중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

이 방법론의 전반적인 목표는 고정된 세포에서 미세소관 및 중간 필라멘트에 대한 2D 이중 색상 D-STORM 이미징을 수행하기 위해 샘플 준비에서 이미지 획득 및 재구성에 이르기까지 최적의 실험 조건을 만드는 것입니다. 이 방법은 중간 필라멘트 및 미세소관과 같은 조밀하고 복잡한 세포골격 네트워크 간의 물리적 상호 작용을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 형광 현미경으로 해결되지 않은 세포 구조를 관찰할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 아티팩트 생성을 제한하기 위해 샘플 준비 및 로브 연결 데이터 수집을 제어하는 것이 중요하기 때문에 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 U373 세포를 성장시킨 후 먼저 PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척하여 세포를 고정합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 예열된 추출 고정 용액의 웰당 1ml를 추가합니다.

세포를 실온에서 60초 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 세포골격 완충액에 희석된 갓 준비하고 예열된 4% PFA를 웰당 1밀리리터 추가합니다. 12웰 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 10분 동안 다시 넣습니다.

그런 다음 PFA를 제거하고 웰당 3ml의 PBS를 추가합니다. PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 글루타르알데히드의 자가형광을 소멸시키기 위해 PBS에 희석된 갓 준비한 10밀리몰 수소화붕소나트륨을 추가합니다.

실온에서 7분 동안 세포를 배양하고 재활용된 수소화붕소나트륨을 특정 용기로 옮깁니다. PBS를 사용하여 우물을 각각 5분씩 세 번 세척합니다. 그런 다음 PSB를 제거하고 PBS에 5%BSA를 차단 솔루션으로 추가합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 면역염색하고 버퍼에서 용액을 준비한 후, 라벨링된 세포가 포함된 커버슬립을 마그네틱 샘플 홀더에 장착합니다. 그리고 이미징 버퍼를 추가하여 챔버를 완전히 채웁니다. 뚜껑을 덮고 이미징 버퍼와 뚜껑 사이에 기포가 없는지 확인합니다.

앱솔루트 에탄올을 사용하여 샘플 바닥을 청소하고 누출이 없는지 확인합니다. 그런 다음 필요한 경우 그리스를 사용하여 샘플 홀드를 적절하게 밀봉합니다. 이미징을 수행하려면 현미경과 획득 소프트웨어를 켜십시오.

100-fold NA 1.46 objective, 1.6-fold Optivar lens 및 TIRF UHP 모드를 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 획득 매개변수를 설정합니다. Alexa Fluor 647로 표시된 비멘틴 필라멘트를 이미지화하기 위해 647 트랙을 만듭니다. 405 및 642 나노미터 레이저 라인과 LP 655 방출 필터를 선택합니다.

그런 다음 Alexa Fluor 555로 표시된 미세소관을 이미지화하는 555 트랙을 만듭니다. 561, 488 및 405 나노미터 레이저 라인을 선택하여 형광단과 BP 570 - 650 방출 필터를 이미징합니다. 다음으로 대물렌즈에 오일을 추가하고 샘플을 렌즈에 놓습니다.

그런 다음 위치 탭을 선택하고 형광 램프의 셔터를 엽니다. 초점을 찾고 접안렌즈를 사용하여 이미징할 세포를 찾습니다. 그런 다음 조이스틱을 사용하여 필드를 중앙에 배치합니다.

획득 탭을 클릭하여 획득 모드로 돌아갑니다. 그런 다음 647 트랙을 선택하고 642 레이저 출력을 0.2%로 설정하고 405 레이저 출력을 최소값으로 설정합니다. 노출 시간을 50밀리초로 설정하고 게인을 50으로 설정합니다.

그런 다음 연속 획득 모드를 선택하여 화면에서 셀을 관찰합니다. 필드에 적어도 하나의 형광 구슬이 있는지 확인하십시오. 디스플레이에 자동 크기 조정 모드를 사용하고 초점을 조정합니다.

다음으로, snap을 클릭하여 vimentin 네트워크의 광시야 epifluorescence 이미지를 촬영하고 이미지를 저장합니다. TIRF 조명을 확인하려면 TIRF를 클릭하고, 연속을 누르고, 균일한 조명 필드를 갖도록 획득 매개변수를 조정합니다. 그런 다음 스냅을 누르고 이미지를 저장합니다.

555 트랙을 확인하십시오. 647 트랙의 선택을 취소하고 555 트랙을 선택합니다. 미세소관 네트워크의 상형광 이미지를 촬영하여 저장합니다.

그런 다음 TIRF 이미지를 가져와 저장합니다. 이제 647 트랙을 확인하십시오. 555 트랙의 선택을 취소하고 647 트랙을 선택합니다.

게인을 0으로 설정하고 노출 시간을 10밀리초로 설정합니다. 그런 다음 연속을 누릅니다. 대부분의 Alexa 647 염료를 어두운 상태로 펌핑하려면 642 나노미터 레이저 출력을 100%로 설정하십시오.

형광단이 깜박이기 시작하면 노출을 15밀리초로 늘리고 이득을 300으로 높입니다. 범위 표시기 모드를 사용하여 단일 분자 신호가 빨간색으로 표시된 것처럼 카메라를 포화시키지 않는지 확인합니다. 이 경우 채도가 사라질 때까지 게인을 줄이십시오.

비드는 인수 초기에 포화 상태로 유지됩니다. stop을 눌러 세포 관찰을 중단합니다. 온라인 프로세싱 도구를 확장하고 온라인 프로세싱 PALM을 클릭하여 획득 중 STORM 이미지를 시각화합니다.

최대 마스크 크기에 9를 사용하고 노이즈에 대한 최대 강도에 6을 사용합니다. 이제 획득 시작을 누릅니다. 획득하는 동안 필요한 경우 세포에 다시 초점을 맞춥니다.

노출 시간을 조정하고 최종적으로 0.001%에서 시작하는 405 나노미터 레이저 라인을 켜서 단일 분자 사이에 최소 1마이크로미터의 거리로 형광단의 중간 밀도를 유지합니다. 재구성된 이미지 아래의 히스토그램에서 국소화 정밀도의 피크가 10나노미터 또는 그 이하에 집중되어 있는지 확인합니다. 100만 개 이상의 현지화에 도달했을 때 중지를 눌러 영화를 종료합니다.

STORM 수집의 원시 데이터를 CZI 형식으로 저장합니다. 그런 다음 채널 도구에서 트랙 555를 선택하고 트랙 647을 선택 취소한 다음 트랙 555를 선택합니다. 그런 다음 연속 버튼을 누릅니다.

노출 시간을 30밀리초로 설정하고 게인을 0으로 설정합니다. 그런 다음 488 및 561 레이저를 모두 100%로 설정하여 Alexa 555 염료를 어두운 상태로 펌핑합니다. 조명의 HILO 모드를 사용합니다.

형광단이 고갈되면 중지를 누릅니다. 게인을 250으로 설정하고 488 레이저를 50%로 줄입니다.범위 표시기를 사용하여 단일 분자가 카메라를 포화시키지 않는지 확인합니다. 이 경우 게인을 줄이십시오.

이제 획득 시작을 누릅니다. 획득하는 동안 채도 한계에 도달하기 위해 게인을 점진적으로 증가시키십시오. 405 나노미터 레이저 출력을 단계적으로 증가시켜 분자를 활성화하고 시야에서 중간 밀도에 도달합니다.

405 레이저가 약 15%일 때 488 나노미터 레이저 출력을 30%로 줄인 다음 488 레이저 출력을 높이면서 405 레이저 출력을 점진적으로 줄여 분자의 깜박임을 가능한 한 빠르고 중간 밀도로 유지하십시오. 최대 강도에서 561 여기 레이저와 결합된 488 레이저 라인은 형광단의 켜짐 및 꺼짐 속도를 모두 증가시키는 반면, 405 레이저 라인은 켜짐 속도만 증가시킵니다. 500, 000 또는 그 이상의 국소화에 도달했거나 더 이상 분자가 깜박이지 않을 때 수집을 중지합니다.

그런 다음 STORM 수집의 원시 데이터를 CZI 형식으로 저장합니다. PAL-Drift 도구를 사용하여 이미지 재구성을 수행하려면 최대 8개 크기의 자동 세그먼트가 있는 모델 기반 보정 유형을 선택합니다. 드리프트가 수정될 때까지 연속으로 적용을 여러 번 누릅니다.

이 모델 기반 보정은 드리프트를 수정하는 교차 상관 분석을 기반으로 하는 알고리즘을 적용합니다. PAL 필터 도구를 사용하여 가장 잘 국소화된 분자만 선택하여 STORM 이미지의 모양을 개선합니다. 예를 들어, 국소화 정밀도를 30나노미터로, PSF를 120-180나노미터로 제한합니다.

PAL-Render 도구를 사용하면 5 또는 10 나노미터의 픽셀 해상도와 텍스트 프로토콜에 따른 매개변수를 사용할 수 있습니다. 95% 값으로 자동 동적 범위 HR 렌더링을 선택하고 90% 값으로 자동 동적 범위 SWF를 렌더링합니다. 그런 다음 최상의 품질 렌더링을 선택합니다.

처리 탭의 PALM 메뉴에서 PALM 변환을 선택합니다. 선택을 누른 다음 적용합니다. 마지막으로, 생성된 이미지를 CZI가 아닌 LSM 형식으로 저장합니다.

이 그림은 Alexa 647로 면역 라벨링된 비멘틴 필라멘트의 D-STORM 이미지의 일반적인 예를 보여줍니다. 해상도의 증가는 표준 광시야 현미경으로 획득한 이미지와 비교하면 명확하게 관찰할 수 있습니다. 이 그래프에 제시된 형광 강도 프로파일은 초고해상도 현미경 이미징이 비멘틴 다발의 해상도를 허용한다는 것을 보여줍니다.

D-STORM 해상도는 번들에 존재하는 필라멘트의 수를 계산하기에 충분합니다. 다음은 Alexa 647 및 Alexa 555로 각각 면역 표지된 비멘틴 및 미세소관 네트워크의 이중 색상 D-STORM 이미징의 일반적인 예입니다. 좋은 vimentin 이미지는 마이크로미터 제곱당 최소 5, 000개의 국소화와 미세소관의 경우 마이크로미터 제곱당 2, 500개의 국소화를 가져야 합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 3일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이미징될 단백질에 대한 고정 및 매개변수화 방법을 적용하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 글루타르알데히드만 사용한 고정은 중간 필라멘트에 대해서는 좋지 않은 결과를 제공하지만 미세소관 고정에는 가장 좋습니다.

갓 준비된 샘플과 용액, 특히 pH를 신중하게 조정해야 하는 MEA를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 나노 세포 구조의 형태를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 중간 필라멘트 및 미세소관의 2D 이중 색상 D-STORM 이미지의 시료 준비, 이미지 획득 및 재구성을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일부 솔루션, 특히 PFA, NABH4로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용, 화학 물질 후드 아래에서 작업, 특정 쓰레기통 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.