Name: Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 학습하세요 인간 여성 생식관에서 수지상 세포를 분리하는 방법으로 표면 마커를 보존하여 즉각적인 세포 분리가 가능합니다. 이 기술은 면역학 및 생식 생물학 연구에 활용됩니다.

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NIH 지원 연구는 AI102838 및 AI117739 (CRW)을 부여 합니다. 우리는 기술 지원을 위한 리처드 Rossoll 감사합니다. 흐름 cytometric 분석은 DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37)에 의해 (P30GM103415-15)에서 공유 리소스에에서 실시 됐다.

인체와 관련 된 연구는 헬싱키의 선언에 표현 하는 원칙에 따라 실시 했다. 연구는 다트머스 대학 기관 검토 위원회와 보호의 인간의 과목 (CPHS)를 위한 위원회에 의해 승인 되었다. 서 면된 동의 다트머스-히치콕 병원 (레바논, NH) hysterectomies를 받고 HIV 음성 여성에서 수술 전에 얻은 했다. 숙련 된 병리학 ECX, 병 적인 장애의 자유롭고 병 리의 사이트에서, CX, 및 그들에서 조직 샘플을 선택. 혈액 샘플은 다트머스 히치콕 의료 센터에서 모집 하는 자원 봉사 건강 한 기증자 로부터 얻은 했다. 혈액 기증자 했다 익명입니다. 수술 실에서 갓 고립 된 전각, CX, 및 ECX 조직 고립과 분류 사전 별도, 살 균 하는 폴 리 프로필 렌 튜브에 우리의 실험실에 전송에 대 한 병 리로 옮겨 졌다.
1. 효소 소화의 조직
참고: 살 균 물질을 사용 하 고 생물 안전 캐비닛에서 작동.
<ol><li>수정 된 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 페 놀 레드, 100 U/mL 페니실린 스, 0.35 g/L NaHCO3, 20 mM HEPES 1 x HBSS를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>효소 칵테일을 준비 (수정 HBSS, 450 U/mL 콜라 4, 0.01% [wt/집] deoxyribonuclease, 2 mg/mL D-포도 당). 살 균 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 이상적으로,의 사용, 하루에 소화 효소를 준비 하지만 저장용-20 ° C에 얼 수 있다. 반복 및 주기를 해빙 하지 마십시오.</li>
	<li>수정 HBSS와 100 x 15 m m2 배양 접시에서 조직 린스. 조직의 사용 가능한 금액에 따라 페 트리 접시 크기와 사용 하는 효소 칵테일의 볼륨 조정 (단계 1.4.2 아래 참조). 참고: 조직 병 리, 1-10에서 배열에서 얻은 수술 샘플에 따라 크기가 다양 합니다.</li>
	<li>일회용 메스와 집게 물리적 처리:<ol>
<li>절단 하면서 건조를 방지 하기 위해 조직에 소화 효소 칵테일의 약 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 조직을 안정화 하 고 칵테일 소화 효소에 노출 하는 직물의 표면 영역을 증가 하는 메스를 말하다. 작은 조각 (< 2mm 측에)에 조직을 잘라. 모든 조직 조각 (5 mL/g 조직)를 충당 하기 위해 충분 한 소화 효소 칵테일을 추가 합니다. 페 트리 접시에 뚜껑을 놓습니다.</li>
		<li>5% CO2 45 분 흘리 고 또는 거품을 생산 하지 않고 철저 하 게 혼합 소화 효소 칵테일을 회전 속도 확인을 위해 약 80 rpm에 회전에 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 X 거꾸로 가벼운 현미경으로 조직 준비 10 X 목표를 시각화. 참고: 소화, 후 작은 조직 조각 및 표시 상피 땀 샘을 포함 하 여 혼합된 셀 서 스 펜 션 존재 해야 ( 그림 1A참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 단일 셀의 물리적 분리
<ol><li>메 마른 환경에서 홀더를 가진 긴장 된 250 µ m 메쉬를 150 x 15 m m2 페 트리 접시에 놓습니다. 메쉬 페 트리 접시의 표면 위에서 약 0.5 c m 인지 확인 합니다.</li>
	<li>메쉬 수정된 HBSS의 2 mL와 습식 및 메쉬에 소화 조직 전송.</li>
	<li>10 mL 주사기 플런저의 평평한 표면에 사용 하 여, 부드럽게 하지만 단단히, 갈기는 메시를 통해 소화 다진된 조직. 주의: 너무 적극적으로 연 삭 메시 손상 되며 세포 사망률 증가. 이 단계 결합 조직 및 점액에서 상피 세포와 stromal 세포 (면역 세포를 포함 하는) 별도 것입니다.</li>
	<li>조직 파편 철저 하 게 분산 되어, 일단 상승 메시 및 홀더 페 트리 접시의 3 mL와 린스 위의 2-3 cm HBSS 복구 추가 셀을 수정.</li>
	<li>세포 현 탁 액을 수집 합니다. 페 트리 접시에 수정된 HBSS의 2 mL와 젖은 홀더 20 µ m 메쉬를 배치 합니다. 들고 메쉬 망을 통해 세포 현 탁 액을 부 어 2-3 cm 배양 접시와 수정된 HBSS 6 mL와 린스. 참고:이 단계는 메쉬를 통과 하는 단일 셀에서 위에 유지 됩니다 상피 시트 분리 됩니다. 통해 흐름 혼합된 셀 서 스 펜 션, 면역 세포 및 stromal 섬유 아 세포를 포함 하는.</li>
	<li>혼합된 셀 펜션과 10 분 Aspirate 액체에 대 한 500 x g에서 원심 분리기를 수집 하 고 펠 릿 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 대 한 수정된 HBSS 4 mL에 resuspend.</li>
	<li>아니 브레이크와 혼합된 세포 현 탁 액 3 mL 이상 polysucrose 솔루션 및 30 분 동안 500 x g에서 상 온에서 원심 분리기의 레이어. Polysucrose 솔루션의 위에서 흰색 밴드를 수집 하 고 PBS로 세척. 참고:이 분수 농축된 혼합된 세포 현 탁 액, 면역 세포에 풍부 하 고 일부 stromal 섬유 아 세포를 포함 하는.</li>
</ol>3. 죽은 세포 제거
참고: 죽은 세포 (> 20%)의 큰 비율에에서 있는 농축된 혼합된 세포 현 탁 액 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후, 자석 구슬 죽은 세포 제거 것이 좋습니다. 죽은 세포는 긍정적인 자기 구슬 선택 과정을 방해할 수 있기 때문에 제거 될 필요가 있다.
<ol><li>10 X 목적으로 가벼운 현미경에는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 농축된 혼합된 세포 현 탁 액 (500 g, 10 분, 4 ° C)의 모든 셀을 아래로 회전 합니다. 완전히 발음 하 고는 상쾌한 삭제. 1 x 107 총 셀 (라이브 및 죽은), 제조업체의 지침에 따라 당 죽은 세포 제거 구슬의 100 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>30 µ m 필터 자석 열에, 셀 서 스 펜 션 적용 놓고 자기 열을 구슬 표시 된 셀을 허용 합니다.</li>
	<li>권장된 (3 mL)으로 죽은 세포 제거 버퍼 열을 씻어. 흐름을 통해 라이브 셀을 포함 하는 수집 합니다. 죽은 세포 제거 후 셀 복구의 범위는 그림 1B에서 제공 됩니다. 참고: 이러한 셀 phenotypical 연구 (제 5) 얼룩이 cytometry 수행을 사용할 수 있습니다 또는 DC 절연 (제 4) 계속.</li>
</ol>4. DC 정화 긍정적인 자기 구슬 선택에 의해
<ol><li>죽은 세포 제거 (3.2 단계), 다음 셀 아래로 회전 하 고 상쾌한, 제거 하 고 셀 펠 릿 1 x 107 셀 (PBS, 0.5% 열 비활성화 인간의 AB 혈 청 (HS), 2 mM EDTA) 당 80 µ L 자석 선택 버퍼에 resuspend.</li>
	<li>DC 인구의 긍정적인 선택에 대 한 CD1a 또는 CD14 자석 구슬 (20 µ L 자기 당 구슬 1 x 107 셀) 제조 업체의 지침에 따라 추가 합니다. 4° c.에서 15 분 동안 품 어
</li>
	<li>자기 선택 된 셀을 세척 하 고 스핀 다운, 버퍼를 완전히 제거. 자기 선택의 500 µ L의 최소 셀 resuspend</li>
	<li>자석에 열을 연결 하 고 모든 나머지 세포 덩어리를 유지 하기 위해 열 상단 30 µ m 필터 추가. 필터 및 자기 선택 버퍼 권장 열 린스.</li>
	<li>열에 세포 현 탁 액을 적용 합니다. 마그네틱 선택 3 번 린스 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 열을 전송, 자기 선택 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 열에서 선택한 셀을 출시 플런저를 적용.</li>
	<li>순도 높이려면 새 열을 사용 하 여 복구 된 세포 단계 4.4-4.6을 반복 합니다. 마그네틱 비드 선택 후 셀 복구의 범위는 그림 1C에서 제공 됩니다.</li>
</ol>5. 셀 순도의 평가: Flow Cytometry 그리고 현미경 검사 법
<ol><li>항 체 cytometry에 대 한 얼룩:<ol>
<li>20%를 포함 하는 PBS의 106 셀 100 µ L x 1 resuspend 열 비활성화 Fc 수용 체를 차단 하 고 얼음에 10 분 동안 품 어 버렸습니다.</li>
		<li>붙일 항 체 및 죽은 세포의 식별을 위해 시 약 분류는 원하는 추가 (예, 섹션 6.5 참조). 설정 하는 게이츠 고 보상 비즈를 사용 하 여 보상에 대 한 하나의 얼룩 컨트롤을 준비 하나 (FMO) 컨트롤 마이너스 형광을 설정 합니다. 사용 하는 항 체의 예는 표 1에 주어진 다. 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>자기 선택의 2 mL로 세포 세척. 참고: EDTA의 존재는 흐름 cytometric 분석에 대 한 응집 하는 세포의 형성을 피하기 위해 해야 합니다. 스핀 다운 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>튜브 당 2 %paraformaldehyde 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정.</li>
		<li>교류 cytometer10,11에 샘플을 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열 (예를 들어, cytospin) 스핀과 Giemsa 얼룩 형태 분석을 사용 하 여:<ol>
<li>자기 선택의 200 µ L 셀 resuspend</li>
		<li>5 분 동안 스핀에 스핀 열 로드. 슬라이드를 완전히 건조 보자.</li>
		<li>수정 슬라이드 2 분 린스에 대 한 100% 메탄올에 침수에 의해 슬라이드 이온된 수로 그리고 건조 공기를 허용.</li>
		<li>표준 Wrights Giemsa 얼룩을 수행 합니다. 오신 셀 커버 하 고 10 분 동안 품 어, 이온을 제거 된 물으로 씻어 말리 면. Wrights Geimsa 얼룩과 셀 커버, 1 분 동안 품 어, 이온을 제거 된 물으로 헹 구 고 건조 한 공기.</li>
		<li>준비 (그림 2A, 40 X 목표) 거꾸로 현미경으로 검사 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 수용자 자극 DC 세포 기능을 평가 하기 위해 분석 결과
<ol><li>해 동 냉동된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)<ol>
<li>10% 셀 문화 미디어 따뜻한 HS 37 ° c</li>
		<li>적은 양의 언된 셀 미디어는 cryotube에 남아 때까지 37 ° C 물 목욕에는 cryotube를 배치 하 여는 PBMCs를 녹여. 메 마른 환경에서 미리 데워 진된 셀 문화 미디어 10%의 10 mL에는 cryotube의 내용을 전송 15 mL 튜브에 HS.</li>
		<li>원심에서 ~ 500 x g 7 분에 대 한 미디어를 제거, 펠 릿을 분산, 셀 문화 미디어 10 %HS, 그리고 원심 분리기의 10 mL에는 PBMCs resuspend 셀.</li>
		<li>세척 단계는 제 3 시간을 반복 합니다. 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>순진한 T-셀 선택:<ol>
<li>부정적인 선택 자기 항 체 셀 선택 키트를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 순진한 T-세포를 분리.</li>
		<li>절연, 후 CD45RA 및 CCR7 항 체를 사용 하 여 순도 확인 하십시오. 참고: 일반적인 순도 > 99% naïve T 세포입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>순진한 T 세포 확산 염료 얼룩이 지기:<ol>
<li>600 µ L 셀 확산 염료, 염료를 보호 하는 빛에 노출에서의 2 배 솔루션의 준비.</li>
		<li>순진한 T-세포 2 워시 x PBS. 500 µ L PBS에 셀 resuspend</li>
		<li>부드럽게 vortexing 동안 biosafety 내각에 셀 순 T-세포를 확산 염료의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37° c.에서 10 분에 대 한 셀을 품 어
</li>
		<li>세포 배양 10%의 5 mL을 추가 하 여 셀 라벨 중지 셀에 HS. 5 분, 빛 으로부터 보호에 대 한 얼음에 품 어.</li>
		<li>원심에서 셀 ~ 7 분, 500g x 미디어, 발음 및 세포 배양 10%의 4 ° C에 셀 resuspend HS. 3 세척의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 마지막 원심 분리 이전 계산 셀의 약 수를 가져가 라. 참고: 일반적으로, 최종 순 T-셀 번호 초기 PBMC 세포 수의 15%와 5% 사이 범위 것입니다.</li>
		<li>10%로 셀 문화 미디어 셀 resuspend 원하는 셀 농도에서 HS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC 수용자 naïve T 세포 공동 문화:<ol>
<li>1시 15분에서 격리 된 Dc와 순진한 T-세포는 96-글쎄, 라운드-하단 접시에서 접시 T-세포에 Dc의 비율. 3000 및 5000 셀/잘 Dc 범위에 대 한 최적의 수를 확인 합니다.</li>
		<li>원심에서 접시 ~ 500 x g 3 분 셀 우물의 센터에서 위치 확인. 셀 연락처 적절 한 신호 발생을 위해 중요 하다.</li>
		<li>6 일 동안 37 ° C에서 품 어. 확산 발생, 현미경 검사 법 (그림 3A)와 우물에 표시 되는 셀의 클러스터를 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow cytometry 확산을 평가 하기 위해 얼룩:<ol>
<li>6 일 후 세포 cytometry에 의해 시험 될 수 있다. Cytometry에 대 한 공동 문화 얼룩.</li>
		<li>PBS에서 노란색 생존 염료 (최대 방출 572 nm)의 2 배 솔루션을 준비 합니다. 참고: 혈 청 하지 않고 PBS 사용 하 여 중요 한, 혈 청으로 단백질 방해 염료).</li>
		<li>에 세포 격판덮개 원심 ~ 5 분 동안 500 x g.</li>
		<li>상쾌한의 100 µ L을 제거 합니다. 참고:이 시점에서 수집 하 고 저장 성 요인의 별도 분석을 위한 상쾌한.</li>
		<li>두 번 PBS로 세포 세척: 150 µ L/잘 PBS의 추가에 원심 ~ 5 분 동안 500 x g 150 µ L를 피펫으로와 상쾌한의 제거. 각 잘에 남아 상쾌한의 50 µ L 인지 확인 합니다.</li>
		<li>각 우물에 2 x 생존 염료의 50 µ L를 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>부 화, 중 원하는 항 체 마커 마스터 혼합물을 준비 합니다. 예: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITC, 등
</li>
		<li>각 우물에 항 체의 혼합물을 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>셀 2 워시 x PBS + 2 %HS: 150 µ L/잘 PBS + 2%의 추가 HS. 원심에서 ~ 500 x g를 피펫으로와 상쾌한의 5 분 제거 150 µ L에 대 한.</li>
		<li>100 µ L / 2% 파라 포름알데히드의 우물을 추가 하 여 셀을 수정. 필요한 경우: 폴 리 프로필 렌 흐름 cytometry 튜브에 세포와 미디어를 전송. 튜브 4 ° C에서 보관 고 흐름 cytometric 분석까지, 빛에서 보호 될 수 있습니다.</li>
		<li>교류 cytometer에서 읽기 튜브입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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점 막 Dc는 조직 환경, 조직3입력 일단 그들의 표현 형 및 기능 변경에 의해 강하게 영향을 희귀 세포 인구. 혈액 파생 하는 동안 Dc 매우 유용한 모델, 그들은 조직에서 발견 되는 DC 인구의 다양성을 완전히 대표 하지 않는다. 따라서, 점 막 Dc의 독특한 특성을 이해, 조직에서 1 차 셀의 격리 필요 하다. Dc는 FRT에 다른 해 부 사이트에서의 절연 DC 기능에서 생체 외에서 연구 하 고 DC 하위 집합 및 해 부 위치 사이 비교 기회를 제공 합니다.
여기 우리는 생체 외에서 기능적 특성의 평가 대 한 인간의 FRT 조직에서 Dc의 정화를 허용 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이후 Dc 낮은 숫자에 점 막 사이트에서 찾을 수 있습니다, 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 및 자석 구슬 가진 셀 격리 전에 죽은 세포 제거 하 여 조직 세포 준비를 풍부 하 게 하는 프로토콜을 개발 했다. 죽은 세포의 ...

FRT 이식 및 임신1하면서 병원 균에 대 한 보호의 이중 기능이 있다. 이 작업을 수행 하는 FRT는 들 에게만, 각 해 부 지역 표시 하는 독특한 조직학, 면역학, 및 기능적 특성1.
DCs 점 막 표면에 존재 확인 폐, 창 자, 그리고 성 기 요로에 미생물과 접촉 하 고 잠재적인 병원 균2에 대 한 면역 감시를 제공 합니다. DCs 프라임 순진한 T-세포 및 적응 면역 반응3는 독특한 기능이 있다. Dc는 FRT에도 정자 및 성공적인 임신4있도록 개발 태아에 있는 등 외국 항을 용납을 전문화 된다. 따라서, 위치에 따라 DC 형 및 기능 있을 것 이다 고유. 그것은 그들의 숫자, 표현 형, 고 기능 조직 환경 존재 하는3에 의해 수정 되는 Dc는 조직 환경에 의해 강하게 영향을 알려져 있다. 따라서, FRT Dc 전염 성 질환, 임신, 그리고는 FRT에 암에 재생 하는 역할을 이해 하려면 거주 Dc 혈액 파생된 DC 모델은 FRT 조직에서 발견 규제 복잡성을 해결 하기 위해 적절 한 이후 공부 필요.
인간의 조직 특성 거주 Dc 세포 점 막 조직에의 낮은 수와 인간의 조직 샘플을 얻기 어려움 도전적 이다. Dc에서 FRT immunohistochemistry5,6, 조직 내의 셀 위치에 대해 알려줍니다 하지만 기능 연구 하는 걸로 하 고 셀 마커 분석 될 수 있는 식별 하는 수에 제한 됩니다를 사용 하 여 연구 에 한 번. 또한, 단일 세포 격리 프로토콜 흐름 cytometric 분석에 대 한 개발된7,,89되었습니다. 이러한 프로토콜의 일부 활용 마이그레이션하는 그 세포를 분리 하는 Dc의 철새 용량. 이러한 메서드는 일반적으로 하룻밤 외피 및 활성화 된 Dc의 선택을 요구 하지만 안정 된 상태에서 Dc의 연구에 대 한 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 FRT, endometrium (EM)에서 다른 해 부 사이트에서 Dc를 분리 하는 프로토콜 최적화 된 hysterectomy 표본을 사용 하 여, endocervix (CX), 그리고 ectocervix (ECX), phenotypical 및 기능 분석을 가능 하 게. 비 분해 효소 소화 프로토콜을 사용 하 여, 우리 조직 세포 활성화 없이 셀 고립과 흐름 cytometric 특성을 소화 후 즉시 진행할 수 있습니다. 다 색 cytometry 사용 하 고 적응 하는 셀의 낮은 수에 대 한 기능 연구, 우리 식별 하 고 Dc는 FRT.의 다른 사이트에서의 드문 하위 집합의 특성

<table><tbody><tr><td>행크스 밸런스 솔트 솔루션 (HBSS)</td><td>하이클론</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>하이클론</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>헤페스 (1M)</td><td>하이클론</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 IV</td><td>시그마</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>데옥시리보뉴클레아제 I</td><td>워딩턴 생화학</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당<td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um Stericup 500 mL&nbsp; 필터</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm 폴리스티렌 접시</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>처리된 세포 배양 접시</td></tr><tr><td>Isotemp 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5.0% CO2</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um 나일론 메쉬</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um 나일론 메쉬</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, 페놀 레드, 1 L</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액(PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>데드 셀 제거 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>사전 분리 필터(30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS칼럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS 멀티 스탠드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 세포 증식 염료</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 라운드 바닥판</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>좀비 옐로우 생존 염료</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-human</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 color, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 color, VBR</td></tr></tbody></table>

phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

인간의 수지상 세포 (DCs) 점 막 조직에서의 특성화 샘플, 취득에 어려움으로 인해 도전 이며 DCs의 낮은 수는 조직 당 제시. 그러나, 표현 형 및 Dc의 기능 조직 환경에 의해 수정 되는, 그것은 조직 거주 DC 인구 분석, 혈액 파생 Dc 불완전 이후 반영 Dc의 복잡 한 조직에 필요한. 여기 우리는 인간 여성 생식 관에서 (FRT) 자 군 절제 견본을 사용 하 여 phenotypical 및 기능 분석을 허용 하는 Dc를 분리 하는 프로토콜을 제시. 조직 소화 혼합 세포 현 탁 액, 긍정적인 자기 구슬 선택 다음 단일 셀을 생성 하는 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. 우리의 조직 소화 프로토콜 않습니다 하지 쪼개 다 표면 마커, phenotypical 기능 분석 Dc 야간 보육 또는 셀 활성화 없이 안정 된 상태에 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 면역 세포 유형의 격리 또는 다른 조직에서 Dc의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.

다음 조직 소화, 상피 시트와 땀 샘의 릴리스 관찰 될 수 있다, 그림 1A;와 같이 이것은 효소 소화 성공적인 나타내는 긍정적인 컨트롤입니다. 총 실행 가능한 세포 및 조직의 그램 당 복구 Dc의 숫자도 표시 됩니다 그림 1B 및 그림 1C, 각각. 면역 세포 밀도 원심12,13이전 stromal 세포의 5-30% 사이 나타냅니다. 그림 2 는 형태 (그림 2A)와 격리 된 Dc의 순도 (그림 2B, C). 2 라운드 ...

여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 여성 생식관의 다른 해부학적 구획에서 수지상 세포를 분리하여 표현형 및 기능적 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 여성 생식기의 조직 상주 수지상 세포에 관한 주요 질문, 예를 들어 특정 하위 집합의 해부학적 구획화 및 기능적 특성과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 당사의 조직 분해 프로토콜이 표면 마커를 절단하지 않아 하룻밤 배양이나 세포 활성화 없이 수지상 세포를 즉시 분리할 수 있다는 것입니다.이 방법은 인간 여성의 생식관에서 수지상 세포를 분리하는 데 최적화되어 있지만, 다른 면역 세포나 수지상 세포를 다른 조직에서 분리하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Fiona Barr와 Jared Fortier입니다. 변형된 HBSS로 조직을 헹구는 것으로 이 절차를 시작합니다.조직을 100 x 15mm 제곱 페트리 접시에 넣고 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 약 3ml의 소화 효소 칵테일을 추가합니다. 조직을 안정화하기 위해 겸자를 사용하는 동안 메스로 다져 소화 효소 칵테일에 노출되는 조직의 표면적을 늘립니다. 티슈를 작은 조각으로 자릅니다.모든 조직 조각을 덮을 수 있도록 충분한 소화 효소 칵테일을 추가하고 페트리 접시에 뚜껑을 놓습니다. 섭씨 37도에서 약 80rpm의 회전기로 5%의 이산화탄소를 넣고 45분 동안 배양합니다. 회전기 속도가 거품을 흘리거나 생성하지 않고 소화 효소 칵테일을 완전히 혼합하는지 확인하십시오.45분 후, 4X 및 10X 대물렌즈가 있는 도립광 현미경으로 조직 준비를 시각화합니다. 성공적인 효소 분해는 이 대표적인 이미지에서 볼 수 있듯이 상피 시트와 땀샘을 방출해야 합니다. 멸균 환경에서 단일 세포를 분리합니다.먼저 홀더가 있는 팽팽한 250마이크로미터 메쉬를 150 x 15mm 제곱의 페트리 접시에 넣고 메쉬가 페트리 접시 표면에서 약 0.5cm 위에 있는지 확인합니다. 다음으로, 2ml의 변형된 HBSS로 메쉬를 적시고 소화된 조직을 메쉬로 옮깁니다. 10밀리리터 주사기 플런저의 평평한 표면을 사용하여 소화된 다진 조직을 메쉬를 통해 부드럽지만 단단히 갈아줍니다.조직 조각이 완전히 분산되면 메쉬와 홀더를 페트리 접시보다 2-3cm 위로 올리고 3ml의 변형된 HBSS로 헹구어 추가 세포를 회수합니다. 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 새

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

여기서는 자세하게 마우스 장 돌기 세포 (DC가)와 macrophages의 급속한 분리를위한 방법론. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성은 세포 정렬 뒤에 자석 구슬 농축은 기능적 연구를위한 매우 순수 인구를 얻을하는 데 사용하는 동안 멀티 컬러 플로우에게 cytometric 분석을 사용하여 수행됩니다.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수...

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

이 연구는 체외 수지상 세포(DC)를 얻기 위한 두 가지 다른 인간 단핵구 분리 방법을 비교합니다. 단핵구는 부착에 의해 선택되거나 자기 분리에 의해 음적으로 강화됩니다. MDDC 생존력, 증식 및 CD11c/CD14 표면 마커 발현과 함께 단핵구 수율 및 생존율을 두 방법 간에 비교합니다.

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

여기에서는 상피내 감마 델타 T 세포의 분석을 위해 인간 상경부 내 림프구를 얻기 위한 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 자성 비드 또는 세포 분류에 의해 자궁경부 감마 델타 T 세포의 정제를 위해 확장될 수 있습니다.

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할...

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

학습하세요 인간 여성 생식관에서 수지상 세포를 분리하는 방법으로 표면 마커를 보존하여 즉각적인 세포 분리가 가능합니다. 이 기술은 면역학 및 생식 생물학 연구에 활용됩니다.

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

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