Name: 가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 학습하세요 Huntingtin 단백질의 가용성과 불용성 분획화 방법을 통해 신경퇴행성 질환에서 단백질 항상성을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 치료 개입 효과 평가에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH (RO1-NS090390)에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 박사 조 안 Steffanfor 기술 지원 및이 분석 결과의 개발 하는 동안 토론을 감사 하 고 싶습니다.

동물 윤리 문-실험 실시 했다 관심과 건강의 국가 학회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (에 의해 승인 된 동물 연구 프로토콜의 사용의 실험실 동물에 대 한 가이드와 함께 따라 IACUC), 어바인가 주 대학에는 AAALAC 공인 기관. 모든 노력 동물 고통 최소화 되었다.
1입니다. 세포의 용 해 버퍼의 준비
<ol><li>세포의 용 해 버퍼 "수용 성" 준비 (10 mM Tris pH 7.4, 1% 트리톤 X 100, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤)와 0.22 μ m 필터를 통해 살 균 필터.<ol>
<li>작업 "수용 성" 세포의 용 해 버퍼, N-Ethylmaleimide (NEM)를 측정 하 고 철저 하 게 100mm phenylmethysulfonyl flouride (PMSF)에 100% 녹아 분해 EtOH. 참고: 세포의 용 해 버퍼 억제제: (i) 20 m m N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 밀리미터 PMSF; (iii) 1 m m 나트륨 orthovanadate (나3보4); (iv) 1 µ g/mL leupeptin; (v) 1 µ g/mL aprotinin; (vi) 20 m m 나트륨 불 화물 (NaF). 주의: 프로토콜에 걸쳐 NEM 작업할 때 얼굴에 마스크를 착용 하십시오. 세포의 용 해 버퍼 작업 해야 할 활성 저 해제 되도록 신선한.</li>
		<li>다음과 같은 순서로 protease 억제제와 수용 성 세포의 용 해 버퍼를 추가 억제제: 나트륨 불 화물 (NaF), 찬 세포의 용 해 버퍼, 나트륨 orthovanadate (나3보4), Aprotinin와 Leupeptin 볼륨까지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"불용 성" 세포의 용 해 버퍼에 대 한 "성" 세포의 용 해 버퍼의 2 개 mL를 20 %SDS 500 µ L을 추가 하 여 4 %SDS 보충. 실 온에 둡니다. 참고: SDS 4 ° C에서 보관 하는 때 밖으로 침전 한다 이 온도 실 온에서 보관 하십시오. 최종 세포의 용 해 버퍼 구성: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% 트라이 톤 X-100. 150 mM NaCl; 10% 글리세롤; 4 %SDS (불용 성만)</li>
</ol>2. 수용 성/불용 성 분류 프로토콜
참고: 회로도 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.
<ol><li>각 샘플에 대 한 튜브의 두 세트를 라벨: "성"과 "불용 성"</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 작업 성 세포의 용 해 버퍼 protease 억제제 (1.1.1 참조) 조직에 보충의 X-µ L를 추가 합니다. 참고: X = 볼륨에 따라 조직 금액; 표 1을 참조 하십시오.</li>
	<li>마우스 뇌 조직 (즉,가)에 대 한 dounce 유리 1 mL douncer에 "불용 성"에 피펫으로 천천히 30 번 표시 튜브 (얼음에 계속). 참고: 조심 하지 거품 양식을 것입니다 하 고 불완전 한 균질을 얻을 수 있습니다 douncing, 시작 후 액체의 표면에 휴식 한다.</li>
	<li>셀 (즉, 헬러, HEK293T), 한 번 감기, 1 x PBS로 세포를 씻어. PBS를 제거 하 고 세포 세포의 용 해 버퍼의 최소 볼륨 적용할 셀 스 크레이 퍼와 리프트. 참고: 셀 라인, 위에 셀 했다 6 잘 플레이트 당 5 x 105 셀에 도금 및 confluency의 가까이에 성장. 하나는 잘 비교 마우스가 사용 된 볼륨입니다.</li>
	<li>전송 homogenate 또는 세포 lysate에 레이블이 "불용 성" 튜브와 얼음 1 시간 (시작 시간 마지막 관 처리 후)에 lyse. 참고: 세포 lysates 위해 헤어 셀 덩어리 부 화를 시작 하기 전에 여러 번 triturate. 거품의 형성을 하지 마십시오. 짧게 소용돌이 펄스 1 각 샘플 lysing 반쯤 s.</li>
	<li>샘플 20 분 15000 x g에서 4 ° C에서 원심</li>
	<li>"성" 분수 상쾌한을 복구 합니다.<ol>
<li>피펫으로와 제거,이 분수 오염으로 펠 릿/흐림 레이어를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. "성"에 피펫으로 녹는 분수 표시 관. 얼음에 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 세척; 후 5 분 동안 15000 x g에서 4 ° C에서 500 µ L의 세포의 용 해 버퍼 (x2) 및 원심 분리기로 펠 릿을 세척 그것은 흐린 레이어 중 일부에서 pipetted는 경우 괜 찮 아 요입니다.</li>
	<li>최종 세척 후 조직 펠 릿만을 떠나 모든 나머지 워시 버퍼를 제거 합니다. 참고:이 시점에서 불용 성 샘플 지금 지켜져야 한다 실내 온도에.</li>
	<li>X-µ L 세포의 용 해 버퍼 4 %SDS 보충 resuspend 펠 릿 (볼륨 펠 릿 크기에 따라 조정할 수 있습니다; 표 1참조).</li>
	<li>30 각 샘플을 sonicate 프로브 sonicator 실내 온도에서 s (125 와트, 20 kHz 펄스, 진폭 40%, 재료의 표참조).</li>
	<li>30 분;에 대 한 샘플 (압 연 종)를 삶아 짧게 원심 (15 s) 어떤 샘플을 잃지으로 6000 x g에서.</li>
	<li>DC (세제 호환) 단백질 분석 실험을 수행 ( 재료의 표참조) 또는 (샘플 세포 배양에 대 한 각각의 세포의 용 해 버퍼의 1/5 및 1/10 조직 lysates의 시작된 희석 권장) 단백질 농도 측정에 Lowry 단백질 분석 결과. 참고: 단백질 농도 높은 세제 농도 때문 DC 또는 리 분석 결과 사용 하 여 읽을 해야 합니다.</li>
	<li>Aliquot 샘플을 동결-해 동 문제를 피하기 위해 50 µ L 배치로. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 추가 생 화 확 적인 분석 이전 두 분수-20 ° c.에 저장 하 여</li>
</ol>3. 서쪽 오 점 및 정량화
<ol><li>수행 보고 서쪽 오 점 다른1,13 30 µ g의 샘플 버퍼 (염료, 감소 x 1 로드 x 1.6) 로드에 1:1 희석 합니다. 참고: 분수 당 단백질의 30 µ g 충분 하지만 최적 해상도 대 한 조정 될 수 있다. 3-8% 트리 아세테이트 폴 리 아크릴 아 미드 젤은 불용 성 부분을 위해 사용 되어야 한다. 4-12% 두번째-트리 스 젤은 수용 성 부분을 위해 권장 됩니다.</li>
	<li>짧게 5 분 원심 분리기에 대 한 샘플 (압 연 종)을 종 기 (15 s) 6000 x g 샘플 수집에서.</li>
	<li>감소 된 샘플에 대 한 제조 업체의 프로토콜에 따라 분수 SDS 페이지와 서쪽 오 점 분석. 참고: 불용 성 분수 0.45 μ M 니트로 막에 전송 하는 경우 가장 좋은 해결 합니다. 관심사의 단백질의 크기에 따라 수용 성 부분을 위해 0.45 또는 0.2 µ M 니트로 사용할 수 있습니다. 일부 최적화 HMW 재료의 최고의 전송 하기 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>단백질 효율 로드를 시각화 하기 위해 전체 단백질 얼룩 (예를 들어, MEMcode, 참조 테이블의 재료)와 막 얼룩. 참고: 서쪽 오 점 평균 픽셀 강도 의해 분석할 수 있습니다. 녹는 분수 실험 시스템에 적합 한 최고의 집 유지 단백질에 정규화 될 수 있습니다. 상대 단백질 풍부도 불용 성 분수 가역 단백질 얼룩 또는 별도 오 점에 히스톤 3 정규화 하 여 확인 했습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
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<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

일관 되 고 양적 결과 보장 하기 위해 위의 프로토콜에 대 한 몇 가지 예방 조치 필요 합니다. 첫째, 두 분수에서 mHTT 저절로 형성 집계 여러 동결 해 동 주기, 시 시간이 지남에 특히 높은 농도에. 그것은 따라서 단백질 preps의 aliquots 고정만 위의 프로토콜에 설명 된 대로 시험을 실행 하기 전에 필요한 볼륨을 해 동 하는 중요 한. 또한, 불용 성 분수 녹고 시 흰색 비례적 수율, 경우 재구성 추가 5 s 쥡니다 펄스, 5 분 종, 및 생 화 확 적인 분석 실험을 통해 분석 전에 다시 정량 필요할 수 있습니다.
이 분석 결과 대 한 양적 해상도 로드 컨트롤 또는 각 샘플 내 집 유지 유전자의 녹는 분수의 평균 픽셀 강도 정상화 하 여 달성입니다. 다음과 같이, GAPDH 사용 했다 집 유지 유전자로 수용 성 부분을 위해 그것은 cytosol (그림 1)에 주로 localizes. 다른 일반적으로 사용 되 집...

적절 한 접는 보장 하는 단백질 품질 관리 네트워크 장애 및 세포 단백질의 저하는 가능성이 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 병 리 및 다른 "단백질 misfolding" 2,3장애. Proteostasis 네트워크 구성 요소와 병 리에 그들의 공헌에 대 한 자세한 이해는 그러므로 향상 된 치료 내정간섭을 개발 하는 중요 한. HD는 HD 유전자 huntingtin (HTT) 단백질4에서 polyglutamines (polyQ)의 확장 된 스트레칭 결과 내에서 CAG 반복의 비정상적인 확장에 의해 발생 합니다. HD pathogenesis의 일관 된 병 적인 기능이 이다는 결과 misfolding, 축적, 그리고 정상적인 세포 항상성 그리고 기능을 여러 가지 방법으로 방해를 표시 되었습니다 HTT 두뇌의 영역에서와 주변 조직에의 5 , 6. 동안 HTT 표현 편, 고가에 중간 가시 뉴런 선택적으로 취약 하 고 가장 명백 하 게 영향을 받는 주목할 만한 대뇌 피 질의 위축 또한 HD pathogenesis 연관.
HD 환자 및 동물 모델의 두뇌에 HTT의 집계의 형성 일반적으로 질병의 진행 및 지배적인 부정 이득의 mHTT7기능에 대 한 프록시 표식으로 봉사 했다. 비록 정확한 기계 장치는 단백질에 의해 misfolding와 집계 mHTT 유발 독성에 기여할 수 있습니다, 불분명 남아 있다 HD 환자와 다양 한 동물 모델의 뇌에서 이러한 흠도의 형성은 고정 하 고 피할 수 없는 기능입니다. 포함 표시 대부분의 N 맨끝을 포함 하는 누적된 HTT 조각 구성 확대 polyQ, 그 베이스를 나타내는 전장 HTT의 대안 접합8,처리9 할 수는 HD. N-터미널 HTT 파편의 병 인에 중요 한 역할 수 빠르게 집계, nucleate, 고 가속 또는 집계 프로세스10전파 HTT의 pathologic 형태를 구성 수 있습니다.
그러나, 이러한 포함의 존재 HTT 유발 독성 또는 세포 죽음11와 반드시 연결 되지 않습니다. HTT 불용 성 집계를 포함12성 oligomeric 종 및 β-시트 소 통해 녹는 단위체에서 집계 과정을 제안 하고있다. 이러한 다양 한 단백질 종 표준 생 화 확 적인 분석 실험을 통해 해결 낮은 세제 세포의 용 해 버퍼에서 그들의 안정성과 표준 생 화 확 적인 분석 실험을 사용 하 여 시각화에 어려움으로 인해 필드에 도전이 되었습니다. 따라서, 방법론 고려 사항 학위 및 누적 및 집계 mHTT의 패턴 감지에 중요 하다.
여기에 제시 된 프로토콜 제공 HTT, 특히 HD pathogenesis 및 질병 진행1,13 와 밀접 하 게 추적에 표시 되는 불용 성 HMW HTT 종 형성의 여러 중간체를 시각화 하는 방법 14. 해결 하 고 추적 mHTT의 여러 종 수 연구원은 질병 병 인을 연구 하 고 그들의 변조 및 질병 병 인에 미치는 영향을 통해 잠재적인 치료 내정간섭을 평가 생화학 도구를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>멸균 필터</td>, <td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>나사 캡, 멸균 진공 필터,</td></tr><tr><td>1mL 티슈 그라인더, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>, Qsonica</td><td>모델 Q125</td><td></td></tr>, <tr><td>DC 단백질 분석</td>, <td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Lowry 분석</td></tr><tr><td>Tris 1M 완충 용액</td>과 비교 가능, <td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M 용액</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS 용액</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfony Flouride</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>100%에서 100mM 원액 생성 EtOH, 4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>오르토바나데이트 나트륨</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>물에 0.5M 스톡 용액 생성</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>물에 10mg/ml 스톡 솔루션 생성</td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>물에 10mg/ml 스톡 솔루션 생성</td></tr><tr>Sodium<td>Fluoride</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>물에 500mM 스톡 솔루션</td></tr><tr><td>생성 Anti-HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>웨스턴 블롯에는 1:1000, 필터 지연 분석에는 1:500을 사용합니다</td></tr>. <tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>용해성 웨스턴 블롯에는 1:1000을 사용합니다</td></tr></tbody></table>.

가용성과 불용 성 huntingtin의 해상도 대 한 분류

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Misfolded 단백질의 축적 중심 Huntington의 질병 (HD)에 병 리 그리고 많은 다른 신경 퇴행 성 질환입니다. 특히, HD의 주요 병 적인 특징은 높은 분자량 복합물으로 돌연변이 체 HTT (mHTT) 단백질의 탈 선 축적 하 고 세포내 포함 시체 조각 및 다른 단백질으로 구성. 기존의 방법 측정 하 고 이해 하는 다양 한 형태의 mHTT 포함 된 집계의 기여 등 형광 현미경 검사 법, 서쪽 오 점 분석, 필터 트랩 분석 실험.
그러나, 이러한 방법의 대부분 특정, 구조 이며 따라서 mHTT 단백질 유량 집계 용 해도 및 해상도의 복잡 한 특성의 전체 상태를 확인 하지 않을 수 있습니다.
집계 mHTT 및 다양 한 수정된 양식 및 단지의 식별, 분리 및 세포 집계 및 파편의 가용 화는 필수입니다. 여기 우리 녹는 mHTT, 단위체, 올리고, 조각, 시각화를 격리 하는 방법을 설명 하 고 있는 불용 성 고 분자량 (HMW) 축적 mHTT 종. HMW mHTT 추적 질병 진행, 마우스 동작 표시기와 해당 하며 특정 치료 개입1군인이 변조 되었습니다. 이 방법은 마우스 뇌, 주변 조직 및 세포 배양 함께 사용할 수 있지만 다른 모델 시스템 또는 질병 상황에 적용할 수 있습니다.

분류에 따라 가용성과 불용 성 세포 lysates의 해상도 서양 분석 및 필터 지체 분석 (그림 2)를 사용 하 여 검색할 수 있습니다. 예를 들어, HEK293T 세포 transfection 시 약 (예를 들어, lipofectamine 2000)를 사용 하 여 페 했다, HTT exon과 97 글루타민을 포함의 인코딩 cDNA 1 개15 폴 리 프롤린 풍부한 지역 이어서 반복 하 고 이러한 셀 수 있었습니다. 44 h. 세포 치료에 대 한 표현 중 5 µ M와 MG132는 프로테아좀 차단 또는 수확 전에 h 18로 lysed 컨트롤 DMSO 위에서 설명한. 분별 법 프로토콜, 다음 돌연변이 체 HTT exon 1 녹는 단위체로 약 45 kDa 4-12% 두번째-트리 페이지 젤에 고 3-8% 트리 아세테이트 페이지 젤 (...

메서드는 마우스 두뇌와 셀 문화에서 불용 해 성과 녹는 돌연변이 huntingtin 종의 분류에 대 한 설명 되어 있습니다. 설명 하는 메서드는 특성화 및 정량화 huntingtin 단백질 플럭스와 단백질 항상성 질병 병 인에 고 섭의 존재를 분석 에이즈의

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

이 절차의 전반적인 목표는 헌팅턴병 모델 시스템에서 단백질 항상성 분석을 위해 헌팅틴 단백질 플럭스의 시각화, 특성화 및 정량화에 유용한 도구를 설명하는 것입니다. 이 방법은 단백질 항상성 및 신경퇴행성 질환 분야의 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 특정 치료 개입이 질병 발병에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조사자가 정량 분석을 위해 불용성 단백질 종을 분리하고 분해할 수 있다는 것입니다.이 방법은 헌팅턴병 발병 기전 중 생화학적 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 다른 단백질 잘못 접힘 질환에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 각 샘플에 대해 두 세트의 튜브를 용해성 및 불용성으로 표시합니다. 용해성 튜브에서 시료를 용해하기 직전에 적절한 양의 억제제를 첨가하여 용해 완충액을 준비합니다.다음으로, 프로테아제 억제제가 보충된 얼음 냉간 가공 용해성 용해 완충액을 조직에 추가합니다. 쥐의 뇌 조직의 경우 1ml 유리 douncer에서 천천히 30회 두드립니다. 기포가 형성되어 불완전한 균질화가 발생할 수 있으므로 액체 표면이 깨지지 않도록 주의하십시오.그런 다음 얼음 위의 불용성 라벨이 붙은 튜브에 피펫으로 넣습니다. 세포주의 경우, 세포를 각 6-웰 플레이트에서 5번째 세포까지 5배 10으로 도태하고 거의 포화도에 가깝게 성장시켰습니다. 그런 다음 차가운 1X PBS로 세포를 한 번 헹구고 제거합니다.그런 다음 세포에 최소한의 용해 완충액을 바르고 세포 스크레이퍼로 들어 올립니다. 다음으로, 균질액 또는 세포 용해물을 표지된 불용성 튜브로 옮기고 얼음에서 1시간 동안 용해합니다. 세포 용해물의 경우, 배양을 시작하기 전에 세포 덩어리를 분해하고 기포가 형성되지 않도록 여러 번 분쇄합니다.각 샘플을 용해 중간에 1초 동안 간단히 펄스 소용돌이. 그 후, 섭씨 4도에서 15, 000 x g에서 20 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오. 그런 다음 상층액을 제거합니다.펠릿이나 흐린 층을 방해하지 않도록 주의하면 분획이 오염됩니다. 상등액을 용해성 분획으로 피펫으로 용해성 표지된 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 용해성 및 불용성 용해 완충액을 추적하는 것이 중요합니다.완충액을 전환하거나 불용성 완충액 또는 샘플을 얼음 위에 놓는 것은 프로토콜의 결과에 해로울 수 있습니다. 500마이크로리터의 용해 완충액과

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을...

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

이 비디오는 비아밀로이드 단백질의 밀도 구배 원심분리 및 분해를 사용하여 마우스 뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 원섬유를 분리하는 프로토콜을 보여줍니다.

뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 섬유의 분리

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

여기, 우리가 현재 네이티브, 태그 무료 단위체의 밀리 그램 수량과 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1의 소의 생산을 위한 강력 하 고 최적화 된 프로토콜.

네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

fumarylacetotatetate하이드라세아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현 및 정제는 예시(대장균, FPLC에서발현)로 기재된다. 정제된 단백질은 결정화 및 항체 생산에 사용되며 효소 공아에 사용됩니다. 선택된 광측정 분석제는 옥살로아세테이트 데카르박실라제 및 아실피루베테 하이드로라제로서 FAHD1의 다기능성을 표시하기 위해 제시된다.

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

자사는 HEK293 세포에서 구조체 설계, 일시적 형질감염, 전장 인간 헌팅틴 단백질 변이체의 발현 및 정제를 포괄하는 확장 가능한 프로토콜을 제공합니다.

일시적 발현 시스템을 사용한 포유류 세포에서 전장 인간 헌팅틴 변이체의 효율적이고 확장 가능한 생산

이 프로토콜은 돼지 신장 및 마우스 간으로부터 푸마리아세토아세테이트 가수분해효소 도메인 함유 단백질 1(FAHD1)을 추출하는 방법을 기술한다. 열거된 방법들은 관심있는 다른 단백질에 적응될 수 있고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다.

돼지 신장과 마우스 간에서 FAHD1 단백질의 추출 및 정제

이 프로토콜은 마우스 뇌에서 고순도 시냅토솜, 시냅스 소포 및 기타 시냅스 분획을 얻는 강력하고 상세한 방법을 제시합니다. 이 방법은 단백질 국소화의 생화학적 분석을 포함한 시냅스 과정의 평가 및 구획 분해능을 통한 기능을 가능하게 합니다.

쥐의 뇌로부터 시냅스 성분의 분리를 위한 세포하 분획

학습하세요 Huntingtin 단백질의 가용성과 불용성 분획화 방법을 통해 신경퇴행성 질환에서 단백질 항상성을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 치료 개입 효과 평가에 활용됩니다.

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

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