Name: 영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 학습하세요 무척추동물 소비자의 지방산 대사를 추적하는 아이소토폴로그 프로파일링 방법을 통해 토양 생태계의 영양 전달과 먹이망 역학을 규명하는 기법을.

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R. Menzel과 도이치 가운데 (RU RU780/11-1)에 의해 L. Ruess의 재정 지원은 기꺼이 인정 했다. R. Nehring RU 780/10-1에 의해 투자 되었다. 마지막으로, 우리는 매우 감사 박사 헤이젤 Ruvimbo Maboreke에 우리의 원고 교정을 위해입니다.

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Isotopologue 프로 파일링
FAs에 13C 유통에서 양적 측면의 상세한 분석 탄소 음식 거미줄에 분할 할당을 최첨단 기술이 필요로 한다. 현재 작업 고용 13C를 평가 하기 위해 프로 파일링 isotopologue / 트로픽 상호 작용에 대 한 일반적인 FA biomarkers에12C 비율. 이 방법은 액체 크로마토그래피 (LC-MS)에 의해 아미노산 분석을 위해 잘 설립 이며, 병원 성 박테리아17,23에 있는 탄소 물질 대사의 수사를 위해 적용 되었다. 최근, isotopologue 프로 파일링 추가 개발한 작은 토양 무척 추 동물에 지질 식이 라우팅 연구 하는 도구로 Menzel 외. 24 때문에이 방법은 ...

토양 등 암호 서식 지, 영양 관계 주소로 어려운 고 추가 동물군의 작은 크기에 의해 제한 됩니다. 지난 10 년간 필드 조건1,2,3토양 동물의 먹이 전략을 정의 하기 위한 생체로 지방산의 사용에 특히 생화학 생태학, 발전을 보이고 있다. 이것은 리소스에서 지방산은 전체 분자 소비자 조직에 통합 될 수 있다는 사실에 기반, 프로세스 식이 라우팅4되 나. 지방산의 양도 3 영양 단계, 즉, 곰 팡이에서 Collembola5선 충을 통해 보고 되었습니다. 최근, 육 식 동물6,7 여겨졌다 고 토양 음식 웹에서 영양 마커로 지방산에 대 한 첫 리뷰 게시8,9되었습니다.
영양 상호 작용에 대 한 더 자세한 정보는 지방산 안정 동위 원소 (FA-SIP) 조사에 의해 달성 했다. 13C의 결정 /12C 비율 지방산 다이어트와 소비자에에서 돌리다 이진 링크를 관련된 탄소 흐름을 예측 하 고 지상파에 고용 되어 신선한 물, 그리고 해양 식품 거미줄10,11 ,,1213. 기본 가정은 식이 라우트된 지방산 효소 프로세스; 적용 되지 않습니다. 따라서, 그들의 13C 신호, 즉, 13C /12C 소비자에서 지방산의 비율은 다이어트1에 비슷합니다. 그러나, 먹이 사슬의 13C 서명의 점진적인 고갈 영양 연구14,,1516에 FA SIP의 광범위 한 응용 프로그램을 방해 함으로써 수 중 시스템에서 보고 되었습니다. 또한, 지상파 식품 웹에서 대부분 무척 추 동물의 지질 대사에 대 한 지식을 여전히 제한 됩니다.
소비자에서 지질 물질 대사 경로의 이해 영양 마커 지방산 식품 웹 생태에 양적 탄소 흐름의 결정에 대 한 의미의 사용을 위해 필수적 이다. 이 고려해, 13C-isotopologue 프로 파일링, 유망한 방법은 어떤 생물 학적 시스템17, 탄소 물질 대사의 조사에 대 한 어떤에 원리를 적용할 수 있습니다. 13탄소 C 표시 기판, 13C에서 대사 네트워크의 배포의 도입에 따라 하는 것은 소비자 쇼 특정 isotopologue 배포에서에서 생성 된 대사 제품부터 추적. 이 양적 핵 대사 공명 분광학18,19 또는 질량 분석20,21그것의 더 높은 때문에 낮은 바이오 매스와 후자에 선호 생물 학적 샘플에 의해 평가 될 수 있다 감도입니다.
Isotopologue 프로 파일링 성공적으로 아미노산에 적용 되었으며 vivo에서 탄소 물질 대사 세균성 병원 체17,,2223, 지방산에서 구현에 대 한 통찰력을 제공 하지만 산 뒤에 느껴 지 있다. 안정 동위 원소 표시 전조 지방산, 식이 라우팅 또는 β-산화, 토양 무척 추 동물 소비자에 통해 저하의 운명에 첫번째 상세한 분석 최근 수행한 Menzel 외. 24. 여기, 13C 지방산 이어서 자주 토양 무척 추 동물, Collembola, 키 하위의 isotopologue 분석 분류 관 실험 방법론 기본 제공 됩니다. 이 microarthropods는 좋은 모델 그들은 중요 한 구성 요소는 잘 그들의 영양 마커 지방산8,25에 대 한 조사를 하 고 토양 먹이 그물의 형성.
소비자에서 지질 물질 대사 경로의 이해 영양 마커 지방산 식품 웹 생태에 양적 탄소 흐름의 결정에 대 한 의미의 사용을 위해 필수적 이다. 현재 프로토콜 먹이 실험, 그리고 추출 및 지배적인 지질 분수 (중립 지질, 인지질)의 메 틸 화에 대 한 생 화 확 적인 절차 Collembola에서 실험실을 위한 설계 및 설정 제공 합니다. 그것은 isotopologue 구성 지방산의 질량 분석에 의해 분석 되는 방법을 보여 줍니다 고 관련된 수식 및 계산에 설명 합니다. 이 절차에서 결과: isotopologues 초과 하나 이상 (즉, 지방산 분자 이온 M+) 부모 이온의 질량의 비율 (i) 질량 단위 (M+ 1, M2, M+ 3, 등) 및 (ii) 전체 13 C 농축 지방산에서 13C 이라는 전조에서 파생. 이 방법은 일반적으로 이들은 성공적인 레이블 통풍 관을 위해 제어 된 조건 하에서 충분 한 수량에 culturable 및 후속 전제에 다른 어떤 약탈자 먹이 상호 작용에 적용할 수 있습니다 Collembola 사용, 비록 확인입니다.

<table><tbody><tr><td>neoLab-Round jars</td><td>neoLab</td><td>2-1506</td><td>69 x 40 mm, 10 pacs/pack</td></tr><tr><td>숯 활성화</td><td>Carl Roth</td><td>X865.1</td><td>p.a., 분말, CAS 번호 7440-44-0</td></tr><tr><td>Alabaster Dental</td><td>R&Ouml; HRICH-GIPSE</td><td>---</td><td>http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>칼 로스</td><td>7331.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr> <tr><td>메탄올</td><td>칼 로스</td><td>P717.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr> <tr><td>헥산</td><td>칼 로스</td><td>7339.1</td><td>HPLC &ge; 98 %</td></tr> <tr><td>tert -Butyl methyl ether (MTBE)</td> <td>Carl Roth</td><td>T175.1</td><td>HPLC &ge; 99,5 % </td></tr><tr><td>아세톤</td><td>칼 로스</td><td>7328.2</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>칼 로스</td><td>6771.1</td><td>p.a. &ge; 99 %, 펠릿</td></tr><tr><td>di-Natriumhydrogenphosphat</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>pa; 99 %, 물 자유로운</td></tr><tr><td>Na-dihydrogenphosphat Dihydrat</td><td>칼 로스</td><td>T879.1</td><td>p.a. &ge; 99 %</td></tr><tr><td>하이포아염소산(6N)</td><td>VWR</td><td>International26,115,000</td><td>AVS TITRINORM vol. 솔루션</td></tr><tr><td>Bond Elut(컬럼)</td><td>Agilent Tech.</td><td>14102037</td><td>HF 결합 Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK</td></tr><tr><td>Pr&auml; 파라텡글&아우믈; ser Duran</td><td>Glasger&auml; 테바우 Ochs</td><td>135215</td><td>&Oslash; 16 x 100 mm, 편리한 널과 통합된 PTFE/실리콘 가스켓이 있는 나사 캡</td></tr><tr><td>Supelco 37 컴포넌트 FAME 믹스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47885-U Supelco</td><td>10&nbsp; 메틸렌 클로라이드의 mg/mL, 분석 표준</td></tr><tr><td>FlowMesh</td><td>Carl Roth</td><td>2796.1</td><td>폴리프로필렌 메시, 약 0.3mm 두께, 1mm 스트랜드 간격</td></tr><tr><td>세균산 메틸 에스테르 (BAME) 믹스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td>10&nbsp; 메틸 카프로에이트의 mg/mL, 분석 표준물질</td></tr><tr><td>메틸 노나데카노에이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>74208</td><td>분석 표준물질 &ge; 98.0 %</td></tr><tr><td>헥사데칸산-1-13C(팔미트)</td><td>Larodan Fine Chemicals</td><td>78-1600</td><td>GC &ge; 98.0 % (13C: 99.0 %)</td></tr><tr><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>컴팩트 벤치탑 미디 농축기</td></tr><tr><td>Alpha 2-4 LDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>건조 매니폴드</td></tr><tr><td>MZ 2C NT</td><td>Vacuubrand GMBH</td><td></td><td>진공 펌프</td></tr><tr><td>Roto-Shake Genie</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>결합 로킹 및 회전 장치</td></tr><tr><td>XP64 마이크로 비교기</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>초고정밀 저울</td></tr><tr><td>GC-System 7890A</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>기체 크로마토그래프</td></tr><tr><td>7000 GC/MS 트리플 쿼드</td><td>애질런트 기술</td><td></td><td>트리플 쿼드 질량 분석기</td></tr><tr><td>7683B 시리즈 인젝터</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>시료 주입기</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>원심분리기(10ml 튜브 로터 포함</td></tr></tbody></table>)

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13c isotopologue 프로 파일링

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

지방산 (FAs) 식품 웹 생태에 유용한 biomarkers는 그들은 일반적으로 완전 한 분자로 동화 하 고 미성년자 또는 다른 영양 수준 사이 식이 라우팅 수 있도록 수정, 소비자 조직으로 전송 때문에. 그러나, FA 영양 마커 접근 토양 동물의 지질 대사에 한정 된 지식에 의해 아직도 방해 된다. 이 연구는 지방산 물질 대사 경로 두 개의 광범위 한 토양 Collembola, Protaphorura fimata , Heteromurus nitidus에 추적 프로그램으로 완전히 이라는 팔 미트 산 (13C16:0, 99 원자 %)를 사용합니다. 운명과이 전조의 대사 수정, 조사 하기 위하여 isotopologue 프로 파일링 하는 방법 제시, 단일 이온 모니터링을 사용 하는 질량 분석에 의해 수행. 또한, 업스트림 실험실 실험 먹이 추출 및 지배적인 지질 분수 (중립 지질, 인지질) 및 관련된 수식 계산의 메 틸 화 설명 되어 있습니다. Isotopologue 프로 파일링 하지만 수익률 13C 전조를 분류에서 파생 된 지방산에서 전체 13C 농축 않지만 isotopologues 부모 이온 (즉, FA 분자 이온의 질량 초과의 패턴 생성 M+) 각각의 표시 된 하나 이상의 질량 단위 (M+ 1, M2, M+ 3, 등)에 의해 FA. 이 지식을 de novo 생 합성에 비해 완전히 소비 FA의 식이 라우팅의 비율에 결론을 수 있습니다. Isotopologue 프로 파일링은 풀 영양 상호 작용을 토양 동물에서 지방산 대사의 평가 위해 유용한 도구로 서 좋습니다.

Collembola의 신선한 무게와 지질 콘텐츠 설명된 실험 과정에서 NLFAs 및 PLFAs의 내용을 변화 하지 않았다 크게 시간이 지남에, 표본의 신선한 무게 하지 크게24하지만 약간 증가 하는 반면. 두 매개 변수 Collembola 표본의 체력의 좋은 수준을 나타냅니다. 지방산 및 동위 원소 분석을 위한 샘플링 일에 해당 하는 실험을 통해 Collembola의 신선한 무게와 지질 콘텐츠 조사를 알고 있어야 합니다. Note는 무게의 손실 또는 실험 기간 동안 지질 콘텐츠 감소 테스트 생물의 감소 피트 니스 나타내고 파생된 데이터는 크게 의미를 잃게.
Isotopologue 검출 프로젝트를 프로 파일링 하는 isotopologue의 특별 한 중요...

지방산 영양 마커 접근, 즉, 전체 분자와 소비자 조직으로 전송으로 지방산의 동화 없이 또는 사소한 수정, 작은 토양 무척 추 동물의 지방 산 성 대사에 지식 격차에 의해 방해 된다. Isotopologue 프로 파일링 풀 영양 상호 작용 하는 귀중 한 도구로 제공 됩니다.

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

이 동위원소 프로파일링의 전반적인 목표는 무척추 동물 소비자에서 식이 지방산의 영양 전달을 추적하고, 연쇄 신장 또는 베타 산화와 같은 지질 대사 및 처리 과정을 추적하는 것입니다. 이 방법은 누가 누구를 먹는지와 같은 식품 웹 생태계의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 토양과 같은 수수께끼 같은 생태계에서 대답하기 쉽지 않은 질문입니다. 이 기술을 시연하는 것은 Liliane Ruess 교수 연구실의 석사 학생인 Dilara Simsek입니다.꼭 맞는 뚜껑이 있는 플라스틱 소우주를 준비하려면 석고 냄비에 파리 석고 9부와 건조 활성탄 1부를 섞습니다. 증류수 10부를 넣고 혼합물을 5분 동안 저어주지 않고 실온에 두십시오. 실험실 숟가락을 사용하여 걸쭉하고 수프 같은 농도가 될 때까지 기포를 피하기 위해 적당한 속도로 혼합물을 시계 방향으로 저어줍니다.그런 다음 혼합물을 약 1cm 높이까지 소우주에 붓습니다. 벤치를 부드럽게 두드리고 소용돌이쳐 석고를 매끄럽게 만듭니다. 멸균 주걱으로 추가된 기포와 고랑의 구멍은 비옥한 Collembola가 그곳에 알을 낳도록 장려할 수 있습니다.그러나 이 연구는 동일한 재현 가능한 조건을 갖기 위해 구멍과 고랑을 피했습니다. 소우주를 건조시킨 다음 적신 후 작은 메쉬 조각이 장착된 흡입 튜브를 사용하여 갓 부화한 Collembola 30개를 소우주의 석고 베이스로 옮깁니다. 칼 끝 정도의 과립 건조 베이커 효모를 식품으로 제공하고 적어도 일주일에 두 번 갱신하십시오.샘플링 날짜당 3개의 독립적인 반복을 계획합니다. 이 연구에서는 0일에서 7일과 14일째를 표본으로 추출했습니다. 섭씨 15도의 어둠 속에서 소우주를 배양하고 세포막의 유동성에 대한 요구 사항을 충족하기 위해 동물의 신진대사에 의해 지방산이 변경되므로 일정한 온도를 유지합니다.동물을 수확하려면 텍스트 프로토콜에 따라 계량한 직후 저울 팬에서 10ml 유리 시험관으로 동물을 조심스럽게 옮깁니다. 1ml의 HPLC 등급 메탄올을 사용하여 튜브를 채우고 분석할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 샘플의 각 배치에 대해 3개의 유리 시험관을 준비하고 보관을 위해 샘플에 적용된 메탄올을 줄인 후 블랭크를 포함한 각 샘플에 5ml의 단상 추출 용매를 추가하고 밤새 200rpm으로 흔들어 실온에서 Collembolan 지질을 추출합니다.텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 추출한 후 지방산 패턴 분석을 수행하기 위해 각 컬럼에 2ml의 클로로포름을 추가하여 각 샘플에 대해 실리카산 컬럼을 프리컨디셔닝합니다. 클로로포름이 컬럼을 통과한 후 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플에서 하부 클로로포름 상을 제거합니다. 그런 다음 개별 열로 전송합니다.5ml의 클로로포름을 사용하여 중성 지질(NLFA)을 분획하여 개별 유리 용기에 용리화합니다. 그런 다음 10ml의 아세톤을 사용하여 당지질을 용리하고 5ml의 메탄올을 사용하여 인지질 지방산(PLFA)을 용리합니다. 추출 후 NLFA 및 PLFA 개방 튜브를 회전식 진공 농축기(RVC)로 옮기고 섭씨 60도에서 24hPa의 진공 상태에서 약 90분 동안 또는 건조될 때까지 샘플을 증발시킵니다.지방산 메틸 에스테르(FAME)를 분리 및 세척한 후 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상부 지질 함유 상을 테프론 격막이 장착된 유리 크로마토그래피 샘플 바이알로 전달합니다. 바이알을 캡슐화하고 분석할 때까지 섭씨 음의 20도에서 보관합니다. NFLA 및 PLFA 샘플에서 FAME을 식별하려면ampGC-FID에서 제조업체의 지침에 따라 기기의 해당 소프트웨어로 시퀀스를 설정합니다.외부 표준물질 혼합물로 시퀀스를 시작한 다음 샘플로 시작합니다. 각 실행마다 GC 컬럼에서 지방산의 용리 시간이 약간 지연됩니다. 시료 염기서열에 10번째 실행마다 표준물질을 포함하거나 팔미트산에 대한 머무름 시간 잠금을 사용합니다.프로그램을 설정하고 텍스트 프로토콜에 따라 지방산의 nmol을 계산합니다. 동위원소 프로파일링에 의한 탄소-13 분석을 수행하려면 극성 모세관 컬럼을 사용하면 동일한 수의 이중 결합으로도 불포화 지방산을 분리할 수 있습니다. GC 컬럼의 선택은 지방산 내 분자 이온의 양호한 표현을 결정하기 때문에 결과에 매우 중요합니다.DB-23 컬럼의 경우 오븐 온도를 섭씨 130도에서 시작하고 분당 섭씨 6.5도에서 섭씨 170도로 높입니다. 이후 분당 섭씨 3도에서 섭씨 203도까지 상승한 후 1.9분 동안 유지합니다. 그런 다음 분당 섭씨 40도에서 섭씨 230도로 증가시키고 8.3분 동안 유지합니다.전사선 온도를 섭씨 280도로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 프로그램 설정을 완료한 후, 먼저 초기 스캔을 실행하여 무엇이 존재하는지 확인하여 지방산 분자 이온에 탄소-13이 통합되는지 확인합니다. 그런 다음 적절한 이온에 대해 선택한 이온 모니터링 또는 SIM을 실행하고 각 지방산의 크로마토그래피 피크 시간을 포함하는 m/z 스캔 창 또는 SIM 그룹을 선택하여 관심 분자량에서 데이터를 획득합니다.일반적으로 분석물과 시간 창당 2-4개의 이온을 모니터링합니다. 대량 개발을 위해 외부 지방산 표준물질과 함께 총 이온 수를 사용합니다. 머무름 시간과 단편 이온에 따라 시간 세그먼트가 선택됩니다.각 지방산과 모든 동위원소의 분자 이온, M plus 1, M plus two 등을 검출합니다. 영양 탄소 플럭스(trophic carbon flux)를 할당하고, C-13 통합의 위치를 텍스트 프로토콜에 따라 탄소-13 농축(C-13 enrichment)을 계산한다. 이 그림은 순수한 16-0 팔미트산의 SIM-MS 스펙트럼을 나타냅니다.이 화합물에 함유된 탄소-13의 자연적 풍부함은 분자 이온 M 플러스 외에 M 플러스 1 및 M 플러스 2개의 동위원소의 존재에 의해 검출될 수 있습니다. 이에 비해 이 스펙트로그램은 라벨링된 팔미트산 전체를 나타냅니다. 여기서, 이온 M plus 16의 단독 발생은 합성 표지된 화합물의 높은 순도를 반영합니다.다음 SIM 스캔은 라벨링 후 첫 번째 샘플링 날에 Heteromurus nitidus의 PLFA 분획에 있는 4개의 주요 지방산에서 파생된 것입니다. 표지된 마커 분자가 팔미트산으로 동화되는 것은 M plus 16 동위원소의 풍부함에 의해 가시화되는데, 이는 표지된 지방산 전체를 나타내기 때문입니다. 또한 16에서 0까지의 불포화 또는 신장과 불포화를 할당할 수 있습니다.따라서, M 플러스 16보다 큰 동위원소체, 예를 들어, M 플러스 17 및 M 플러스 18의 검출은 C2-13 단편의 사용에 의해 표지된 전구체 16의 연쇄 신장을 입증한다. 여기에 제시된 것은 이온 M의 상대적 부분과 1 더하기 M에 M 더하기 3 및 M 더하기 16 내지 M에 20 그리고 Protaphorura fimata에서 가장 많이 표지된 5개의 NLFA 및 PLFA 중 20을 더한 것으로, 0일차와 1일차에 추정됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 소비자는 자연적으로 특정 C 동위원소를 구성한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 양은 라벨 다이어트가 없는 대조군 실험에서 결정해야 합니다. 이 자연스러운 특정 C 신호는 레이블 템플릿에서 배경으로 뺍니다. 솔벤트로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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생화학

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