽.

많은 치과 fluorosis12,13, 과도 한 불 소 흡수 때문 환경 조건에서 발생할 수 있습니다 또는 사기 질 hypomineralization와 유사한 MIH 일부 EDCs1, 에 노출 때문에 결함에 나 멜 7,22. 이러한 발달에 나 멜 결함 쥐 (그림 1)1,2,7,,23<sup class="x...

에 나 멜 형성과 가능한 변경 이해 ameloblast 활동의 연구가 필요 합니다. 여기, 마이크로 해 부 분 비 및 성숙 단계 ameloblasts 추가 양적 및 질적 실험 절차에 대 한 사용할 수 있는 포함 하는 나 멜 장기 하는 안정적이 고 일관 된 방법을 설명 합니다.

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 법랑질 기관을 미세 해부하고 법랑질 합성 중 세포 분화의 주요 단계에 따라 치아 상피를 분리하는 것입니다. 이 방법은 치아 불소증, 어금니 앞니 과법나멜화 및 유전 법랑질 발생 부전과 같은 법랑질 병리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사전 치료 없이 면역조직화학과 같은 정량적 실험을 사용하여 치아 세포를 추가로 분석할 수 있는 능력뿐만 아니라 이 방법이 혈발생을 방해할 수 있는 내인성 및 외인성 분자의 분자 역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있음과 같은 결과적인 조사를 통해 치아 세포를 추가로 분석할 수 있다는 것입니다.실험용 쥐를 안락사시킨 후, 아래 앞니에 쉽게 접근할 수 있도록 11번 메스를 사용하여 아랫입술의 피부를 모두 제거합니다. 그런 다음 같은 메스로 두 개의 아래 앞니 사이를 절개합니다. 가벼운 압력을 가하면 하악골이 두 부분으로 나뉩니다.다음으로, 메스로 측두-하악 관절을 잘라 턱을 분리하고 미세한 핀셋으로 반악골을 잡습니다. 그런 다음 메스로 주변 연조직을 자르고 뼈가 완전히 깨끗해질 때까지 스크레이퍼를 사용하여 모든 근육, 힘줄 및 인대를 제거합니다. 앞니를 분리하려면 칼날을 앞니의 주요 세로 축과 평행하게 배치하여 뼈를 조심스럽게 면도합니다.앞니 끝 근처의 뼈 융기에서 면도를 시작하고 경추 고리 근처의 앞니의 다른 쪽 끝으로 작업합니다. 다음으로, 메스로 경추 루프 원위부를 절개하여 반하악의 귀니를 제거함으로써 경추 루프나 ameloblasts의 분비 단계를 손상시키지 않고 앞니를 쉽게 제거할 수 있습니다. 다음으로 두 번째 어금니 아래를 두 번째로 절개하고 뼈와 앞니의 내측 표면 사이에 메스를 삽입합니다.기저골을 모두 들어 올리면 앞니를 바깥쪽으로 돌리고 법랑질 장기 조직이 손상되지 않도록 가는 핀셋을 사용하여 조심스럽게 제거합니다. 이제 앞니 전체가 분리되었습니다. 박리를 위해 60mm 접시나 접시에 200마이크로리터의 PBS로 앞니를 덮습니다.시작하려면 앞서 설명한 대로 앞니의 정점 부분 바로 옆에 위치한 경추 고리를 자릅니다. 그런 다음 순순 표면을 위로 향하게 하여 가는 핀셋으로 앞니를 잡고 조직의 무색 부분 끝에 메스 표시를 합니다. 이 표시는 나중에 관찰할 수 있는 아래에 있는 흰색 반점에 해당합니다.이제 굴착기 또는 이와 동등한 도구를 사용하여 표시에서 무색 분비 단계 ameloblast에 해당하는

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

지속적으로 성장 마우스 앞니는 치아 상피 줄기 세포 (DESCs)에서 치아 조직의 재생을 연구하기위한 모델을 제공합니다. 일관되고 안정적으로 앞니에서 이러한 세포를 획득하고 체외에서 그 확장을위한 강력한 시스템은 여기에보고됩니다.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

여기서, 우리는 마우스에서 국소치성 치주염을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 마우스의 치아에 구멍을 뚫고 국소 염증을 유발하기 위해 펄프를 노출시키는 방법을 보여줍니다. 마이크로 CT 및 조직학과 같은 이 염증의 본질을 조사하는 분석 방법도 입증됩니다.

마우스에 있는 정점 치주염 유도

Trowell 형 장기 배양 방법은 치아 발달을 제어하는 복잡한 신호 네트워크를 밝히고 최근에는 지속적으로 성장하는 마우스 앞니의 줄기 세포와 관련된 조절을 연구하는 데 사용되었습니다. 형광 리포터 동물 모델과 라이브 이미징 방법은 치과 줄기 세포와 특정 틈새 미세 환경에 대한 심층 분석을 용이하게합니다.

치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용

현재 프로토콜은 지속적으로 성장하는 마우스 절개, 마우스 어금니 및 인간 치아로부터 단세포 RNA-seq 분석에 적합한 단일 세포를 격리하는 빠르고 효율적이며 부드러운 방법을 제시합니다.

마우스와 인간의 치아에서 단일 세포의 신속한 격리

마우스 앞니는 줄기 세포 틈새에 귀중한 표지 유지 세포를 포함합니다. 우리는 라벨 유지 세포를 편견 없이 검출하고 정량화하는 새로운 방법을 가지고 있습니다. 우리의 연구는 하악의 PEGASOS 조직 제거 후 EdU 라벨링과 3D 재구성 접근법을 사용했습니다.

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

생체 외 라이브 이미징은 생체 조직에서 세포 움직임과 상호 작용의 동적 과정을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. 여기에서는 배양된 전체 성체 마우스 앞니에서 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하기 위해 이광자 현미경을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.

Ex vivo Live Imaging을 사용하여 마우스 치아 재생 중 세포 분열 및 움직임 조사

미세경도는 기계적 특성이며 경질 조직 병태생리학을 평가하기 위한 정보 매개변수입니다. 여기에서는 설치류 구강 질환 모델에서 치아 및 치조골의 미세 경도 분석, 즉 치아 불소증 및 인자 유도 치주 골 흡수를 위한 표준화된 프로토콜(샘플 준비, 연마, 평평한 표면 및 압흔 부위)을 보여줍니다.

설치류 구강 질환 모델에서 치아 및 폐포골에 대한 미세 경도 측정

이 프로토콜의 목표는 다양한 분자 크기의 형광 표지된 덱스트스트란을 생 체 내 치은염 표면에 국소적으로 도포한 후, 단일 광자 현미경 시스템을 이용한 체외 영상을 통해 쥐 치은상피 장벽의 무결성을 정량적으로 평가하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다.

형광 추적체를 이용한 마우스 치은성 상피 장벽의 기능 평가

실험 동물 연구는 임상 이식 실습의 발전에 중추적인 역할을 합니다. 돼지 정소성 간 이식 모델(OLTx)은 인간의 상태와 매우 유사하며 임상 지향적인 연구에 자주 사용됩니다. 다음 프로토콜에는 활성 porto-caval-jugular 션트를 사용하는 신뢰할 수 있는 돼지 OLTx 모델에 대한 모든 정보가 포함되어 있습니다.

활성 포르토 대정맥 션트를 사용하여 돼지 간 조달 및 동소 이식 이식의 기술

이 기사에서는 다양한 심박수에서 압력/부피 분석을 통해 쥐의 좌심실 기능을 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

Bowditch 효과 조사 : 압력 볼륨 관계를 측정하기 위해 마우스의 심장 도관

배우세요 쥐의 법랑질 기관을 미세 해부하여 아멜로블라스트 활동을 연구하는 방법을. 치아 상피를 세포 분화 단계별로 분리하여 면역조직화학 분석을 가능하게 합니다. 이 기법은 법랑질 병리 연구에 필수적인 도구입니다.

사기 질 기관 이용과 환경에 노출 된 쥐의 악의 니에서의 마이크로 해 부

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