세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

이 실험 절차의 전반적인 목표는 Bruch의 막 배양 시스템으로 알려진 생체 외 세포 매트릭스를 만들어 망막 색소 상피 세포를 오버레이하는 Bruch의 막의 효과를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 노화된 브루흐 막의 변화가 오버레이 RPE 세포의 오작동에 기여하는지 여부와 같은 AMD 병인학 분야의 RPE 하위 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자들이 서로 다른 연령대의 인간-기증자 눈에서 네이티브 브루흐 막을 분리하여 RPE 세포 배양에서 단백질체학 연구에 사용할 수 있다는 것입니다.

브루흐의 막을 분리하고 토착 브루흐의 막에 대한 손상을 최소화하면서 실제 생체 배양 시스템을 만드는 것은 어려운 일이지만, 이 비디오에서 그 방법을 보여드리겠습니다. 시작하려면 CO2 독립 DMEM에 적신 1.5제곱인치 거즈를 100mm 접시에 넣습니다. 그런 다음 거즈에 안구를 로드합니다.

다음으로, 수술용 칼날을 사용하여 윤부 뒤쪽 3mm 떨어진 공막을 절개합니다. 그런 다음 가는 칼날 가위를 사용하여 전체 두께로 절개하고 눈 주위 어느 방향으로든 절개 부위를 둘레로 확장합니다. 그런 다음 각막, 수정체, 홍채를 포함한 앞쪽 부분을 제거하고 버립니다.

또한 유리체와 망막은 버리십시오. 그런 다음 테프론으로 코팅된 주걱을 사용하여 공막에서 주변부에서 시신경까지 RPE Bruch의 막 맥락막 복합체를 조심스럽게 벗겨냅니다. 이것은 막 복합체를 찢지 않도록 매우 조심스럽게 수행해야합니다.

이제 미세한 수술 용 가위를 사용하여 공막에서 4 개의 방사상 절개를 만들고 공막을 벗겨냅니다. 그런 다음 시신경에서 Bruch의 막 맥락막 이식을 절단하고 이 이식을 DPBS에 0.02 몰 수산화암모늄이 함유된 60mm 접시로 옮깁니다. 천연 RPE 세포를 제거하려면 이 외식을 실온에서 20분 동안 배양합니다.

배양 후 테프론 코팅된 집게로 Bruch의 멤브레인에 있는 시신경 부위를 고정하고 조직 주위를 용액이 흐르게 하여 DPBS를 사용하여 외식식물을 3회 세척합니다. 다음으로, 이산화탄소가 없는 매체에서 라미닌 면이 위를 향하도록 외식을 띄웁니다. Bruch의 멤브레인을 4번 절개한 다음 외식선 위에 0.2미크론 기공이 있는 라미네이팅되지 않은 소수성 65미크론 PTFE 멤브레인을 옮깁니다.

이것을 PTFE 멤브레인에 대한 기저 층판으로 설정합니다. 접시에서 여분의 액체를 제거한 다음 어셈블리를 유리 미세시료 분석 진공 필터 홀더 시스템으로 옮겨 프릿 유리 지지대 위에 놓아야 합니다. 다음으로, 기저판과의 접촉을 조심스럽게 피하면서 테프론 코팅된 집게를 사용하여 맥락막 쪽의 말린 가장자리를 평평하게 만듭니다.

이제 DPBS에서 15ml의 4% 아가로스를 액화하고 섭씨 37도로 냉각합니다. 그런 다음 아가로스를 외식의 맥락막 쪽에 천천히 붓고 평평하게 유지하기 위해 부드럽게 흡입합니다. 젤이 굳기 시작하면 멤브레인과 함께 얼음 위의 60mm 접시에 옮깁니다.

젤이 2-3분 동안 응고되도록 한 다음 PTFE 멤브레인을 벗겨냅니다. 다음으로, 외식물을 DPBS에 담그고 필요할 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 액체 4% 아가로스를 깐 60mm 접시에서 외식을 배양할 때 Bruch의 멤브레인을 위로 향하게 하십시오.

폴리스티렌이 라이닝된 96웰 플레이트를 사용하여 배양할 때 젤로 둘러싸인 Bruch's membrane explant를 라미닌 면이 위를 향하도록 하여 평평한 테프론 시트에 놓습니다. 그런 다음 트레핀을 사용하여 이식에서 6-8 개의 6mm 버튼을 자르고 조직 버튼을 액체 아가로스가 적재 된 우물로 옮깁니다. 시작하려면 이전과 같이 DPBS에 적신 거즈에 안구를 설정합니다.

다음으로, 홍채-공막 접촉점인 pars plana에서 5mm 아래 망막하 공간으로 원주를 절개합니다. 내부 부분, 유리체액 및 망막을 버리십시오. 다음으로, 전사 피펫을 사용하여 2-3ml의 차가운 DPBS로 아이컵을 세척합니다.

아이컵을 총 세 번 씻으십시오. 그런 다음 RPE 세포를 해리하기 위해 최대 10분 동안 트립신으로 안컵을 처리합니다. 그런 다음 트립신화된 RPE 세포를 50ml 튜브로 옮기고 반응을 소멸시키기 위해 섭씨 37도에서 FBS가 있는 배지 25ml를 추가합니다.

이제 조직과 용액을 섭씨 24도에서 10분 동안 200g으로 원심분리합니다. 그런 다음 15% FBS가 포함된 5ml의 DMEM 완전 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 이제 세포를 세고 항생제를 함유한 200마이크로리터의 무혈청 최소 필수 배지에 15,000개의 생존 가능한 RPE 세포를 96웰 플레이트에 있는 Bruch의 멤브레인의 각 버튼에 앉힙니다.

부착을 위해 최소 24시간 동안 세포를 배양합니다. 나중에 배지를 온열 완전 DMEM으로 부드럽게 변경하고 세포 배양을 계속합니다. 이 프로토콜을 사용하여 노화되고 병든 인간 Bruch의 막에서 RPE 세포를 성장시켜 연구할 수 있습니다.

일반적으로 노화된 외식은 RPE 세포 재부착을 감소시킵니다. 노화된 인간 브루흐 막에서 배양된 RPE 세포는 또한 중요한 RPE 기능인 막대 외부 세그먼트를 식세포화하는 능력이 떨어집니다. 마이크로어레이를 사용하여 RPE 세포 유전자 발현이 나이 든 개인의 브루흐 막에서 배양될 때 젊은 개체의 막에서 배양된 세포와 다르다는 것이 밝혀졌습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간-기증자의 눈에서 Bruch의 막을 분리하고 RPE 세포를 배양할 수 있는 외식을 하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 표면 손상을 방지하기 위해 해부 도구로 Bruch의 막 이식의 라미닌 쪽을 만지지 않는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 RPE 식세포작용 및 RPE 세포 유전자 발현 연구와 같은 다른 방법을 수행하여 다양한 연령의 기증자 또는 연령 관련 황반변성이 있는 기증자의 Bruch's membrane이 오버레이 RPE 세포 기능에 영향을 미치는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 연령 관련 황반변성 분야의 연구자들이 Bruch의 멤브레인 생체 외 모델 시스템에서 AMD의 병인학 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.