Name: 2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: 배우세요 조류 모델에서 체외 배양과 체내 이식을 결합한 2단계 접근법으로 기관 형성의 초기 및 후기 단계를 연구하는 방법입니다. 이 기법은 흉선 및 부갑상선 기관형성을 탐구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 원고, Padma Akkapeddi 비디오 나레이션 대 하의 중요 한 독서에 대 한 안토니오 Cidadão, 이사벨 Alcobia, 레오노르 Parreira를 감사 고 Instituto de Histologia 전자의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 우리는 친절 하 게 제공 stereoscope Interaves 비디오 시스템을 장착 하기 위한 Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).

이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.
1. 수정된 메 추 라 기 계란의 부 화
<ol><li>품 어 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)와 닭고기 (갈 루스 갈 루스) 수정 된 달걀 3, 8 일, 각각.<ol>
<li>38 ° c.에 습도 인큐베이터에 향하도록 공기 챔버 (계란 무뚝뚝한 끝)와 계란 배치</li>
		<li>약 20 메 추 라 기 계란과 40 닭 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하. 참고:이 숫자는 처음으로이 절차를 설정할 때 배가 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 절연 Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 메 추리 배아 영역의
참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.
<ol><li>에 대 한 큰 붕 규 산 유리 그릇을 준비 3/4 가득 찬 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션.</li>
	<li>껍질을 활용 하 여 원형 개통의 무뚝뚝한 끝의 반대 측에 곡선가 위 메 추 라 기 계란을 외피의 3 일 후 엽니다. 조심 스럽게 껍질 제거 하 고 차가운 PBS 가득 유리 그릇에 배아를 전송.</li>
	<li>E 3에서 메 추 라 기 (q) 배아를 잡고 (qE3) (메 추 라 기 단계에 해당 하는 닭의 HH 단계 21) 얇은 겸의 도움으로. 노 른 자 곡선된가 위를 사용 하 여 포함 하는 vitelline 막에 상처를 확인 합니다. 잘라 및 외부 여분의 배아 혈관의 둘레를 계속 합니다.</li>
	<li>양도 작은에 배아 그릇 약 3/4 차가운 PBS 얇은 겸의 도움으로 가득. 나머지 연결 된 노 른 자에서 배아는 철저 하 게 세척.</li>
	<li>스키 머를 사용 하 여 100 m m 유리 블랙 기본 페 트리 접시에 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하.</li>
	<li>아래는 stereomicroscope 페 트리 접시를 놓습니다. 참고:이 시점에서 앞으로, 진보적인 확대에 대 한 미세 절차는 stereomicroscope 아래를 수행 합니다. 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 조명을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>얇은 곤충 핀 접시의 바닥에는 배아를 잡으십시오. 여분 미 발달 지역에 사각형 모양을 형성 하는 4 개의 핀을 배치 합니다.</li>
	<li>얇은 겸의 도움으로 두 부 영역의 여분의 배아 세포 막을 제거 하 고 거기 5 핀을 배치. 참고: 경우 태아는 올바르게, 다음 otic 소포, 심장 관 1성, 2nd및 3rd 인 두 아치 (Pa) 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>Wecker 눈이 위를 사용 하 여 관심, 즉, 3층 및 4회 인 두 아치 지역 (3/4PAR)의 미 발달 지역의 해 부.<ol>
<li>배아 축 somite/신경 튜브 영역과 파 사이 경도 평행을 절단 시작 합니다.</li>
		<li>그것을 절단 하 여 ventrally 위치 심장 튜브를 제거 합니다. 같은 위치에 유지가 위, 컷의 방향으로 태아 위치를 페 트리 접시 회전.</li>
		<li>2차 및 3rd 파 사이 잘리고 실바 4번째 아래</li>
		<li>얇은 포 셉의 도움으로 3/4PAR에서 나머지 막 분리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>격리 된 조직 (3/4PAR) 및 유리 접시 3/4에 그들 가득 차가운 PBS 2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 전송 발음. 참고:이 하, 조직 성장 생체 외에서 최대 48 h 또는 수 E8에서 닭 배아의 캠에 즉시 투입 될.</li>
	<li>생체 외에서 시험 준비 하는 동안 얼음에 격리 된 3/4PAR를 포함 하는 유리 접시를 유지.</li>
</ol>3. 생체 외에서 Organotypic 분석 결과: Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역의 문화
<ol><li>10 %FBS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다. 참고: 약리 성 시 약은 매체 (예를 들어 LY-411.575 (정) 및 디-benzazepine 또는 cyclopamine 그리고 vismodegib, 노치 및 Hedgehog (Hh) 신호 경로 각각 하에 추가할 수 있습니다. 이 분석 결과 대 한 광의 50-200 nM 또는 디 benzazepine의 5-15 µ M를 사용 하 여 노치 3에 신호 억제/4PAR. 3/4PAR5에서 Hh 신호를 억제 하기 위해 cyclopamine의 20 µ M 또는 vismodegib의 10 µ M를 사용.</li>
	<li>6 잘 플레이트에서 3/4PP explant의 생체 외에서 문화를 준비 합니다.<ol>
<li>6 잘 플레이트에서 한 잘 문화 매체의 5 mL을 채우십시오. 24 m m 폴 리 카보 네이트 막 삽입 장소 ( 테이블의 자료를 참조)에 얇은 겸의 도움으로 잘.</li>
		<li>Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 막 표면에 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드럽게 밀어 넣어 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 막 삽입 당 최대 7 explants 추가 합니다. 3.4 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, 문화 explants 부동 멤브레인 필터에.<ol>
<li>35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL을 준비 합니다. 얇은 포 셉, 멤브레인 필터 ( 재료의 표참조) 시키고 공기와 접촉 건조 표면 부동의 도움으로.</li>
		<li>Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 멤브레인 필터를 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩으로 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 멤브레인 필터 당 최대 8 explants 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조심 스럽게 explants 3.2 및 3.3 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 단계에 놓습니다.</li>
	<li>48 h 잠복기 후 인큐베이터에서 6 잘 플레이트와 35 mm 페 트리 접시를 제거 합니다.<ol>
<li>6 잘 플레이트의 막 삽입에서 교양된 explants를 수집 합니다.<ol>
<li>실 온 (RT)에서 막 삽입 PBS를 추가 합니다.</li>
			<li>2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 활발 한 홍 조 explants는 막에서 분리 합니다.</li>
			<li>주걱과 얇은 겸의 도움으로 실시간에 PBS를 가진 채워진 유리 접시 3/4에 교양된 explants 전송</li>
		</ol>
</li>
		<li>마찬가지로, 35 mm 페 트리 접시에에서 떠 있는 멤브레인 필터에서 교양된 explants를 수집 합니다.<ol>
<li>실시간에 PBS를 가진 채워진 새로운 35mm 페 트리 접시에 얇은 집게와 멤브레인 필터를 전송</li>
			<li>활기찬 pipetting 사용 하 여 2 mL의 멸 균 플라스틱 피펫은 explants 멤브레인 필터에서 분리 합니다.</li>
			<li>얇은 포 셉의 도움으로, 그것에 연결 된 아무 explants 남아 확인 후 explant 무료 멤브레인 필터를 방전.</li>
			<li>주걱과 얇은 집게, 전송 explants 유리 접시에 담긴 실시간에서 PBS</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>총 RNA 격리에 대 한 시 약의 1 mL를 주걱으로 교양된 explants 전송 및 유전자 발현 연구에 대 한 사용. 주의: 이 시 약에 노출 ( 재료의 표참조) 심각한 건강 위험 수 있습니다. 적절 한 보호 안경, 의류, 장갑 착용. 처리 지시 하 고 제조업체에서 제공 하는 안전 데이터 시트를 읽어.</li>
	<li>또는, E8에서 닭 배아의 캠에 교양된 조직 이식. 4 단계를 따릅니다.</li>
</ol>4입니다. 카메라의 준비
<ol><li>인큐베이터에서 배아 발달의 8 일 닭 계란을 제거 합니다. 참고: 계란 습도 인큐베이터에서 38 ° C에서 위쪽으로 직면 하는 공기 챔버와 인 큐베이 팅 했다.</li>
	<li>공기 챔버에 떨어지는 포탄의 조각을 방지 하기 위해 투명 한 플라스틱 테이프와 계란의 무뚝뚝한 끝을 커버. 셸을 누르고 곡선가 위 계란에 원형 개통을 잘라. 공기 챔버 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>제거 주의 공기 챔버의 흰색 막 얇은 집게와. 캠은 다음 볼 수 및 소성 조직 이식에 대 한 접근. 참고: 이후 PBS 슬라이딩과 방치는 explants의 촉진이 이식, 전후 캠, 수 화를 PBS를 사용 하지 마십시오. 막 밖으로 건조, 계란을 폐기.</li>
</ol>5. 교양된 Explants는 캠에의 접목
<ol><li>에 홀더 microscalpel와 카메라의 작은 혈관에서 작은 혈관 병 변/상처를 만듭니다. 참고: 주입구 과잉 출혈의 경우에 의해 혈액을 제거 하는 파스퇴르 피 펫의 끝을 사용 합니다.</li>
	<li>주걱과 얇은 집게를 사용 하 여 카메라의 부상 영역 교양된 explant 전송.</li>
	<li>필터 종이 explant 보다 약간 잘라내어는 explant 위에 그것을 배치. 참고: 필터 종이 캠에 개발 후 explant 위치를 추적 도움이 됩니다. 또한, 그것은 매일 약 하 배달을 허용는 explant 비켜에서 개발 하는 동안 필요한 경우 (5.6 단계에서 설명).</li>
	<li>투명 한 플라스틱 테이프와 계란 창 인감 및 목탄 연필을 사용 하 여 식별 합니다. 참고: 플라스틱 테이프는 잠복기 동안 탈수에서 태아를 보호 한다.</li>
	<li>38 ° c.에 습도 인큐베이터에서 10 일 동안 조작된 달걀을 품 어 6 단계를 따릅니다.</li>
	<li>선택적 단계: 잠복기 동안 매일 약물 행정.<ol>
<li>필터에 액세스 하려면 부분적으로 플라스틱 테이프를 들어올립니다. 마약 솔루션, 드롭 들러, 종이 위에 100 µ L를 추가 합니다. 다시 창 및 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 다시 계란을 배치 참고:이 분석 결과 대 한 cyclopamine의 20 µ M의 복용량은 억제 비켜 개발5동안 Hh 신호.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 소성 기관 형성 카메라에 비켜에서 개발의 10 일 후
<ol><li>10 일 후 부 화, 인큐베이터에서 달걀을 제거 하 고 플라스틱 테이프를 신중 하 게 철회.</li>
	<li>캠 곡선된가 위 및 작은 유리 필터 종이 캠 파생 explant 약 3/4 차가운 PBS 가득 그릇을 사용 하 여 필터 영역에 주위 잘라.</li>
	<li>얇은 겸의 도움으로 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 캠 파생 explant 100 mm 페 트리 접시에 전송. 부드럽게 필터 종이 Wecker 눈이 위를 사용 하 여 집게를 얇은 막의 과잉을 제거 합니다.</li>
	<li>캠-explant 통 솔루션에 전송 (3.7 %PBS PFA) 스키 머와 함께. 큰가 위의 도움으로 태아의 목 지역에 정확한 컷 하 여 난 자에서 그들을 제거 하지 않고 닭 배아를 안락사.</li>
	<li>전통적인 조직학 및 immunohistochemistry 캠 파생 explants의 파라핀 섹션에서 기관 형성을 평가 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute-50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute-50 years of embryology.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stem+cells+into+organs%3A+topobiological+transformations+demonstrated+by+beak%2C+feather%2C+and+other+ectodermal+organ+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus%2Fparathyroid+common+primordium%3A+Crosstalk+in+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+6+-+Recent+Advances+in+Developmental+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Frontiers+in+Developmental+Toxicology+and+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology.</a> Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).</li>
<li>Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0017660">FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies.</a> PLoS One. 6 (3), e17660(2011).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio-mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li>
<li>Maeda, Y., Noda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+embryonic+long+bone+on+chorioallantoic+membrane+in+ovo+prevents+perichondrium-derived+suppressive+signals+against+cartilage+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth.</a> Bone. 32 (1), 27-34 (2003).</li>
<li>Ishida, K., Mitsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bioengineered+feather+buds+on+a+reconstructed+chick+skin+from+dissociated+epithelial+and+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells.</a> Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/239088">Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras.</a> J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).</li>
<li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development. 140, 2015-2026 (2013).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal+pouch%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch.</a> Mech Dev. 103, 141-143 (2001).</li>
<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li>
<li>Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus%2Fparathyroid+by+Six+and+Eya1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).</li>
<li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+ovo.+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 방법의 성공에 대 한 중요 한 측면은 품질 닭고기와 메 추 라 기의 달걀. 고려는 긴 부 화 기간, 특히 에 비켜 분석 결과, 계란의 좋은 품질 향상 생존 프로시저의 끝으로 (최대 90%까지) 요금. 이를 위해, 다른 공급 업체에서 계란을 테스트 합니다. 오랜 기간 동안 unmanipulated 알을 품 어 (최대 16-17 일) 그들의 발달을 체크 하 고. 좋은 품질의 일괄 처리로 간주, 배아의 80% 이상이 정상적인 발전을 제시 해야 합니다. 그것은 또한 각 인큐베이션 단계 끝에 진정한 대표 성과 신뢰성 보장을 재현할 수 동기 발달 단계를 제공 합니다 확인 하는 것이 중요. 달걀 껍질 다공성으로 인해 모든 계란 부 화 단계에 대 한 인큐베이터에서 습도 분위기를 유지 합니다. 환경 오염을 방지 하려면 항생제 절차 (선택 사항)에서 PBS 솔루션에 추가할 수 있습니다.
이 메서드는 메 추 라 기 기관 초보를 절연 하 고 48 h에 대 한 organotypic ...

조류 배아 정액 발달 생물학 연구에서 널리 사용 되었습니다. 새 모델의 주요 장점은 오픈 계란, 태아, 그리고 micromanipulation를 수행 하는 능력에 상대적으로 쉽게 접근할 수를 포함 합니다. 세포 운명1, 배아2, 특정 성장 요인의 응용 프로그램 및 캠1,3, 소성 세포 구조의 성장 공부에 대 한 고전적인 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 구성 하는 몇 가지 예 4.
기관 대형의 다른 단계에 대 한 새로운 통찰력을 얻으려면, 우리는 최근 체 외에서 배아 조직5의 조작으로 이식 기법을 결합 하는 방법을 개발 했습니다. 2 단계 접근 차별 및 탐사의 두 초기-및-의 후기 organogenesis는 매우 역동적이 고 복잡 한 조직 상호 작용2인해 제한 수 있습니다. 또한, 적합 한 조직 관련 마커의 부족 자주 제한의 사용 유전자 변형 동물 모델6. 2 단계 접근의이 새로운 방법은 크게 이러한 한계를 극복 한다.
첫 번째 단계에서 기관 형성의 초기 단계를 공부 하 메 추리 배아 영토 잠재 기관 rudiment 구성 된 절연 이며 48 h에 대 한 생체 외에서 organotypic 시스템에서 성장. 이 기간 동안, 특정 신호 통로의 약리 변조 배양5,7약물을 추가 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 교양된 조직 생체 외에서 성장의 모든 단계에서 수집 된 수 있습니다 하 고 유전자 발현에 대 한 조사 (정량, microarrays, 등등과 같은 메서드를 사용 하 여).
두 번째 단계에서 48 h 교양 조직 다음 닭 (c) 배아 배아 날 (E) 8 (cE8)의 캠에 융합은 (햄버거와 해밀턴 (HH)-33-35 단계)8. 캠은 영양분의 혈관 공급 동작 고 가스 교류1,,34 이식할된 조직을 그것의 개발에서 비켜에서 오랜 시간에 대 한 사용을 허용 한다. 이 실험 단계는 특히 적합 organogenesis의 늦은 단계 공부로 비켜 개발5,,910,11의 10 일 후 완전히 형성된 장기를 얻을 수 있습니다. . 형태소 분석은 쉽게 적절 한 기관 형성을 확인 하기 위해 전통적인 조직학 수행 하며 세포의 기증자 기원 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, MAb 메 PeriNuclear (QCPN))를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 캠 잠복기 동안 이식 또한 수 약리학 대리인의 면 전에 서 성장 하 고 organogenesis의 진행을 평가 하는 개발의 모든 단계에서 수집 된.
깊이, 여기에 설명 된 2 단계 접근 방식은 이미 Figueiredo 외 에 고용 되어 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발 탐험 5 . 따라서, 배아 영토의 고유의 특성 및 thymus의 부 갑 상선 동맥은 organogenesis에 관련 된 개발의 단계 아래에 표시 됩니다.
Thymus 및 부 갑 상선 동맥 epithelia, 하지만 기능적으로 고유에서 파생 pharyngeal 주머니의 endoderm (PP)12. 조류, 이러한 장기의 epithelia에서에서 발생 한 제 3의 그리고 제 4 PP endoderm (3/4PP)12, 포유류에서 thymic 상피는 3PP에서 파생 하 고 부 갑 상선 땀 샘의 상피 3PP 3/4PP 마우스에서와 인간에서 파생 하는 동안 각각13,은14입니다.
이러한 장기의 형성에서 초기 단계 중 개별 thymus 및 일반적인 primordium에서 부 갑 상선 도메인의 출현 이다. 치킨, E4.515에서 특정 분자 마커와 제자리에서 교 잡 하 여 이러한 도메인을 확인할 수 있습니다. 개발 진행, 이러한 장기 초보 개별화 하 고 신경 크레스트 파생 된 세포에 의해 형성 된 얇은 엽 캡슐 (E5;에서 그들을 포위 하는 동안에 인 두에서 분리 HH-stage 27). Thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (E6.5;에 의해 식민지는 나중에, HH-stage 30)12.
클래식 메 추 라 기-치킨 연구1,12에서 2 단계 접근 림프/조 혈 기관, 즉 thymus5의 형성 연구에 특히 유용 하다. 메 추 라 기는 explant, 기관 rudiment와 서 투입은 조 혈 조상 세포 식민 이전 닭 배아, 공상 thymus 메 thymic 상피 대응 침투 닭 혈액을 매개로 조상 세포로 형성 된다. 이 방법은, 따라서 조류 hemato/림프 시스템의 개발에 조 혈 모 세포의 기여를 탐험 하는 유용한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>닭 수정란 (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>가금류 농장&nbsp;</td></tr><tr><td>메추라기 수정란 (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Bird farm&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm 파이렉스 접시</td><td>Duran 그룹</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 파이렉스 접시</td><td>Duran 그룹</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 멤브레인 인서트&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>24mm 트랜스웰과 0.4mm 포어 폴리카보네이트 멤브레인 인서트&nbsp;</td></tr><tr><td>멤브레인 필터</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0.6 mm Isopore 멤브레인 필터</td></tr><tr><td>6-웰 배양 플레이트</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr>슈퍼마켓에서 파는 <td>파이렉스 그릇</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트랜스퍼 피</td>펫 <td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL 플라스틱 피펫</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; 슈퍼마켓</td>에서 판매하는 품질 <td></td><td>WHA1001090</td><td>필터 종이</td></tr><tr><td>투명 플라스틱 테이프</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>사이토케라틴(팬, 산성 및 염기성, 유형 I 및 II 사이토케라틴), 클론 Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>사이클로파민 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4116</td><td>Hh 신호의 약리학적 억제제</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로젠, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN 항체</td><td>발달 연구 하이브리도마 은행</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체, GlutaMAX 보충제&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B 실리콘 엘라스토머 1.1Kg 키트</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>페트리 접시</td></tr><tr><td>Stemolecule LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Pharmacological inhibitor of Notch signalling</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Reagent for total RNA isolation</td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>얇은 집게</td></tr><tr><td>매우 세밀한 Bonn 가위, 곡선</td>형 <td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>곡선형 가위</td></tr><tr><td>곤충 핀&nbsp;</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 스패튤라&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>이식 스푼</td></tr><tr><td>Minutien 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Microscalpel</td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>홀더</td></tr><tr><td>Moria Perforated Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Eye Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>라이카 마이크로시스템즈&nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>라이카 마이크로시스템즈&nbsp;</td><td>라이카 M80</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>라이카 마이크로시스템즈&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr></tbody></table> 시리즈

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: thymus 및 부 갑 상선 동맥 organogenesis 패러다임

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

조류 배아 실험 모델로 되었습니다 정액 발견에 대 한 매우 중요 개발 생물학. 중 몇 가지 방법을, 메 추 라 기-닭고기 키메라의 형성 및 chorioallantoic 막 (CAM) 소성 조직 날짜 지난 세기에 개발을 유지 하기 위해 사용. 요즘, 최근 생체 외에서 방법론으로 이러한 고전적인 기술 조합 추가 기관 형성을 찾아보기 새로운 잠재 고객을 제공 합니다.
여기-그리고 늦은-초기 organogenesis의 공부 하는 2 단계 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 배아 지역 기관의 추정 영토를 포함 하는 (48 h) 최대 organotypic 시스템에서 메 추 라 기 태아와 성장 생체 외에서 격리 됩니다. 교양된 조직 이후 닭 배아의 캠에 융합 된다. 비켜에 개발의 10 일 후 완전히 형성된 장기 이식할된 조직에서 얻을 수 있습니다. 이 메서드는 또한 약리 에이전트의 일반 행정과 조직 체 외 고 비켜 발달 단계에 걸쳐 유전자 조작에 의해 경로 신호 변조를 수 있습니다. 또한, 조직 개발 그들의 유전자 발현 프로 파일 (를 사용 하 여 정량 PCR (정량), microarrays, 등) 및 형태 (전통적인 조직학 및 immunochemistry 평가) 분석을 어떤 시간대에 수집할 수 있습니다.
설명된 실험 절차를 따라 완벽 하 게 형성 하는 organogenesis의 초기 단계에서 기능적 장기 조류 배아 외부 기관 형성 도구로 사용할 수 있습니다.

위의 설명 프로토콜 세부 사항을 조사의 두 초기-및-의 후기 종종 복잡 한 세포 및 분자 상호 작용에 의해 제한 organogenesis 허용 하는 방법.
이 방법은 이전 Figueiredo 외 에 고용 되었다 노치와 Hh 신호 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발에서의 역할을 해명 하기 5 .
여기, 새로운 결과 그림 1 과 그림 2 organogenesis의 동일한 모델을 사용 하 여 표시 됩니다. 그림 1A ...

이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

이 절차의 전반적인 목표는 조류 모델을 사용하여 배아 조직의 체외 조작과 난자 이식 기술을 결합하여 기관 형성의 초기 및 후기 단계를 연구하기 위한 2단계 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이 방법에서는 장래의 장기 기초를 구성하는 배아 영역을 분리하고 48시간 동안 유기형 시스템에서 성장시킵니다. 이 in vitro 접근법은 정상적인 발달을 모방함으로써 특정 분자 마커 없이 배아 영역에 쉽게 접근할 수 있도록 하고 매우 역동적인 공간 변형과 복잡한 조직 상호 작용에 의존하는 장기 형성의 초기 발달 단계를 실험적으로 조작할 수 있도록 합니다.그런 다음 배양된 조직을 닭 배아의 융모막막에 이식합니다. 융모막막은 영양분의 혈관 공급자로 행동하며 이식된 조직으로의 가스 교환을 허용하여 난소에서 발달할 수 있도록 합니다. 이 단계는 난자 발달 10일 후에 완전히 형성된 장기를 달성할 수 있으므로 기관 형성의 후기 단계를 연구하는 데 특히 적합합니다.또한 약리학적 제제는 체외 및 난자 발달과 함께 투여될 수 있어 발달 단계에 따른 방식으로 신호 전달 경로를 조절할 수 있습니다. 궁극적으로, 발달 중인 조직을 언제든지 수집하여 기관 형성의 진행을 평가하고 유전자 발현 및 형태학적 특징을 분석할 수 있습니다. 조류 배아 외부의 장기 형성을 추적함으로써 이 방법은 장기 형성의 뚜렷한 단계와 관련된 신호를 식별하는 것과 같은 발생 생물학의 주요 질문을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 실험 절차는 흉선과 부갑상선의 기관 형성을 연구함으로써 예시될 것입니다. 조류에서 이러한 기관의 상피는 세 번째와 네 번째 인두 주머니의 내배엽 공통 원시에서 파생되며 배아 4일, 메추라기, 닭의 4/5일쯤에 별개의 도메인으로 나타납니다. 발달이 진행됨에 따라 기관의 기초는 인두에서 개별화되고 분리됩니다.나중에 발달 과정에서 흉선 상피는 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cell)에 의해 군집화됩니다. 여기에 제시된 방법은 이러한 기관의 추정 영역을 포함하는 메추라기 배아 영역, 즉 배아 3일차에 세 번째와 네 번째 아치를 포함하는 인두 영역을 분리하는 것으로 시작합니다. 수정된 메추라기 알을 가습된 인큐베이터에서 섭씨 38도에서 3일 동안 공기 챔버가 위를 향하도록 부화시켰습니다.시작하려면 인큐베이터에서 메추라기 알을 제거하십시오. 수평 층류 후드와 멸균된 기구 및 재료를 사용하여 멸균 상태에서 난자 조작 절차를 수행

two-step-approach-to-explore-early-late-stages-organ-formation-avian

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 절개와 태아 thymus의 제거뿐만 아니라 2 dGuo - 처리 thymus의 전 생체내 문화의 준비를 보여줍니다.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

이 프로토콜은 쥐 배아 갑상선 항라겐의 해부와 반다공성 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드의 외식자리 배양을 설명합니다. 이 시스템은 야생형 또는 녹아웃 배아의 갑상선 발달 과정에서 발생하는 형태발생학적 또는 분화 현상을 연구하는 데 이상적이며, 이득 및 기능 상실 실험에 적합합니다.

<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

여기, 선물이 배아 치킨 장기 성장 프로토콜을 경작 하는 organotypic 생체 외에서. 이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 조직 개발 수 수 공부, 문화 환경에 통제의 고차를 유지 하면서.

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

이 문서에는 ex vivo 공상 장기 형태로 결합 될 수 있는 메 추 라 기 및 닭 배아에서 순수 배아 조직 분리 하는 방법을 제공 합니다.

배아 조직과 Thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연

이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

여기에서 우리는 닭 배아의 celomic cavity에서 신장 오가노이드의 이식을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 성숙 향상을 유도하고 이러한 과정을 효율적인 방식으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

닭 배아에서 Intracelomic Transplantation을 통한 신장 오가노이드의 효율적인 혈관 형성

여기에서는 조직 상호 작용, 4D 이미징 타임랩스 동영상(3D 플러스 타임), 분자 기능의 전역 또는 국소 섭동 및 시스템 생물학 특성화를 검사하는 데 사용할 수 있는 세 가지 유형의 조류 배아 피부 이식 배양에 대한 프로토콜을 설명합니다.

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

여기에서는 여러 성숙 단계에서 인간 뇌 오가노이드를 병아리 융모막(CAM)에 생착하는 프로토콜을 제시합니다. 뇌 오가노이드는 유도되지 않은 표준화된 프로토콜에 따라 성장했습니다.

초기 비유도 인간 뇌 오가노이드 신경 혈관 틈새 모델링을 허용 병아리 배아 맥락막으로 모델링

Xenopus laevis 배아는 크기가 크고 조작이 용이하기 때문에 초기 발달 연구에 매우 유용합니다.   이 모델 시스템에서 특정 장기를 식별하는 데 사용할 수 있는 전체 마운트 in situ hybridization 프로토콜에 대한 단순화된 프로토콜이 제공됩니다.

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

배우세요 조류 모델에서 체외 배양과 체내 이식을 결합한 2단계 접근법으로 기관 형성의 초기 및 후기 단계를 연구하는 방법입니다. 이 기법은 흉선 및 부갑상선 기관형성을 탐구하는 데 활용됩니다.

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

더 많은 동영상 탐색