Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

이 절차의 전반적인 목표는 인간 여성 생식관의 다른 해부학적 구획에서 수지상 세포를 분리하여 표현형 및 기능적 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 여성 생식기의 조직 상주 수지상 세포에 관한 주요 질문, 예를 들어 특정 하위 집합의 해부학적 구획화 및 기능적 특성과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 당사의 조직 분해 프로토콜이 표면 마커를 절단하지 않아 하룻밤 배양이나 세포 활성화 없이 수지상 세포를 즉시 분리할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 인간 여성의 생식관에서 수지상 세포를 분리하는 데 최적화되어 있지만, 다른 면역 세포나 수지상 세포를 다른 조직에서 분리하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Fiona Barr와 Jared Fortier입니다. 변형된 HBSS로 조직을 헹구는 것으로 이 절차를 시작합니다.

조직을 100 x 15mm 제곱 페트리 접시에 넣고 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 약 3ml의 소화 효소 칵테일을 추가합니다. 조직을 안정화하기 위해 겸자를 사용하는 동안 메스로 다져 소화 효소 칵테일에 노출되는 조직의 표면적을 늘립니다. 티슈를 작은 조각으로 자릅니다.

모든 조직 조각을 덮을 수 있도록 충분한 소화 효소 칵테일을 추가하고 페트리 접시에 뚜껑을 놓습니다. 섭씨 37도에서 약 80rpm의 회전기로 5%의 이산화탄소를 넣고 45분 동안 배양합니다. 회전기 속도가 거품을 흘리거나 생성하지 않고 소화 효소 칵테일을 완전히 혼합하는지 확인하십시오.

45분 후, 4X 및 10X 대물렌즈가 있는 도립광 현미경으로 조직 준비를 시각화합니다. 성공적인 효소 분해는 이 대표적인 이미지에서 볼 수 있듯이 상피 시트와 땀샘을 방출해야 합니다. 멸균 환경에서 단일 세포를 분리합니다.

먼저 홀더가 있는 팽팽한 250마이크로미터 메쉬를 150 x 15mm 제곱의 페트리 접시에 넣고 메쉬가 페트리 접시 표면에서 약 0.5cm 위에 있는지 확인합니다. 다음으로, 2ml의 변형된 HBSS로 메쉬를 적시고 소화된 조직을 메쉬로 옮깁니다. 10밀리리터 주사기 플런저의 평평한 표면을 사용하여 소화된 다진 조직을 메쉬를 통해 부드럽지만 단단히 갈아줍니다.

조직 조각이 완전히 분산되면 메쉬와 홀더를 페트리 접시보다 2-3cm 위로 올리고 3ml의 변형된 HBSS로 헹구어 추가 세포를 회수합니다. 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 새 페트리 접시 위로 약 2-3cm 위에 홀더가 있는 20마이크로미터 메쉬를 놓고 2밀리리터의 변형된 HBSS로 적십니다.

세포 현탁액을 그물망에 통과시키고 6ml의 변형된 HBSS로 헹굽니다. 혼합 세포 현탁액을 수집하고 500회 g에서 10분 동안 원심분리합니다. 액체를 흡입하고 펠릿을 변형된 HBSS 4ml에 재현탁합니다.

밀도 구배 원심분리를 위해 3ml의 폴리자당 용액 위에 혼합 세포 현탁액을 겹쳐 놓습니다. 실온에서 500회 g으로 브레이크 없이 30분 동안 원심분리기. 다당(polysucrose) 용액 상단에서 흰색 띠를 모아 PBS로 세척합니다.

농축된 혼합 세포 현탁액이 수집되면 10X 대물렌즈가 있는 광학 현미경에서 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 10분 동안 세포 현탁액에 있는 모든 세포를 스핀다운합니다. 상층액을 완전히 흡인하고 버리십시오.

그런 다음 죽은 세포 제거 비드를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 컬럼 상단에 30마이크로미터 필터를 놓아 남아 있는 조직 파편이나 세포 응집체를 유지합니다. 필터와 컬럼을 데드 셀 제거 버퍼로 헹굽니다.

그런 다음 세포 현탁액을 적용하고 비드 표지된 세포가 자기 컬럼을 통해 흐르도록 합니다. 3ml의 사체 제거 버퍼로 컬럼을 4번 헹굽니다. 살아있는 세포를 포함하는 플로우 스루를 수집합니다.

죽은 세포를 제거한 후 세포를 스핀다운합니다. 상등액을 제거하고, 세포 펠릿을 자기 선택 완충액에 재현탁액, 7 개의 세포에 1 곱하기 10 당 80 마이크로 리터의 완충액을 재현 탁시킵니다. 수지상 세포 집단의 양성 선택을 위해 CD1a 또는 CD14 마그네틱 비드를 추가하고 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다.

자기 선택 버퍼로 셀을 세척하고, 스핀다운하고, 버퍼를 완전히 제거하고, 최소 500마이크로리터의 자기 선택 버퍼에 셀을 재현탁합니다. 컬럼을 자석에 부착하고 컬럼 상단에 30마이크로미터 필터를 추가하여 남아 있는 조직 파편이나 세포 응집체를 유지합니다. 필터와 컬럼을 마그네틱 선택 버퍼로 헹굽니다.

세포 현탁액을 컬럼에 적용합니다. 3ml의 자기 선택 버퍼로 세 번 헹굽니다. 컬럼을 15ml 튜브로 옮깁니다.

5ml의 자기 선택 버퍼를 추가하고 플런저를 적용하여 컬럼에서 선택한 세포를 분리합니다. 순도를 높이려면 새 컬럼을 사용하여 회수된 세포에 대해 정제 단계를 반복합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유세포 분석 및 현미경 검사를 통해 세포 순도를 평가합니다.

이 분석을 시작하기 전에 naive T 세포는 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포에서 분리됩니다. PBS로 미접촉 T세포를 두 번 세척합니다. 500마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁합니다.

프로토콜의 나머지 부분은 어둠 속에서 수행됩니다. 생물 안전성 캐비닛에서 세포를 부드럽게 와류로 가열하면서 500마이크로리터의 세포 증식 염료 2X 용액을 세포에 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.

10%human AB 혈청이 함유된 5ml의 세포 배양 배지를 세포에 첨가하여 세포 라벨링을 중지합니다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 약 500 회 g에서 7 분 동안 세포를 원심 분리하십시오.

배지를 흡인하고 10%human AB 혈청이 있는 5ml의 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다. 마지막 원심분리 전에 셀 분취량을 계산하십시오. 세 번째 세척 후 원하는 세포 농도에서 10% 인간 AB 혈청으로 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.

수지상 세포 동종 순수 T 세포 공동 배양을 시작하려면 분리된 수지상 세포와 순수 T 세포를 수지상 세포 대 T 세포의 비율이 1:15인 96웰의 둥근 바닥 플레이트에 플레이트화합니다. 세포가 웰 중앙에 위치하도록 약 500배 g에서 3분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 섭씨 37도에서 6일 동안 배양합니다.

현미경 검사로 세포를 모니터링합니다. 6일 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유세포 분석을 통해 세포 증식을 평가합니다. 이 그래프는 각 여성 생식관 구획, 자궁경부, 자궁경부경부 및 자궁경부에서 조직 처리 및 죽은 세포 제거 후 회수된 생존 세포의 총 수 범위를 보여줍니다.

마그네틱 비드 분리 후 조직 그램당 회수된 생존 가능한 수지상 세포의 수는 다음과 같습니다. 분리된 세포의 수지상 형태는 Giemsa 염색 후 현미경 검사에 의해 결정되었습니다. bead isolation 전후의 표현형 마커의 발현은 유세포 분석에 의해 결정되었습니다.

CD1a 양성 및 CD14 양성 비드 분리 후 순도는 85 및 92% 사이였습니다.수지상 세포 기능을 평가하기 위해 동종 자극 분석이 수행되었습니다. 증식 중 T 세포 클러스터 형성은 증식 염료 염색에 의해 확인되었습니다. 그런 다음 증식을 유세포 분석으로 정량화했습니다.

여기에 표시된 것은 혼합 세포 현탁액에서 서로 다른 수지상 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략입니다. multicolor plot의 각 게이트 모집단은 다음 패널에 표시됩니다. 게이팅 전략에 따라 특정 수지상 세포 부분 집합이 식별됩니다.

조직 수지상 세포는 희귀한 집단이기 때문에 세포 수가 적을 것으로 예상됩니다. 일단 숙달되면 조직에서 수지상 세포를 분리하는 것이 적절하게 수행되면 4-5시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 조직을 효소적으로 소화 및 처리하여 단일 혼합 세포 현탁액을 생성하고 추가 특성 분석을 위해 수지상 세포의 자기 비드 선택을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.