해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

이 방법은 단백질과 단백질 복합체의 동적 조립이 신호 경로와 세포 행동을 제어하는 방법과 같은 세포 생물학 및 생화학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복잡하지 않은 개별 단백질과 경쟁하는 결합 파트너를 제외하면서 상호 작용하는 두 단백질을 특이적으로 분리할 수 있다는 것입니다. 우리는 유방암에서 수용성 티로신 키나아제 이합체화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 이 방법을 사용하지만, 다른 생리학적 환경이나 질병에도 적용할 수 있습니다.

우리는 GFP 나노바디가 GFP와 다른 형광 단백질의 3차원 항원결정기를 인식했다는 것을 깨달았을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 가졌습니다. 먼저 150나노그램의 진입 벡터, 150나노그램의 목적지 벡터, 8마이크로리터의 TE 버퍼를 0.2밀리리터 튜브에 추가합니다. 다음으로 2마이크로리터의 재조합효소와 ZiMex를 넣고 두 가지를 간단히 원심분리합니다.

실온에서 1시간 동안 반응을 배양한 다음 1마이크로리터의 Proteinase K 용액을 첨가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 반응을 중지합니다. 다음으로, 열 충격에 취약한 전지를 얼음 위에서 해동합니다. 그리고 50 마이크로 리터의 셀을 14 밀리리터의 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브로 옮깁니다.

1마이크로리터의 반응 생성물을 세포에 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 섭씨 42도의 수조에서 45초 동안 세포를 열 충격으로 가한 후 세포를 얼음으로 되돌립니다.

1ml의 LB 배지를 세포에 추가합니다. 그리고 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 암피실린이 함유된 10cm 한천 플레이트에 형질전환을 플레이트하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

플라스미드 정제를 시작하려면 암피실린과 LB 배지 100ml를 큰 원뿔형 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 접종 루프를 사용하여 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 제거합니다. 접종 루프를 LB 배지에 담그고 잠시 혼합한 다음 플라스크 상단을 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도에서 흔들면서 밤새 배양합니다.

여기에서 transfection을 진행하기 전에 표준 Maxiprep plasmid DNA purification kit를 사용하여 plasmid DNA를 정제합니다. 먼저 10밀리리터의 DMEM이 포함된 10cm 접시에 HEK 293T 세포를 파종합니다. 그런 다음 각 이분자 형광 보체 벡터 2.5마이크로그램을 500마이크로리터의 형질주입 완충액에 희석합니다.

10마이크로리터의 형질주입 시약을 넣고 혼합물을 10초 동안 와류로 가열합니다. 그런 다음 샘플을 간단히 원심분리하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로 DNA 형질주입 혼합물을 접시에 적가적으로 첨가합니다.

그런 다음 8-24시간 동안 샘플을 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 cell lysis buffer와 supplemented cell lysis buffer를 준비합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻습니다.

PBS를 흡인하고 1mm의 얼음처럼 차가운 보충제 세포 용해 완충액을 추가합니다. 다음으로 접시를 얼음 위에 놓고 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 제거하고 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

18, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 중력에 관을 세포질 파편을 제거하기 위하여 관을 분리기, 그 후에 새로운 마이크로 분리기 관으로 명확한 상등액을 옮기십시오. PBS 1 밀리리터에 적절한 양의 아가로스 구슬을 세척한 다음 300배 중력으로 구슬을 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로 각 샘플에 20마이크로리터의 아가로스 비드를 추가합니다.

그리고 섭씨 4도에서 2시간 동안 종단 간 회전으로 배양합니다. 비드를 300배 중력으로 원심분리하고 세포 용해 버퍼에서 3회 세척합니다. 그런 다음 세척된 비드를 50마이크로리터의 희석된 샘플 버퍼에 다시 현탁합니다.

마지막으로 샘플을 섭씨 95도에서 2-3분 동안 가열합니다. 이 연구에서는 BiCAP 방법을 사용하여 HEK293T 세포의 co-transfection 후 약 16시간 후에 여러 단백질 유형에 대한 긍정적인 상호 작용을 관찰합니다. Con-focal 현미경은 원형질막에서 RTKERBB2의 이합체화와 E3 리가제 UBR5에 대한 유비퀴틴의 결합을 관찰하는 데 사용됩니다.

GFB 나노바디를 사용한 친화성 정제 후, 전체 길이 금성 조절 단백질과 상호 작용하는 V1 및 V2 태그 단백질만 co-transfection 샘플에서 검출할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 bi-molecular fluorescence complementation tag의 배치와 관심 단백질의 C-말단 또는 N-말단 중 하나를 최적화해야 한다는 것을 기억하십시오. 이것은 긍정적인 단백질/단백질 상호 작용을 관찰하는 데 필요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 BiCAP 기법을 수행하는 방법과 관심 있는 단백질 상호 작용에 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 ChIPseek와 같은 많은 다운스트림 특성화 기술을 사용하여 전사 인자의 이합체화가 DNA 결합을 제어하는 방법과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.