Name: 세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 인간 Bruch 막에서 망막 안료 상피 세포 배양 방법을. 노화된 막에서 RPE 세포 부착 및 탐식 기능 변화를 연구하여 연령 관련 황반변성의 병리 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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이 연구는 망막 퇴행 성 질병 기초 싸우는 장 님에 대 한 방지 실명, 뉴욕, www.rpbusa.org, 및 더 큰 뉴욕 센터 연구에 의해 지원 됩니다 www.blindness.org. 저자는 Luanna 바르 톨 로메 오, 박사,이 원고에의 그녀의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다.

다음 프로토콜은 헬싱키의 선언 및 예일 대학 인간 연구 윤리 위원회 지침의 신조를 준수에서 수행 됩니다.
1. 인간 기증자 눈 소싱
<ol><li>국가 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, 펜 실바 니 아)에서 인간 기증자 글로브를 얻습니다. 프로젝트에 따라 각 실험 그룹 기증자 눈의 이상 3 쌍을 준비 합니다.</li>
	<li>10 h 이내 기증자 눈 및 48 h 사후내 배 enucleate. 그런 다음 눈 살 균 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM) 문화 매체 얼음에 있는 실험실을 전송 합니다. 이전 보고 연구 기증자 눈 수확 및 생물 학적 기능 및 Bruch의 막25,,2629의 활동이 패션 보존에 이송 증명 하고있다.</li>
</ol>2. 인간의 Bruch 막의 수확 Explants
<ol><li>1.5 x 1.5 인치 거 즈에 각 눈 적셔 100mm 문화 접시에 후부는 limbus sclera 3mm 통해 절 개를 만들기 위해 사용 잘 블레이드가 위 이산화탄소 독립적인 DMEM 미디어와 원주 어느 방향으로 확장 하는 장소.</li>
	<li>확인 또는 참나무에 전체 두께 원주 절 개 (유리를 관통) 1mm 후부. 제거 하 고 이전 세그먼트 (각 막, 렌즈, 및 홍 채), 유리 체 및 망막을 삭제.</li>
	<li>미세 수술가 위 공 막 엔, 맥락 막, 사이 4 개의 방사형 절 개를 사용 하 여 하 고을 피하기 위해 복잡 한 맥락 막/Bruch 막 끊어지고 돌보는 동안 시 신경에 주변에서 공 막 엔 껍질.</li>
	<li>다음, ora 참나무 따라 suprachoroidal 공간을 통해 완곡 한 절 개를 확인 하 고는 sclera에서 뒤로 RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한 껍질.</li>
	<li>0.02 M Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 DPBS (그림 1)에서 3 시간을 세척 하 여 다음 실 온에서 20 분 페 트리 접시에에서 수산화 암모늄을 explant 목욕 여 네이티브 RPE 세포를 제거 합니다.</li>
	<li>Unlaminated, 소수 성 65 µ m 두께 소계 막 막 직면 각 explant의 기저 lamina 레이어와 0.2 µ m 숨 구멍을 통해 이산화 탄소 자유로운 매체에 Bruch의 막 복잡 한 explant 부동.</li>
	<li>유리 microanalysis 진공 필터 홀더 시스템에 Bruch의 막 explant와 소계 막을 유리 fritted 지원에 놓습니다.</li>
	<li>미세 집게를 Bruch의 막 기저 laminin 측면을 건드리지 않도록 돌보는 테플론으로 코팅을 안 쪽에서 컬된 가장자리를 평평.</li>
	<li>Agarose DPBS (4%)의 15 mL를 열 및 다음 37 ° c 냉각 그럼는 explant 평면 유지 됩니다 보장 하기 위해 부드러운 흡입을 적용 하는 동안 안 쪽에서 Bruch의 막-맥락 막의 복잡 한에 liquidized 젤의 15 mL를 붓는 다. 2-3 분 하는 agarose를 공고히 하 고 다음 소계 막 떨어져 껍질 4 ° C에서 조직 유지.</li>
	<li>Bruch의 막 explant (응고 agarose 젤에서 직경에 있는 1.5 인치) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 셀 문화 접시에 (Bruch의 막 위로 향하도록)으로 늘어서 되었습니다 따뜻한 액체 agarose Bruch의 멤브레인을 해결 하기 위해 접시의 하단에 있는 장소 향하도록 explant 기저 laminin 레이어와 explant 우물의 바닥에.</li>
	<li>agarose Bruch의 막 explants 문화 접시에 안정화를 위해 상 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다. Bruch의 막 문화에서 explants 커버 DPBS와 접시와 미래 사용을 위한 4 ° C에서 접시를 저장 합니다. 그림 2A 격리 Bruch 막 explants는 60 x 15 m m 문화 접시에 보여 줍니다.</li>
	<li>96 잘 접시에 원하는 문화 시스템 있으면 최대 Bruch의 막 explant (1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤) laminin 사이드와 평면 테 플 론 시트에 놓습니다.</li>
	<li>5 또는 6, 인하는 판형을 사용 하 여 복잡 한 Bruch의 막에서 6 mm 원형 버튼 explant 고 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 각각 4 %agarose 장소. agarose 각 우물의 바닥에 Bruch의 막 explants (버튼)를 해결 하기 위해 실 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다. 참고: 그림 2B 는 96 잘 접시 trephined Bruch 막 단추를 보여 줍니다. 일반적으로 9-11 단추 또는 explants 각 눈에서 수확 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. 인간의 Bruch 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 배양 Explants
<ol><li>기증자 눈을 접수 한 후, 청소와 DPBS extraocular 조직. 완곡 한 절 개를 아이리스 sclera 아래 5mm subretinal 공간에 포인트 (동위 플) 터치를 확인 합니다. 이전 세그먼트, 유리 체 및 망막을 삭제 합니다.</li>
	<li>Bruch의 막과 차가운 DPBS RPE 시트 포함 아이피 워시. 각 눈 샘플 10 분 보다는 더 이상에 대 한 0.25 %trypsin 5 mL와 RPE 세포 분열 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 50 mL 튜브에 37 ° C에서 예 열 된 DMEM 완전 한 매체의 25 mL로 trypsin 반응을 끄다.</li>
	<li>24 ° C에서 10 분 동안 200 × g에서 세포를 원심과 DMEM 완전 한 매체의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend (15 %FBS).</li>
	<li>셀을 계산 하 고 각 다양 한 세 Bruch 막 explants (버튼) 혈 청 무료 최소 필수 미디어 (MEM)의 200 µ L에서 96 잘 접시에 항생제를 포함의 기저 lamina 에 15000 가능한 RPE 세포 씨앗 (100 IU/mL 페니실린 G, 100 mg / mL 스, 5 mg/mL gentamicin, 그리고 2.5 mg/mL 암포 B). 가정 셀 직경 20 µ m,이 밀도에서 도금의 도금 면적의 약 15%를 커버 하는 RPE 세포 수 있습니다.</li>
	<li>그것에 의하여 셀 밀도 수 있습니다 다음까지 증가 시킬 stepwise 셀 동작에 각 매개 변수의 영향에 따라 100% 합류 하는 버튼에 셀 접시</li>
	<li>37 ° c.에 95% air/5% CO2 의 습도 분위기에서 24 h explant 연결할 셀 허용 부드럽게 따뜻한 완벽 한 DMEM과 매체를 변경 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

작가의 아무도 어떤 상업적인 공개 선언 하 있다.

세 인간 Bruch 막 (기질) AMD의 질병의 진행에 기여 하 고 따라서이 변경 된 매트릭스 RPE 세포 역 기능에 기여 하는 방법을 이해할 필요가 있다. AMD에서 연령과 관련 된 변화를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, ex vivo 모델 시스템 질병의 효과 모방 하는 이상 이해 하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 원고에 설명 된 방법론 일관 Bruch의 막 explants 및 문화 RPE 세포 주, 불멸 하 게, 또는 줄기 세포 유래 RPE 세포 라인을 포함 하 여 인간을 사용할 수 있습니다.
앞에서 설명 했 듯이, 인간의 Bruch 막 explants는 NDRI에서 공급 됩니다. 프로토콜 허용 되 기증자 눈에 대 한 설정 기준을 지정 NDRI로 설치 된다. 예를 들어 기증자도 없고 알려진된 망막 눈 질병, 눈/글로브가 죽음 후에 10 h 이내 검색 있고 글로브 (얼음에 숙박 패키지 배달)을 통해 죽음 후 48 h 이내 실험실에 도착. 적절 한 나이 범위와 연구, 예의 통계 분석에 필요한 눈의 수를 지정., 20-49 세 50-89 년의 세 사이의 기증자 로부터 5 글로브 쌍 사이 기증자에서 글로브의 5 쌍.
눈 글로브의 가용성, 일반적으로 평균 10 쌍 글로브 사용할 수의 매달 마다 다릅니다. 기본, 취소 확인 된 기증자 정보 눈 패키지 도착: 나이, 인종, 죽음, 죽음의 원인의 때, 과거의 병력 (질병 목록 또는 comorbidities) 간략 한.
가장 중요 한 것은, 인간의 Bruch 막 explants 수확 눈의 유리 체, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한의 격리 수 있도록 앞쪽 세그먼트의 제거를 해야 합니다. 일단 Bruch의 막 분리, RPE 세포 다양 한 농도에서 acellular explants에 시드 고 다운스트림 실험에 대 한 양식 수 있습니다. 여기에 설명 된 대로 중요, 되도록 laminal 표면 이다 연결-최대 하지 기계적 손상을 방지 하려면 표면 감동 하는 동안 격리 Bruch 막의 방향에 주의 기울이고 준비 및 절차 처리는 기질 표면 구조입니다.
또한 주목 해야 한다 Bruch의 막 explant 시스템을 사용 하는 경우는 개별 기증자 게놈 배경 등 다운스트림 실험의 결과, Bruch의 막의 나이 또는 Bruch의의 사후 시간에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 변수 막, 그리고 Bruch의 막, 즉의 위치., 중앙 또는 주변 Bruch의 막 explants의 부분. 다른 인체 조직 연구와 마찬가지로 하나 필요한 통계적 인 힘을 일치 하는 기증자 눈 나이 적절 한 경우 적절 한 기증자 눈 샘플 번호를 모집 합니다. 안구 은행에서 눈을 수락에 대 한 엄격한 기준을 설정 하는 것은 중요 한 매개 변수입니다. 눈을 10 h 사후 enucleated는 그리고 Bruch의 막 준비 죽음 후 24-48 시간 이내에 수확 수 있습니다 허용 합니다. 시 신경 사이트 방향에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다와 같은 위치를 사용 하 여 실험 및 연구 그룹을 제어. 이러한 조치를 취 함으로써 한 실험적인 변화를 최소화할 수 있습니다.
요약 하자면, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 하 고 연령과 질병에 의해 영향의 이해가 AMD의는 이상에 그것의 기여를 이해 하는 데 중요 합니다. Ex vivo 기술을 사용 하는 모델 시스템 인간 직물을 사용 하 여 이러한 효과 조사 하기 위해 귀중 한 도구입니다. 여기는 인간 기증자 explants 세 Bruch 막의 관련 전 비보 모델로 사용 하는 방법에 설명 합니다. 이 기술은 구조 매트릭스 내에서 변경 하는 방법을 조사 하는 연구 도구 오버레이 RPE에 영향을 미칠 수 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 멤브레인을 사용 하 수 있도록 첨부 파일, 확산, 그리고 유전자 식25 셀 동작 , 27. 비슷한 ex vivo 모델 시스템의 성공적인 개발 AMD의 우리의 이해를 심화 하 고 새로운 치료 옵션의 개발을 촉진.

나이 관련 구조 변경 인간의 Bruch 막, nitrosative 및 산화 스트레스 등 많은 요인에 의해 발생에 미치는 망막 안료 상피 (RPE) 세포에 기여 하 고 기능에 여러 해로운 효과 연령 관련 황 반 변성 (AMD)1,2,3,,45,6,7,8,9의 병 리 . 고급 위축 AMD 또는 지리적 위축에 대 한 세포 대체 요법을 고려할 때 치료 RPE 세포 위축의 침대에 세포의 이식이 필요 합니다. 인간의 Bruch 막 내에서 나이 관련 변경 부정적인 기질6,9,,1011 에 피해를 주어 이식된 RPE 세포 이식의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch의 막 생물학과 매트릭스 내에서 구조를 변경 하는 방법을 AMD에 진행에 기여 하는 연구 인간 질병 병 리를 이해 하는 데 필수적 이다. 따라서, 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 수확 전 비보 를 설명 하는 프로토콜을 개발 하는 눈 나이 관련 분야에서 수 사관에 대 한 중요 한 필요가 있다.
역사적으로, 그것은 지리적 위축 등 동물23세 인간의 Bruch의 멤브레인 모델 나이 관련 무질서에 어렵게 되었습니다. 이 이러한은 설치류 및 질병 모델링, 뿐만 아니라 대부분 척추24에서 망막의 부족을 위해 자주 사용 하는 다른 종에 비해 인간의 장 수를 포함 한 여러 요소에서 발생 합니다. 여기에 설명 된 방법의 장점은 셀 세 또는 병에 걸린 개인의 게시물 부검 눈에서 추출한 Bruch의 막에 직접 테스트할 수 있습니다. 이 글의 전반적인 목표 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 ex vivo 모델에 대 한 상세한 방법론을 제공 하는, 인간의 Bruch의 격리를 포함 하 여 인간 기증자에서 막 explants 및 RPE의 시드 셀에 대 한 다운스트림 실험입니다. 이 모델 기질 손상 RPE 세포 기능과 병 리20,25,26,,2728에 기여를 조사 관련 모델 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인간 기증자 지구본</td><td>National Disease Research Interchange, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>이산화탄소 독립 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>60mm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>351007 Dulbecco의 인산염 완충 식염수, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic 65 &micro; 0.2 &micro를 가진 m 두꺼운 polytetrafluoroethylene 막; m 모공</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 유리 미량 분석 진공 필터 홀더 시스템&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 &times; 10mm 배양 접시</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체(MEM)&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>11095-080&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 G</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>시그마-알드리치</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>1336-21-6 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

세 인간 bruch 막의 ex vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

비타민 및 항 산화 의학 눈 질병 연구에 의해 권장, "건조" 또는 위축 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 경우 90%를 나타내는 대 한 더 효과적인 치료가입니다. 치료는 느리게 하거나 지리적 위축 (GA)의 개발을 지체 필요 하 고이 과정의 일부인 Bruch의 막 병 리를 이해. 인간의 Bruch 막 변경 세포 망막 안료 상피 (RPE)의 손상에 기여 함으로써 AMD의 진행을 앞. AMD를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, 세 인간의 Bruch 막의 ex vivo 모델 역할 RPE 세포에서의 동작을 연구 하는 유용한 도구 불후 및 RPE 라인으로 1 차 셀 라인 유도 만능 줄기에서 파생 된 셀 (Ipsc)입니다. 여기, 우리 인간 기증자, 첨부 파일, apoptosis, 확산, 포토 리셉터 외부 phagocytize 수 등에서 수확된 인간의 Bruch 막 explants에 시드 RPE 세포 행동의 효과 확인할 수 있도록 상세한 방법 제시 세그먼트, 극성, 및 유전자 발현의 설립. 이 분석 결과 세/손상 세포 외 기질에 시드 때 RPE 세포의 기능적 특성을 평가 하기 위해 세 Bruch 막의 비보 전 모델을 제공 합니다.

이 프로토콜 제대로 수행 되 면 하나 극성 및 외부 혈액 망막 방 벽의 설립, 성장 인자, cytokines의 편광된 분 비에 의해 RPE 세포 기능에 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 확인할 수 있습니다. 그리고 포토 리셉터 막대 외부 세그먼트의 식 균 작용입니다.
우리 세 인간의 Bruch 막에 질병 표현 형을 설명 하는 데이터를 생성 했습니다. 예를 들어 인간의 Bruch 막 explants 감소 RPE 세포 뚝 (그림 3) 세에 RPE 세포 배양. 세 인간의 Bruch 막에 경작 하는 RPE 세포 감소 수 이러한 세포의 phagocytize 막대 외부 세그먼트 (선생님), RPE는 중요 한 기능 (그림 4). 또한, apoptotic 세포 확인 하 고 이전 작업26에 설명 된 대로 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 얼룩을 사용 하 여 이러한 버튼 explants에 비교 될 수 있습니다. RPE 세포 유전자 표현 프로 파일에는 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 microarray 기술을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 우리 젊은 개인 (그림 5)27explants에 비해 더 오래 된 개인에서 인간의 Bruch 막에 경작 하는 경우 RPE 세포 유전자 발현 변경 설명 했다. 통계 분석을 위해 적어도 3-5 인간 기증자에서 explants는 그룹 당 사용 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> 그림 1입니다. 기증자 눈에서 인간의 Bruch 막의 절연의 도식 대표. 인간의 Bruch 막 sclera, 앞쪽 세그먼트, 망막, 유리 체, 제거 하 여 수확 하 고 네이티브 망막 안료 상피 (RPE) 세포. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> 그림 2입니다. 인간의 Bruch 막 (BM) 문화 접시에 절연. (A) 인간의 Bruch 막 explants (각 1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤)의 회로도에 배치 60 × 15 mm 폴리스 티 렌 셀 문화 접시 (BM 보여지는) 접시의 하단에 따뜻한 액체 agarose로 가득. 몇 가지 6mm 원형 단추 (explants)에 trephined은 (B)는 인간의 Bruch 막 explant 각 유량을 다음에 배치 되었다 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 4 %agarose. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> 그림 3입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 젊고 더 오래 된 인간의 Bruch 막 (BM)에 뚝 속도. 기본 RPE 세포 인간 Bruch의 막 영에서 explants에 시드 했다 (&lt; 50 세, n = 3) 이상 (&gt; 70 세, n = 5) 3 주 동안 기증자 눈. 세포 부착 속도 MTT 세포 생존 능력 분석 실험에 의해 측정 되었다. 더 오래 된 인간의 Bruch 막 RPE 세포 부착 속도 24% 감소 (젊은 BM 100 8.54 + 1.44 + 이전 BM 76.65 대 남동 남동). p &lt; 0.05, 남동 표준 오류 =.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> 그림 4입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 먹어서 인간의 Bruch 막 (BM)의 나이 의해 영향을 받습니다. 기본 RPE 세포 이전 인간 Bruch의 막 explants에 경작 했다 감소 수 막대 외부 세그먼트 (선생님) phagocytize (9.3 + 젊은 BM 873 남동, n = 25.4 + 이전 BM 608 대 5 남동, n = 5). p &lt; 0.01, 남동 표준 오류 =.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> 그림 5입니다. 수가 망막 안료 상피 (RPE) 셀 유전자 영에 경작 하는 각 샘플에 표현 또는 이전 인간의 Bruch 막 explants. 거기에 시드 기본 RPE 세포에 표현 된 유전자의 수에 더 많은 피해를 했다 젊은 인간의 Bruch 막 대 이전 (6201 ± 388 6439 ± 80, 대 각각); 5 explants는 각 연령 그룹에 대 한 테스트 되었습니다. Cai의 모든 작가의 전체 권한 함께 제시 H 외. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 Bruch의 막 배양 시스템으로 알려진 생체 외 세포 매트릭스를 만들어 망막 색소 상피 세포를 오버레이하는 Bruch의 막의 효과를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 노화된 브루흐 막의 변화가 오버레이 RPE 세포의 오작동에 기여하는지 여부와 같은 AMD 병인학 분야의 RPE 하위 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자들이 서로 다른 연령대의 인간-기증자 눈에서 네이티브 브루흐 막을 분리하여 RPE 세포 배양에서 단백질체학 연구에 사용할 수 있다는 것입니다.브루흐의 막을 분리하고 토착 브루흐의 막에 대한 손상을 최소화하면서 실제 생체 배양 시스템을 만드는 것은 어려운 일이지만, 이 비디오에서 그 방법을 보여드리겠습니다. 시작하려면 CO2 독립 DMEM에 적신 1.5제곱인치 거즈를 100mm 접시에 넣습니다. 그런 다음 거즈에 안구를 로드합니다.다음으로, 수술용 칼날을 사용하여 윤부 뒤쪽 3mm 떨어진 공막을 절개합니다. 그런 다음 가는 칼날 가위를 사용하여 전체 두께로 절개하고 눈 주위 어느 방향으로든 절개 부위를 둘레로 확장합니다. 그런 다음 각막, 수정체, 홍채를 포함한 앞쪽 부분을 제거하고 버립니다.또한 유리체와 망막은 버리십시오. 그런 다음 테프론으로 코팅된 주걱을 사용하여 공막에서 주변부에서 시신경까지 RPE Bruch의 막 맥락막 복합체를 조심스럽게 벗겨냅니다. 이것은 막 복합체를 찢지 않도록 매우 조심스럽게 수행해야합니다.이제 미세한 수술 용 가위를 사용하여 공막에서 4 개의 방사상 절개를 만들고 공막을 벗겨냅니다. 그런 다음 시신경에서 Bruch의 막 맥락막 이식을 절단하고 이 이식을 DPBS에 0.02 몰 수산화암모늄이 함유된 60mm 접시로 옮깁니다. 천연 RPE 세포를 제거하려면 이 외식을 실온에서 20분 동안 배양합니다.배양 후 테프론 코팅된 집게로 Bruch의 멤브레인에 있는 시신경 부위를 고정하고 조직 주위를 용액이 흐르게 하여 DPBS를 사용하여 외식식물을 3회 세척합니다. 다음으로, 이산화탄소가 없는 매체에서 라미닌 면이 위를 향하도록 외식을 띄웁니다. Bruch의 멤브레인을 4번 절개한 다음 외식선 위에 0.2미크론 기공이 있는 라미네이팅되지 않은 소수성 65미크론 PTFE 멤브레인을 옮깁니다.이것을 PTFE 멤브레인에 대한 기저 층판으로 설정합니다. 접시에서 여분의 액체를 제거한 다음 어셈블리를 유리 미세시료 분석 진공 필터 홀더 시스템으로 옮겨 프릿 유리 지지대 위에 놓아야 합니다. 다음으로, 기저판과의 접촉을 조심스럽게 피하면서 테프론 코팅된 집게를 사용하여 맥락막 쪽의 말린 가장자리를 평평하게 만듭니다.이제 DPBS에서 15ml의 4% 아가로스를 액화하고 섭씨 37도로 냉각합니다. 그런 다음 아가로스를 외식의 맥락막 쪽에 천천히 붓고 평평하게 유지하기 위해 부드럽게 흡입합니다. 젤이 굳기 시작하면 멤브레인과 함께 얼음 위의 60mm 접시에 옮깁니다.젤이 2-3분 동안 응고되도록 한 다음 PTFE 멤브레인을 벗겨냅니다. 다음으로, 외식물을 DPBS에 담그고 필요할 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 액체 4% 아가로스를 깐 60mm 접시에서 외식을 배양할 때 Bruch의 멤브레인을 위로 향하게 하십시오.폴리스티렌이 라이닝된 96웰 플레이트를 사용하여 배양할 때 젤로 둘러싸인 Bruch's membrane explant를 라미닌 면이 위를 향하도록 하여 평평한 테프론 시트에 놓습니다. 그런 다음 트레핀을 사용하여 이식에서 6-8 개의 6mm 버튼을 자르고 조직 버튼을 액체 아가로스가 적재 된 우물로 옮깁니다. 시작하려면 이전과 같이 DPBS에 적신 거즈에 안구를 설정합니다.다음으로, 홍채-공막 접촉점인 pars plana에서 5mm 아래 망막하 공간으로 원주를 절개합니다. 내부 부분, 유리체액 및 망막을 버리십시오. 다음으로, 전사 피펫을 사용하여 2-3ml의 차가운 DPBS로 아이컵을 세척합니다.아이컵을 총 세 번 씻으십시오. 그런 다음 RPE 세포를 해리하기 위해 최대 10분 동안 트립신으로 안컵을 처리합니다. 그런 다음 트립신화된 RPE 세포를 50ml 튜브로 옮기고 반응을 소멸시키기 위해 섭씨 37도에서 FBS가 있는 배지 25ml를 추가합니다.이제 조직과 용액을 섭씨 24도에서 10분 동안 200g으로 원심분리합니다. 그런 다음 15% FBS가 포함된 5ml의 DMEM 완전 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 이제 세포를 세고 항생제를 함유한 200마이크로리터의 무혈청 최소 필수 배지에 15,000개의 생존 가능한 RPE 세포를 96웰 플레이트에 있는 Bruch의 멤브레인의 각 버튼에 앉힙니다.부착을 위해 최소 24시간 동안 세포를 배양합니다. 나중에 배지를 온열 완전 DMEM으로 부드럽게 변경하고 세포 배양을 계속합니다. 이 프로토콜을 사용하여 노화되고 병든 인간 Bruch의 막에서 RPE 세포를 성장시켜 연구할 수 있습니다.일반적으로 노화된 외식은 RPE 세포 재부착을 감소시킵니다. 노화된 인간 브루흐 막에서 배양된 RPE 세포는 또한 중요한 RPE 기능인 막대 외부 세그먼트를 식세포화하는 능력이 떨어집니다. 마이크로어레이를 사용하여 RPE 세포 유전자 발현이 나이 든 개인의 브루흐 막에서 배양될 때 젊은 개체의 막에서 배양된 세포와 다르다는 것이 밝혀졌습니다.이 비디오를 시청한 후에는 인간-기증자의 눈에서 Bruch의 막을 분리하고 RPE 세포를 배양할 수 있는 외식을 하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 표면 손상을 방지하기 위해 해부 도구로 Bruch의 막 이식의 라미닌 쪽을 만지지 않는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 RPE 식세포작용 및 RPE 세포 유전자 발현 연구와 같은 다른 방법을 수행하여 다양한 연령의 기증자 또는 연령 관련 황반변성이 있는 기증자의 Bruch's membrane이 오버레이 RPE 세포 기능에 영향을 미치는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 연령 관련 황반변성 분야의 연구자들이 Bruch의 멤브레인 생체 외 모델 시스템에서 AMD의 병인학 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

인간의 눈에서 브루흐 막과 특이적으로 관련된 단백질을 식별하는 것은 노화 관련 황반 변성과 같은 안과 질환 뒤에 있는 생화학적 메커니즘을 이해하는 데 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 다운스트림 생화학 분석을 위해 이 세포외 기질 시트를 농축하는 방법을 설명합니다.

인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

프로토콜은 혈청과 항생제가 없는 R16 정의 배지에서 망막 색소 상피 (RPE)와 함께 재배 된 마우스 신경망막의조직화 각질을 설명합니다. 이 방법은 생체 내 실험과 비교할 때 비교적 간단하고, 비용이 적게 들고, 시간이 많이 소요되며, 수많은 실험 응용 프로그램에 적응할 수 있다.

통가 경사진 마우스 망막의 장기, 세럼 없는 재배는 그대로 망막 색소 상피와 함께 익스처스

이 연구는 절제 처리 중 망막 무결성을 손상시키는 것을 방지하는 새로운 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모형을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이것은 과대 유리체와 근본적인 망막 안료 상피 코로이드 (RPE-choroid) 및 clera로 망막을 배양해서 달성됩니다.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

여기서, 시험 관 내에서 일차 돼지 망막 색소 상피세포를 배양하는 방법을 제시한다.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

배우세요 인간 Bruch 막에서 망막 안료 상피 세포 배양 방법을. 노화된 막에서 RPE 세포 부착 및 탐식 기능 변화를 연구하여 연령 관련 황반변성의 병리 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

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