가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

이 절차의 전반적인 목표는 헌팅턴병 모델 시스템에서 단백질 항상성 분석을 위해 헌팅틴 단백질 플럭스의 시각화, 특성화 및 정량화에 유용한 도구를 설명하는 것입니다. 이 방법은 단백질 항상성 및 신경퇴행성 질환 분야의 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 특정 치료 개입이 질병 발병에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조사자가 정량 분석을 위해 불용성 단백질 종을 분리하고 분해할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 헌팅턴병 발병 기전 중 생화학적 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 다른 단백질 잘못 접힘 질환에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 각 샘플에 대해 두 세트의 튜브를 용해성 및 불용성으로 표시합니다. 용해성 튜브에서 시료를 용해하기 직전에 적절한 양의 억제제를 첨가하여 용해 완충액을 준비합니다.

다음으로, 프로테아제 억제제가 보충된 얼음 냉간 가공 용해성 용해 완충액을 조직에 추가합니다. 쥐의 뇌 조직의 경우 1ml 유리 douncer에서 천천히 30회 두드립니다. 기포가 형성되어 불완전한 균질화가 발생할 수 있으므로 액체 표면이 깨지지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 얼음 위의 불용성 라벨이 붙은 튜브에 피펫으로 넣습니다. 세포주의 경우, 세포를 각 6-웰 플레이트에서 5번째 세포까지 5배 10으로 도태하고 거의 포화도에 가깝게 성장시켰습니다. 그런 다음 차가운 1X PBS로 세포를 한 번 헹구고 제거합니다.

그런 다음 세포에 최소한의 용해 완충액을 바르고 세포 스크레이퍼로 들어 올립니다. 다음으로, 균질액 또는 세포 용해물을 표지된 불용성 튜브로 옮기고 얼음에서 1시간 동안 용해합니다. 세포 용해물의 경우, 배양을 시작하기 전에 세포 덩어리를 분해하고 기포가 형성되지 않도록 여러 번 분쇄합니다.

각 샘플을 용해 중간에 1초 동안 간단히 펄스 소용돌이. 그 후, 섭씨 4도에서 15, 000 x g에서 20 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오. 그런 다음 상층액을 제거합니다.

펠릿이나 흐린 층을 방해하지 않도록 주의하면 분획이 오염됩니다. 상등액을 용해성 분획으로 피펫으로 용해성 표지된 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 용해성 및 불용성 용해 완충액을 추적하는 것이 중요합니다.

완충액을 전환하거나 불용성 완충액 또는 샘플을 얼음 위에 놓는 것은 프로토콜의 결과에 해로울 수 있습니다. 500마이크로리터의 용해 완충액과 원심분리기로 펠릿을 섭씨 4도에서 15, 000 x g에서 5분 동안 세척합니다. 세탁을 한 번 더 반복합니다.

그런 다음 조직 펠릿만 남기고 남아 있는 모든 세척 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 4% SDS가 보충된 용해 완충액으로 펠릿을 재현탁합니다. 프로브 초음파 처리기를 사용하여 실온에서 30초 동안 각 샘플을 초음파 처리합니다.

오랜 시간 동안 작은 볼륨을 초음파 처리하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 이 단계를 완료하는 동안 유화 또는 분무로 인해 샘플이 손실되지 않도록 주의하십시오. 그 후, 샘플을 30분 동안 끓입니다.

그런 다음 6, 000 x g에서 잠시 원심분리합니다. 그런 다음 세제 호환 단백질 분석 또는 Lowry 단백질 분석을 수행하여 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음 샘플을 50마이크로리터 배치로 분취하여 동결/해동 문제를 방지합니다.

이 단계에서는 로딩 버퍼에서 30마이크로그램의 샘플을 1:1의 비율로 희석하여 웨스턴 블롯을 수행합니다. 5 분 동안 표본을 끓이고 6, 000의 x g에 짧게 그(것)들을 원심분리하십시오. 다음으로, SDS 페이지와 웨스턴 블롯을 기준으로 분획을 분석합니다.

단백질 로딩 효율을 시각화하기 위해 전체 단백질 염색으로 멤브레인을 염색합니다. 다음은 각각 4-12% Bis-Tris 및 3-8% Tris-Acetate 페이지 겔에서 분해된 HEK 293T 세포 용해물의 용해성 및 불용성 분획입니다. GAPDH 로딩 제어로 정규화된 가용성 분획은 프로테아제 억제제 MG132에 대한 노출에 따라 돌연변이 huntingtin exon 1 용해성 단량체의 변동을 보여줍니다.

불용성 분획은 돌연변이 huntingtin의 고분자량 축적 종도 MG132 처리에 의해 조절됨을 보여줍니다. 다음은 웨스턴 블롯 및 필터 지연 분석을 사용한 HeLA 세포 용해물의 용해성 및 불용성 분획 샘플입니다. 데이터에 따르면 과발현된 SUMO 동형의 존재는 불용성 분획물에서 고분자량 돌연변이와 섬유질 불용성 돌연변이 huntingtin을 모두 증가시킵니다.

이 그림은 97Q huntingtin 엑손 1을 발현하는 HeLa 세포의 불용성 분획에서 잠재적인 치료제를 조절한 후 고분자량 돌연변이 huntingtin 축적의 조절을 보여줍니다. 치료 표적 PIAS1은 PIAS1을 향한 siRNA로 침묵시키거나 과발현했습니다. PIAS1에 대해 microRNA로 처리되고 3-8%Tris-Acetate 페이지 겔에서 분해된 마우스 선조체의 불용성 분획은 고분자량 불용성 헌팅틴의 조절을 보여줍니다.

NEM으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 프로토콜을 수행하는 동안 항상 안면 마스크 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 일단 마스터하면 용해물에서 분획 종료까지 이 기술을 샘플 수에 따라 약 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다. 단백질 정량화와 부분 표본 분석을 위해 한 시간을 더 할애해야 합니다.

이 절차에 따라, 용해성 올리고머 또는 불용성 섬유를 각각 검출하기 위해 아가로즈 젤 전기영동 또는 필터 지연과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 정량 분석을 위해 불용성 잘못 접힌 단백질을 분리하고 해결하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.