Name: 해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 배우세요 BiCAP 기법을 이용하여 상호작용하는 단백질 복합체를 특이적으로 분리하고 세포 신호 전달 경로를 연구하는 방법을. GFP 나노바디를 활용한 이 기술은 암 연구 등 다양한 생물학적 맥락에 적용됩니다.

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D.R.C 암 연구소 NSW 동료 이며 D.N.S 이전 암 연구소 NSW 동료 이었다. 이 원고에 제시 하는 연구 결과 암 연구소 NSW (13/FRL/1-02과 09/CDF/2-39), NHMRC (프로젝트 그랜트 GNT1052963), 과학 재단 아일랜드 (11/SIRG/B2157), 뉴 사우스 웨일즈 과학 및 의료 연구, 이용 가족에 의해 투자 되었다 친목 그리고 모스 틴 가족 재단입니다. J.F.H.와 텍 오스트레일리아 대학원 포상의 수령인 이었다.

1. 플라스 미드 복제
참고: N-말단 이나 C-말단 관심사의 유전자의 융합 V1 또는 v 2 태그와 플라스 미드 벡터 생성, BiFC 대상 벡터 입금 되었습니다 Addgene와 [N 맨끝 태그: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). 태그 C 터미널: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. 관심사의 유전자/s 복제 진행 정지 codons 없이 특정 재조합 호환 항목 벡터 (즉, pDONR223 또는 pENTR221), 복제에 있이 필요 합니다. 많은 호환 클론 이미 포유류 게놈 컬렉션 (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/)를 포함 한 다양 한 플라스 미드 컬렉션 내에서 사용할 수 있습니다.
<ol><li>적절 한 BiFC 대상 벡터의 attR 사이트 사이 관심사의 유전자를 삽입 하는 재결합 반응을 수행.<ol>
<li>0.2 mL 튜브에 150 ng 항목 벡터, 150 ng BiFC 대상 벡터, 그리고 8 µ L TE 버퍼 (pH 8.0)를 추가 합니다.</li>
		<li>2 µ L recombinase 효소 혼합 추가 ( 재료의 표참조). 잘 혼합 하 고 짧게 원심.</li>
		<li>하룻밤 실 온에서 또는 16 ° C에서 1 시간에 대 한 반응을 품 어.</li>
		<li>1 µ L 성분을 K 솔루션을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 배양 하 여 반응을 중지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열-충격-유능한 세포 ( 재료의 표참조) LR 반응 제품으로 변환: 참고: 모든 기본 변형 알만 사용할 수 있습니다이 시점에서 Ccdb 항 독 소, 삽입을 포함 하는 플라스 미드의 특정 선택 방지 하는 포함 되어 있지 않습니다.<ol>
<li>얼음에 유능한 세포를 해 동 하 고 14 mL 둥근 바닥의 폴 리 프로필 렌 튜브에 세포의 50 µ L를 전송.</li>
		<li>셀에 반응 제품의 1 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 얼음에 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>열 충격 45 42 ° C 물 목욕에 미 2 분 동안 얼음에 즉시 반환.</li>
		<li>LB 매체 1 mL을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 흔들어와 품 어.</li>
		<li>암 피 실린 포함 하 10 cm 한 천 격판덮개에 변환 접시 (100 µ g/mL)와 하룻밤 37 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BiFC 플라스 미드의 정화입니다.<ol>
<li>개별 식민지에서 플라스 미드 정화, 큰 원뿔 플라스 크를 파운드 미디어의 100 mL를 추가 하 고 추가 암 피 실린 (100 µ g/mL). 여러 식민지에, 14 mL 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 튜브에 파운드 미디어의 5 mL을 추가 하 고 추가 암 피 실린 (100 µ g/mL).</li>
		<li>살 균 접종 루프를 사용 하 여 한 천 배지에서 단일 식민지 선택. LB 미디어로 접종 루프를 놓고 짧게 혼합 합니다.</li>
		<li>알루미늄 호 일 원뿔 플라스 크의 상단을 커버 하 고 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>Transfection 학년 플라스 미드 DNA는 표준 maxiprep 또는 midiprep 플라스 미드 DNA를 사용 하 여 생산 정화 키트 ( 재료의 표참조)10. 흡 광도 스펙트럼에 의해 DNA의 품질을 평가 합니다. 참고: DNA는 A260/A280 비율이 있어야 &gt; 1.8와 A260/A230 비 &gt; 2.0. 이 시점에서, 화면 삽입 및 태그의 효율적인 표현에 대 한 검사를 여러 개의 개별 식민지 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 배양과 Transfection
참고: BiFC 벡터의 transfection에 대 한 그것은 높은 효율과 비교적 동질적인 transfection를 달성 하는 것이 중요입니다. 벡터 어떤 표준 transfection 시 약, 호환 됩니다 그리고 transfection 조건에 따라 최적화 되어야 합니다. 질량 분석을 수행 하려면 우리가 일반적으로 10cm 요리 내 셀이 수 또한 될 비례 축소 된 작은 요리 또는 더 적은 물자를 필요로 하는 실험에 대 한 번호판을 비록 문화.
<ol><li>FBS 및 페니실린/스 (1: 100) 씨 1.0 × 106 HEK293T 셀 10 cm에 10% 보충 DMEM 미디어의 10 mL와 함께 요리.</li>
	<li>Transfection 버퍼의 500 µ L로 각 BiFC 벡터의 2.5 µ g을 희석 ( 재료의 표참조) 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서.</li>
	<li>10 µ L transfection 시 약의 추가 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>10 s, 후 간단히 원심 분리기 소용돌이 혼합물. 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>접시에 dropwise DNA transfection 혼합물을 추가 합니다. 시간의 BiFC 퓨전 단백질 상호 작용을 위한 접는 금성, fluorophore 성숙, 일반적으로 8 ~ 24 h에 대 한 충분 한 길이 대 한 셀을 품 어. 참고: 금성에 대 한 피크 여기는 515 nm, 그리고 그것의 피크 방출은 528 nm, 비록이 GFP 형광을 시각화 하도록 설정 표준 형광 현미경을 사용 하 여 볼 쉽게입니다.</li>
</ol>3. 샘플 준비
<ol><li>
Lysates 수확
	<ol>
<li>Lysate 컬렉션, 사전 준비 세포 세포의 용 해 버퍼 [50 mM Tris HCl (pH 7.4) 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) 비 이온 세제 ( 재료의 표참조)]. 4 ° c.에 게</li>
		<li>수확 직전 프로 테아 제 억제 물과 인산 가수분해 효소 억제 물 ( 재료의 표참조) 세포 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 보충. 얼음에 보충된 세포 세포의 용 해 버퍼를 유지 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 PBS에 두 번 세척 세포입니다. PBS를 발음 하 고 차가운 보충된 세포 세포의 용 해 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 얼음에 접시를 놓고, 전체 영역에 걸쳐은 버퍼를 확보.</li>
		<li>약 5 분 동안 얼음에서 알을 품고 다음 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 세포를 긁어와 미리 냉장된 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 전송.</li>
		<li>수집 centrifuging 세포질 파편 제거 lysate 18000에 4 ° C와 전송 5 분 × g 신선한 microcentrifuge 튜브로 상쾌한을 허가. 참고:이 시점에서 lysate 하거나 사용할 수 있습니다, 즉시-80 ° c.에 저장 그것은 또한 transfection 그리고 친 화력 정화의 효율성 유효성을 검사할 수 있도록 lysate 원유의 약 수를 유지 하 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
친 화력 정화 참고: BiCAP 격리 단계 ( 재료의 표참조) agarose 구슬에 활용 된 GFP nanobody를 사용 하 여 수행 됩니다.<ol>
<li>Agarose 구슬 1 ml PBS (샘플 당 20 µ L) + 10 µ L 초과 적절 한 볼륨을 세척 하 여 준비 합니다. 300 x g에서 구슬 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>각 lysate 샘플 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>엔드-투-엔드 회전 4 ° C에서 2 시간에 대 한 샘플을 품 어. 참고:이 시점에서 샘플 수 준비 SDS 페이지와 서 부 럽, 또는 분석에 대 한 질량 분석에 의해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
서쪽에 게 더 럽 히기 위한 BiCAP eluant의 준비입니다.
	<ol>
<li>세포 세포의 용 해 버퍼에 세 번 세척 하 고 g x 300에 구슬 원심</li>
		<li>적절 하 게 희석된 샘플 버퍼의 50 µ L에 씻어 구슬 resuspend ( 재료의 표참조)과 2-3 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열. 참고: 샘플 준비를이 방식으로 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 몇 달 동안.</li>
		<li>SDS 페이지 및 관심의 잘 다른 단백질으로 v 1 태그 및 v 2 태그 ( 재료의 표참조),11 를 더럽혀 서 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
질량 분석에 대 한 BiCAP eluant의 준비입니다. 참고: 적어도에서 샘플을 준비 하는 것이 좋습니다 레이블 없는 양적 (LFQ) 질량 분석에 의해 분석을 위한 강력한 통계적 인 힘을 위해 quadruplicate.<ol>
<li>300 x g와 세척 세제 없이 세포 세포의 용 해 버퍼에 6 번에서 구슬을 원심합니다 이것은 모두 과잉 단백질 및 질량 분석 분석을 방해할 것 이다 세제를 제거 하는 데 필요한입니다. 즉시 다음 단계를 진행 하거나 저장-80 ° C. 에서 구슬
</li>
		<li>60 µ L에 구슬 trypsinize 버퍼 1 [2 M 요소, 50 mM Tris HCl (pH 7.5), 5 µ g/mL의 트립 신]. 구슬 800 RPM에서 떨고 thermomixer에서 27 ° C에서 30 분 동안 소화 하실 수 있습니다.</li>
		<li>짧게 구슬, 원심 다음 상쾌한 및 전송 microcentrifuge 튜브 ( 재료의 표참조)를 수집 합니다.</li>
		<li>25 µ L에 구슬 워시 버퍼 2 [2 M 요소, 50 mM Tris HCl (pH 7.5), 1 m m dithiothreitol], 바운드 단백질을 줄이기 위해.</li>
		<li>하나의 microcentrifuge 튜브에 구슬과 상쾌한 수영장. 하룻밤 실 온에서 발생 하는 소화를 허용 합니다.</li>
		<li>각 샘플을 iodoacetamide (초순에 5 mg/mL)의 20 µ L을 추가 하 여 샘플을 알 고 30 분 동안 어둠 속에서 품 어.</li>
		<li>각 샘플 1 µ L trifluoroacetic 산 (TFA)를 치료 하 여 소화를 억제 합니다. 이 단계 또한 준비 단계 팁에 대 한 샘플 시 어 지 다 것입니다.</li>
		<li>구문 C18 무대 누적 6 레이어에 의해 1mm 고체 상 추출 C18 (Octadecyl) 막 디스크 ( 재료의 표참조) 200 µ L micropipette 팁에 팁. 각 샘플에 대 한 하나의 팁을 준비 합니다.</li>
		<li>메탄올, 함께 무대 팁 습식 및 50 µ L 0.1% (v/v) trifluoroacetic 산 (TFA), 80% (v/v) 이기 equilibrate.</li>
		<li>50 µ L 0.1% (v/v) TFA 팁 세척.</li>
		<li>무대 끝에 acidified 펩 티 드를 로드 하 고 elute 0.1% (v/v) TFA, 80% (v/v) 이기에 두 단계를 사용 하 여.</li>
		<li>진공 집중 장치를 사용 하 여 샘플을 증발.</li>
		<li>필요한 경우, 저장-80 ° c.에 건조 펩 티 드</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 질량 분석입니다.
<ol><li>5% 포 름 산, (초순)에서 2% 이기의 15 µ L에서 샘플을 resuspend.</li>
	<li>신중 하 게 nanoLC HPLC 시스템에는 LC 접시 및 장소에 6 µ L 로드 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>팩을 20 cm, 75 µ M 내부 직경 열 1.9 µ m C18 고정 단계 입자 ( 재료의 표참조). 각 열에 5 µ L 펩타이드를 로드 합니다.</li>
	<li>Elute 펩 티 드 분 250 nL/140 분 이상 이기의 선형 그라디언트를 사용 하 고 nanoelectrospray에 의해 nanoLC HPLC 시스템에 결합 된 선형 트랩 Quadropole (LTQ) 하이브리드 질량 분석기로 소개.</li>
	<li>140 분 시간 그라데이션을 통해 스캔 당 톱 10 가장 풍부한 이온에 대 한 협동 MS 데이터를 수집 합니다. 일시적인 바이어스를 최소화 하기 위해 각 샘플 사이의 실행 하는 BSA와 데이터 수집 및 교환 순서를 무작위.</li>
</ol>5입니다. 분석
<ol><li>MaxQuant 소프트웨어 버전 1.2.7.4에서 기본 설정을 사용 하 여 원시 MS 데이터를 처리 하 고 MaxQuant R 소프트웨어 환경3에서 수정 된 버전의 페르세우스 통계 분석 워크플로 사용 하 여 출력을 분석. 참고:이 시점에서 통계 분석 워크플로 그림 2에 요약. 간단히, LFQ 농도 MaxQuant를 사용 하 여 식별 하는 단백질의 변형 되며 정규화와 돌리기 뒤 필터링. 상호 작용 단백질 이합체 쌍의 학생의 t 시험 및 Benjamini Hochberg 보정 여러 비교에 대 한 일반적인 배경 바인더 제외, 금성 컨트롤 비교해보면 식별 됩니다. 데이터 품질은 개별 히스토그램, 다중 회귀, 그리고 계층적 클러스터링의 비교에 의해 확인 됩니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57109/57109fig2.jpg"> 그림 2: 통계 분석 워크플로 개요. MaxQuant를 사용 하 여 처리 하는 원시 질량 분석 데이터에서 확인 된 단백질의 LFQ 농도 분석 하는 데 사용 하는 통계 분석 파이프라인의 흐름 다이어그램. 녹색 상자: 필터링, 파란색 상자: 변환/정상화/스케일링, 갈색 상자: 데이터 품질 관리, 노란색 상자: 반 정량 제외/비교 분석, 회색 상자: 통계 분석. 이 그림은 재 fromCroucher 외3 Reprinted AAAS 허가입니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57109/57109fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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</ol>

저자 공개할 게 없다

BiCAP 개별 구성 요소와 그들의 경쟁 바인딩 파트너3을 제외 하는 동안 특정 단백질 이합체를 격리 하기 위한 강력한 방법입니다. BiCAP은 BiFC6라는 형광 단백질 보완성 분석 결과의 적응을 기반으로 합니다. BiFC와 근접 결 찰 분석을 포함 하 여 기존 방법 시각화 하 고 라이브 셀7상호 작용 단백질 정량에 광범위 하 게 사용 되었습니다 하지만 격리 및에서 형성 이합체의 효과적인 수단을 제공 하지 않았다 이러한 상호 작용입니다.
단백질 보완성 기술도 진화를 계속 하는 친 화력 정화를 기반으로 합니다. Schopp 연구진이 최근 단백질 이합체 근접 라벨 BioID14를 사용 하 여에 대 한 시스템을 설명 합니다. Biotin 리가 BirA 두 상호 작용 단백질의 분할 파편을 융합 하 여 그들은 중재 하...

단백질 복잡 한 어셈블리 많은 신호 경로1,2의 spatiotemporal 특이성을 유지 하는 핵심 과정 이다. 이 규제 역할의 중요 한 특성은 넓게 인식 된다, 그러나 실험적인 기술이이 단지 유심히 사용할 수의 부족이 이다. 대부분 상호작용체학 연구 개별 단백질, 또는 개별 복잡 한 부품의 순차 농축 상호 작용에 초점. 여기 선물이 특정 단백질 이합체의 고립에 대 한 기술 파트너3바인딩 경쟁 형성 복합물 뿐만 아니라 구성 요소 단백질의 개별 moieties 제외 하는 동안. 우리는이 기술을 라는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP), 그것은 기존 단백질 조각 보완성 분석 결과의 분자 형광 보완성 (BiFC), 조합의 소설 사용을 GFP와 그 파생 상품 나 란 특정 재조합 nanobody (참조 테이블의 재료).
전형적인 단백질 조각 보완성 분석 결과 분할 luciferase4, β-galactosidase5, 녹색 형광 단백질 (GFP)6 ( 등 기자 들의 파편을 융합 하는 "미끼" 및 "먹이" 단백질의 표현에 사용 그림 1A). 미끼와 먹이 단백질의 상호 작용을 통해 분할 기자 도메인, 미끼의 상호 작용을 허용 하는 기능 구조로 refold 및 시각에 계량 단백질을 먹이 것이 좋습니다. BiCAP 만든이 기술은의 버전에서 적응 시켰다 GFP 변종 비너스의 조각을 사용. 형광 단백질 보완성 분석 실험은 살아있는 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 시각화를 위한 인기 있는 방법 하지만 지금까지이 하나의 함수7로 제한 되었습니다. BiCAP 나타냅니다 중요 한 사전을 이와 관련,이 기술은 뿐만 아니라 시각화, 하지만 또한 격리와 심문 결과 단백질 단백질 상호 작용의 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57109/57109fig1.jpg"> 그림 1: BiCAP 기술 뒤에 구조 교장. (A) 회로도 분자 형광 보완성 표시 뒤에 교장 개요 '미끼' 그리고 '먹이' 단백질 태그로 N 맨끝 V1 또는 v 2의 C-터미널 전체 길이 금성 단백질의 파편. GFP nanobody (녹색)과 재결합 금성, (회색) V1 및 V2 (오렌지) 조각 (PDB 취득 3OGO)의 위치를 보여주는 사이 상호 작용 인터페이스 (사이안)의 (B) 구조 분석. 이 그림은 재 fromCroucher 외3 Reprinted AAAS 허가입니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57109/57109fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
기법 BiCAP 선호도 낮은 수준의 상호 작용 그들의 퓨전 파트너 사이 발생 하지 않는 한 연관 금성 (v 1과 v 2 라는)의 2 개의 비 형광 파편의 사용 합니다. 이 경우 두 개의 분할 도메인 refold fluorophore (그림 1B)6의 기능 β 배럴 구조. BiCAP의 주요 혁신 재조합 GFP nanobody, β-총 신 GFP (금성 같은 변종)의 재결합 올바르고 접힌 fluorophore ( 에만에 3 차원 epitope를 인식의 소개에서 온다 그림 1B)8. 결정적인 GFP nanobody 개별 비너스 조각 중 하나에 바인딩할 하지 않습니다. 이 두 가지 단백질의 그들의 자신의 지, 그 취득 하는 방법에서 화학적으로 유도 된, 강제 상호 작용9의 사용 보다 더 대표적인 결과 복잡 한 형성 후에 단백질 이합체의 분리를 촉진 한다.
BiCAP 다운스트림 응용 프로그램 역할 이러한 단지 신호 변환에서의 우리의 이해의 세분성을 향상 시킬 수와 잠재적으로 결합 될 수 있는 다중 단백질 복합물에 특히 초점을 맞추고 있는 강력한 기술입니다. . 그것은 또한 단백질 상호 작용 제자리의 시각화를 허용의 중요 한 기능을 포함. 날짜 하려면, BiCAP 수용 체 티로신 키 니 아 제 (RTK) 이합체3위하여 분석의 효과적인 방법으로 입증 되었습니다 하지만이 방법의 적응성 거의 모든 단백질 상호 작용의 맥락에서 채택 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>LR Clonase II Plus 효소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12538120</td><td>pDEST BiFC 목적지 벡터에 대한 Gateway 클로닝(1단계)에 필요한 재조합</td></tr>효소 <tr><td>Proteinase K, 재조합, PCR 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 바닥이 둥근 폴리프로필렌 튜브</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Roche Diagnostics Korea</td><td>10835242001</td><td>100 &mu에서 제조 된 재고 용액; 증류수에 있는 g/mL.</td></tr><tr><td>Miniprep 키트</td>, <td>Promega Corporation</td>, <td>A1330</td><td></td></tr>, <tr><td>Maxiprep 키트</td>, <td>Life Technologies, Australia</td><td>K2100-07,</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td>, <td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr>, <tr><td>FBS</td><td>Life Technologies, Australia</td><td>10099-141</td><td></td></tr>, <tr><td>Penicillin/Streptomycin,</td><td>Life Technologies, Australia</td><td>15070-063</td><td></td></tr>, <tr><td>jetPRIME transfection buffer,</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME 트랜스펙션 시약</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP (인산가수분해효소 억제제)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4906837001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr>세포 <tr><td>스크레이퍼</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotek Gmbh</td><td>gta-100</td><td>GFP 나노바디는 아가로스 비드에 결합됨</td></tr><tr><td>N-말단 GFP 단클론 항체&nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-118P</td>는 <td>BiFC 벡터 내에서 V1 태그를 검출합니다</td></tr><tr><td>C-terminal GFP 단클론 항체</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>BiFC 벡터 내에서 V2 태그를 검출합니다</td></tr><tr><td>Sample buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td>1 mL &beta;-mercaptoethanol이 보충되었습니다.</td></tr><tr><td>염기서열분석 등급 변형 트립신</td><td>Promega Corporation</td><td>V5117h</td><td></td></tr><tr><td>LoBind 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Point of Care Diagnostics</td><td>0030 108 116</td><td></td></tr><tr><td>요오도아세트아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149-5G</td> 초순수 트리플루오로아세트산<td>에서 5mg/mL로 준비</td></tr><tr><td>- Sequanal Grade</td><td>Thermo Fisher</td><td>10628494</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore 고체상 추출 C18 디스크(옥타데실) - 4.7cm</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-386-2</td><td>스테이지 팁을 준비하려면 적절한 크기의 홀 펀치를 사용하여 1mm 디스크를 절단합니다. 또는 미리 준비된 스테이지 팁을 구입할 수도 있습니다(아래 참조).</td></tr><tr><td>C18 스테이지 팁, 10 & 마이크로; L 베드</td><td>Thermo Fisher</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>포름산 OPTIMA LC/MS 등급 50mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>FSBA117-50</td><td></td></tr><tr><td>1.9 &mu; m C18 ReproSil 입자</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.</td><td>고정상 입자</td></tr><tr><td>아세토니트릴 OPTIMA LC/MS 등급&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>FSBA955-4</td><td></td></tr><tr><td>Easy-nLC HPLC&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>비이온 세제 (100%)</td></tr><tr><td>DH5&alpha; 세포</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>열 충격 대응 세포</td></tr></tbody></table>

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (bicap)에 의해

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

단백질 복합물의 조립은 많은 세포 신호 통로의 규칙을 기본 중앙 메커니즘입니다. 어떻게 이러한 동적 단백질 복합물 특정 생물학 응답을 직접 하기 위해 여러 소스 로부터 신호를 통합 하 고 어떻게이 많은 질병 설정에서 폐지 된다 생물 의학 연구의 주요 초점 해독 됩니다. 이 주요 생 화 학적 메커니즘의 중요성에도 불구 하 고이 다 분자 신호 복합물의 구체적이 고 민감한 deconvolution을 촉진할 수 있다 실험적인 기술의 부족이 이다.
여기이 단점 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP) 불리는 우리 나 란 특정 nanobody는 단백질 보완성 분석 결과의 조합을 통해 해결 됩니다. 이 새로운 기술은 특정 격리 및 유엔 complexed 개별 단백질과 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 하는 복합물의 배타에 상호 작용 단백질의 어떤 쌍 든 지의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.
BiCAP 기술은 다양 한 다운스트림 실험적인 분석 실험에 이며이 기술에서 제공 하는 특이성의 고차 수 더 nuanced 조사 단백질 복잡 한 어셈블리의 역학에 현재 가능한 것 보다 사용 하 여 표준 선호도 정화 기술입니다.

재결합 v 1과 v 2의 생성을 복제의 사용에 따라 BiFC pDEST 플라스 미드를 가진 관심사의 유전자, 단백질의 상호 작용 쌍을 포함 하는 두 개의 플라스 미드의 공동 transfection 후 금성 형광 신호 생성 될 수 약 8-24 시간입니다. 수에서 단백질 상호 작용 셀 라인의 선택으로 인해 발생 될 수 있습니다 긍정적인 신호가 없을 경우에는 낮은 transfection 효율 또는 BiFC 태그의 방향을 하지 최적입니다. 이러한 각 시나리오에 대 한 문제 해결은 아래 설명 되어 있습니다.
우리 이전 HEK 293T 세포의 공동 transfection 후 ~ 16 시간 다른 단백질 종류의 숫자에 대 한 긍정적인 상호 작용을 관찰 했습니다. 이 플라즈마 멤브레인 (그림 3A)<sup class="xref...

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

이 방법은 단백질과 단백질 복합체의 동적 조립이 신호 경로와 세포 행동을 제어하는 방법과 같은 세포 생물학 및 생화학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복잡하지 않은 개별 단백질과 경쟁하는 결합 파트너를 제외하면서 상호 작용하는 두 단백질을 특이적으로 분리할 수 있다는 것입니다. 우리는 유방암에서 수용성 티로신 키나아제 이합체화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 이 방법을 사용하지만, 다른 생리학적 환경이나 질병에도 적용할 수 있습니다.우리는 GFP 나노바디가 GFP와 다른 형광 단백질의 3차원 항원결정기를 인식했다는 것을 깨달았을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 가졌습니다. 먼저 150나노그램의 진입 벡터, 150나노그램의 목적지 벡터, 8마이크로리터의 TE 버퍼를 0.2밀리리터 튜브에 추가합니다. 다음으로 2마이크로리터의 재조합효소와 ZiMex를 넣고 두 가지를 간단히 원심분리합니다.실온에서 1시간 동안 반응을 배양한 다음 1마이크로리터의 Proteinase K 용액을 첨가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 반응을 중지합니다. 다음으로, 열 충격에 취약한 전지를 얼음 위에서 해동합니다. 그리고 50 마이크로 리터의 셀을 14 밀리리터의 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브로 옮깁니다.1마이크로리터의 반응 생성물을 세포에 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 섭씨 42도의 수조에서 45초 동안 세포를 열 충격으로 가한 후 세포를 얼음으로 되돌립니다.1ml의 LB 배지를 세포에 추가합니다. 그리고 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 암피실린이 함유된 10cm 한천 플레이트에 형질전환을 플레이트하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.플라스미드 정제를 시작하려면 암피실린과 LB 배지 100ml를 큰 원뿔형 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 접종 루프를 사용하여 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 제거합니다. 접종 루프를 LB 배지에 담그고 잠시 혼합한 다음 플라스크 상단을 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도에서 흔들면서 밤새 배양합니다.여기에서 transfection을 진행하기 전에 표준 Maxiprep plasmid DNA purification kit를 사용하여 plasmid DNA를 정제합니다. 먼저 10밀리리터의 DMEM이 포함된 10cm 접시에 HEK 293T 세포를 파종합니다. 그런 다음 각 이분자 형광 보체 벡터 2.5마이크로그램을 500마이크로리터의 형질주입 완충액에 희석합니다.10마이크로리터의 형질주입 시약을 넣고 혼합물을 10초 동안 와류로 가열합니다. 그런 다음 샘플을 간단히 원심분리하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로 DNA 형질주입 혼합물을 접시에 적가적으로 첨가합니다.그런 다음 8-24시간 동안 샘플을 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 cell lysis buffer와 supplemented cell lysis buffer를 준비합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻습니다.PBS를 흡인하고 1mm의 얼음처럼 차가운 보충제 세포 용해 완충액을 추가합니다. 다음으로 접시를 얼음 위에 놓고 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 제거하고 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.18, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 중력에 관을 세포질 파편을 제거하기 위하여 관을 분리기, 그 후에 새로운 마이크로 분리기 관으로 명확한 상등액을 옮기십시오. PBS 1 밀리리터에 적절한 양의 아가로스 구슬을 세척한 다음 300배 중력으로 구슬을 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로 각 샘플에 20마이크로리터의 아가로스 비드를 추가합니다.그리고 섭씨 4도에서 2시간 동안 종단 간 회전으로 배양합니다. 비드를 300배 중력으로 원심분리하고 세포 용해 버퍼에서 3회 세척합니다. 그런 다음 세척된 비드를 50마이크로리터의 희석된 샘플 버퍼에 다시 현탁합니다.마지막으로 샘플을 섭씨 95도에서 2-3분 동안 가열합니다. 이 연구에서는 BiCAP 방법을 사용하여 HEK293T 세포의 co-transfection 후 약 16시간 후에 여러 단백질 유형에 대한 긍정적인 상호 작용을 관찰합니다. Con-focal 현미경은 원형질막에서 RTKERBB2의 이합체화와 E3 리가제 UBR5에 대한 유비퀴틴의 결합을 관찰하는 데 사용됩니다.GFB 나노바디를 사용한 친화성 정제 후, 전체 길이 금성 조절 단백질과 상호 작용하는 V1 및 V2 태그 단백질만 co-transfection 샘플에서 검출할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 bi-molecular fluorescence complementation tag의 배치와 관심 단백질의 C-말단 또는 N-말단 중 하나를 최적화해야 한다는 것을 기억하십시오. 이것은 긍정적인 단백질/단백질 상호 작용을 관찰하는 데 필요합니다.이 동영상을 시청한 후에는 BiCAP 기법을 수행하는 방법과 관심 있는 단백질 상호 작용에 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 ChIPseek와 같은 많은 다운스트림 특성화 기술을 사용하여 전사 인자의 이합체화가 DNA 결합을 제어하는 방법과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

dissecting-multi-protein-signaling-complexes-bimolecular

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호...

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

이 비디오에서는 형태 특이적 단일 도메인 항체를 사용하여 특정 단백질 이량체를 검출하고 분리하는 BiCAP(bimolecular complementation affinity purification)을 시연했습니다.

Bimolecular Complementation Affinity Purification - 두 개의 상호 작용하는 단백질을 분리합니다.

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

배우세요 BiCAP 기법을 이용하여 상호작용하는 단백질 복합체를 특이적으로 분리하고 세포 신호 전달 경로를 연구하는 방법을. GFP 나노바디를 활용한 이 기술은 암 연구 등 다양한 생물학적 맥락에 적용됩니다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

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