Name: 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 배우세요 천연 제품에 대한 단일 클론 항체 생성 프로토콜을 면역학 및 생명공학 연구에 활용하는 방법입니다. 마우스 면역, 세포 융합, ELISA 스크리닝을 통해 특이적이고 효과적인 항체를 개발할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81573573, 81473338, 및 81503344)와 고전 처방 기본 연구 팀 베이징 대학에서 중국 의학의 의해 지원 되었다.

이 연구에서 수행 하는 동물 절차의 모든 중국 의학 (승인 번호 2016BZYYL00109)의 베이징 대학에서 윤리 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다.
참고: 여성 BALB/c 마우스 (8 주 이전) 했다 hapten-운반대 단백질 어원이 같은 말을으로 예방 접종 혼자, 작은 분자를 사용 하는 경우 (< 1000 다) 면역 반응을 유도 수 없습니다. 그러나, 항 원 합성에 캐리어 고분자 작은 분자 변화. 이러한 맥락에서 작은 분자를 hapten을 표시 됩니다. Hapten 활용 mAb 생산을 위한 필요 하 고 효과적인 전략 이다. 교차 반응, 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 ovalbumin (OVA) 또는 열쇠 구멍 삿 hemocyanin (KLH) 등 두 명의 다른 단백질 수송을 방지 하려면 BSA, (를 위한 플레이트 코트 (동물 예방접종)을 immunogens 그리고 코팅 항으로 사용 해야 합니다 반대로 혈 청 탐지)입니다. BSA와 OVA이이 프로토콜 예제로 사용 됩니다.
1. Immunogen 및 코팅 항 원 준비
참고: 합성 인공 항 원에 대 한 사용 하 여 적절 한 기능 그룹 (예, 수 산 기, 산 성, 또는 아미노 sulfhydryl carboxyl) 측 팔으로 캐리어 단백질으로 화학식 바인딩에 대 한. 활용 방법 포함 periodate 산화, carbodiimide 방법, 혼합된 anhydrides 반응, 글 반응 및 합성 방법. 이 프로토콜 예제 화합물으로 naringin (NAR)는 잘 알려진 flavanone glycoside를 사용합니다. NAR은 감귤 뿐만 아니라 다양 한 전통 중국 의약품에 작은 화합물 (581 다) 이다.
<ol><li>Periodate 산화 프로시저를 사용 하 여 NAR BSA 및 NAR OVA 어원이 같은 말을 합성.<ol>
<li>1 mg/mL22의 최종 농도에 물에 NAR의 50 밀리 그램을 디졸브.</li>
		<li>갓된 나트륨의 100 µ L periodate 솔루션 (0.1 M) NAR 솔루션의 5 mL을 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실내 온도에 혼합물을 저 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 m m 탄산 버퍼 (pH 9.6) 2.0 mL에 BSA의 OVA 4 mg을 디졸브. 이 단백질을 추가 솔루션 NAR/나트륨을 반응 혼합물을 periodate.</li>
	<li>PH 9 1 M 나2CO3 솔루션에 혼합물을 조정 하 고 6-8 시간 실 온에서 저 어.</li>
	<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) CBS를 교환 하는 투 석 막 (MWCO 10 kDa) 3 일 동안을 사용 하 여에 반응 혼합물 dialyze</li>
	<li>매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)를 사용 하 여 hapten-운반대 공액 분석-MS.<ol>
<li>10 여 켤레의 1-10 pmol 혼합3-0.15 %trifluoroacetic 산 (TFA)을 포함 하는 용액에 sinapinic 산의 어 금 니 과잉을 접어. 공기에서 샘플 접시에 혼합물을 건조.</li>
		<li>337에서 운영 하는 질량 분 서 계는 펄스 질소 레이저를 갖춘 MALDI TOF를 사용 하 여 분석을 수행 nm. 15000-100000으로 앞에서 설명한22의 대량 범위 (m/z) 선형 모드에서 긍정적인 이온 MALDI 질량 스펙트럼을 취득.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 예방 접종
참고: 5 BALB/c 여성 쥐 (8 주 정도)의 총 사용 되었다: NAR 4 켤레 예방 접종 및 제어 (PBS) 예방 접종에 대 한 1.
<ol><li>첫 번째 접종 Freund의 완전 한 보조 (CFA)의 동등한 양으로 켤레 (100 µ L의 PBS에 희석)의 50 µ g을 혼합 하 고 완전히 유상으로 만들 다. 각 마우스를 통해 지 피하 주입에이 혼합물의 100 µ L를 관리 합니다.</li>
	<li>2 주 후, 같은 양의 공액 불완전 한 보조 (IFA)와 혼합 부스터 피하 주사를 통해 예방 접종 (100 µ L) 제공 합니다.</li>
	<li>200 µ L의 혈액에서에서 추출 모든 마우스의 꼬리 정 맥 7 일 후 혈 청을 얻기 위해.<ol>
<li>원심 분리기 3000 x g에 피 10 분에 대 한 신선한 튜브에 혈 청 표면에 뜨는 전송.</li>
		<li>앞에서 설명한21로 ELISA를 사용 하 여 혈 청 분석. 세포 융합에 사용할 가장 높은 혈 청 titer와 마우스를 선택 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 융합에 대 한 준비, 보조 없이 PBS의 300 µ L에서 켤레의 50 µ g의 복 주입을 통해 선택한 마우스에 펄스 면역을 융합 하기 전에 3 일 관리. 참고:이 단계는 titer 충분히 높은 경우 생략할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 세포 융합에 대 한 준비
<ol><li>셀 퓨전 중간 준비<ol>
<li>Hypoxanthine-aminopterin-티 미 딘 (모자) 선택적인 매체에 대 한: 모자 미디어의 보충 교재 10 ml에서 RPMI 1640 x 50을 녹이 고 RPMI 1640의 500 mL에이 혼합물을 추가 포함 하는 20 %FBS. 참고: 50 x 집중의 10 mL 500 ml 문화 매체의 희석은 때 hypoxanthine, aminopterin, 그리고 티 미 딘의 최종 농도 0.4 µ M, 100 µ M, 16 µ m 이다, 각각.</li>
		<li>Hypoxanthine-티 미 딘 (HT) 미디어: HT 미디어의 보충 교재 10 ml에서 RPMI 1640 x 50을 녹이 고 RPMI 1640의 500 mL에이 혼합물을 추가 포함 하는 20 %FBS. Hypoxanthine 그리고 티 미 딘의 최종 농도 각각 100 µ M와 16 µ M입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>S p 2/0-Ag14 세포 문화.<ol>
<li>최소 7 일 전에 퓨전, 빠르게 액체 질소 냉동 s p 2/0-Ag14 myeloma 세포의 따뜻한 물에 유리병을 녹여.</li>
		<li>신선한 문화 매체 (RPMI-1640)와 1000 x g에서 10 분 원심 분리기의 5 mL로 셀 솔루션을 전송 합니다.</li>
		<li>원심, 후 문화 매체를 제거 하 고 신선한 RPMI-1640 년 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보완에 셀 resuspend.</li>
		<li>25 c m2 플라스 크로 셀과 매체를 전송 및 5% CO2의 분위기 속에서 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>3 또는 4 75 c m2 플라스 크 융합 하기 전에 셀을 확장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복 부 급지대 레이어 셀의 준비<ol>
<li>자 궁 경부 전위 세포 융합에 앞서 1 일에 의해 12 주 된 흰둥이 ICR 마우스를 희생 하 고 75% 에탄올에 잠수함.</li>
		<li>Hemostatic 집게와 복 부에서 모피를 제거한 후 지역 75% 에탄올으로 소독. 복 부 구멍을 노출 외부 피부를 잘라. 복 부에 살 균 RPMI 1640 매체의 3 mL를 주입 하 고 솔루션에 추가 셀을 분리 하려면 복 부 마사지. 피더 세포 현 탁 액 15 mL 원심 분리기 튜브로 발음.</li>
		<li>Centrifuging 1000 x g에서 10 분 동안 세포 현 탁 액, 삭제는 상쾌한 고 모자 선택적인 매체의 20 mL의 급지대 셀 resuspend.</li>
		<li>96-잘 세포 배양 배지 (100 µ L/잘)로 셀을 전송 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 접시를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 융합
<ol><li>예방 접종을 선택 후 마우스 세포 융합에 대 한 준비 된 (단계 2.4 참조), 10 %chloral 하이드 레이트 (마 취)의 복 주사를 관리 하 고 자 궁 경부 전위를 통해 면역된 한 마우스를 희생.</li>
	<li>마음 (1 mL)에서 추가 혈액을 수집 하 고 혈 청 hybridoma 선택 동안 긍정적인 컨트롤로 사용할 2.3.1 단계에서 설명한 대로 준비.</li>
	<li>피부와 근육 조직 비장 폭로 위를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 핀셋으로 비장을 분리 하 고 세척 RPMI 1640와 비장. 조각으로는 비장 고 천천히 triturate를 비장 파운드. 50 mL 원심 분리기 관으로 비장 조직 800 메쉬 셀 스 트레이너를 통해 눌러 비장 세포 현 탁 액을 준비 합니다.</li>
	<li>워시 RPMI 1640 매체와 비장 세포 현 탁 액. 원심 (1000 x g, 10 분, 4 ° C)에 의해 비장 세포를 수확 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 이 세척 단계를 세 번 반복 합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 재배 하 고 증폭 된 myeloma 세포를 제거 하 고 부드럽게 탭/흔들어 세포 현 탁 액을 얻기 위해 플라스 크. 이 정지 RPMI 1640 매체는 FBS를 제거 하려면 두 번 씻는 다. 참고: 이것은 필수적인 단계 FBS 세포 융합에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	<li>셀을 계산 하 고 비장 세포와 혼합 하기 전에 농도 조정 합니다. 비장 세포 myeloma 세포의 최종 비율 1: 5와 1시 10분 사이 이어야 한다.</li>
	<li>비장의 셀 펜션과 myeloma 세포를 혼합. 셀 혼합 (1000 x g, 10 분, 4 ° C), centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>50% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 솔루션의 1 mL에 있는 셀에 추가 하 고 1 분 동안 37 ° C에서 부드럽게 저 어. 30 서 하자 s. 참고:이 단계에서 사용 되는 말뚝 솔루션 50% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 1500을 포함 해야 합니다 및 칼슘 (캘리포니아2 +) 없이 PBS에 10% (v/v) 디 메 틸 sulfoxide (DMSO).</li>
	<li>반응 종료를 2 분 동안 RPMI 1640 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 또 다른 1 분 RPMI 1640 매체의 추가적인 2 mL를 추가 하 고 RPMI 1640 매체의 추가적인 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 800 x g에서 셀 원심 삭제는 상쾌한, 후 모자 솔루션을 추가 하 고 셀을 육성 하기 위해 계속. 다음 급지대 레이어 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 7 일에 대 한 번호판을 품 어. 참고:이 조건 하에서 들뜬된 myeloma 세포 hybridoma 세포 모자 매체에서 성장을 계속 하는 동안 죽을 것 이다. 7 일 후, 단일 클로 널 hybridoma 우물 polyclonal hybridoma를 포함 하는 셀의 여러 클러스터 있을 것 이다 하는 동안에 잘 셀의 단일 클러스터로 형성할 것 이다.</li>
	<li>분석에 대 한 상쾌한 발음 하 고 HT 매체와 매체를 대체 합니다. 참고: 반드시 모자 매체를 대체할 HT와 unsupplemented 매체에 직접 전환으로 중간 첫 번째는 hybridoma에 해롭습니다.</li>
</ol>5. 간접 경쟁 일 라 (icELISA)
<ol><li>NAR-OVA (1 µ g/mL, 100 µ L/잘)와 96 잘 접시 코트와 4 ° c.에 하룻밤 또는 37 ° C에서 1 시간에 대 한 품 어</li>
	<li>일반적인 흡착을 방지 하기 위해 37 ° C에서 1 시간에 대 한 GPBS (PBS 1 %m / v 젤라틴을 포함)의 300 µ L로 플레이트를 차단 합니다.</li>
	<li>플레이트 TPBS (PBS 0.05 %v / v 트윈-20 포함)와 세 번 씻는 다.</li>
	<li>농도 10% 메탄올을 가진 시리즈로 결합형된 NAR을 희석. 우물을이 희석의 50 µ L를 추가 합니다. 다른 우물에서 항 혈 청 또는 hybridoma 표면에 뜨는 (mAbs 포함)의 50 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 1 시간을 위한 접시를 품 어</li>
	<li>과산화 효소 표시 반대로 마우스 IgG 각 우물에의 100 μ를 추가 하 고 추가 1 시간에 대 한 품 어.</li>
	<li>씻은 후 세 번 TPBS와 접시, 100 µ L 기판 솔루션의 추가 (0.1 m M 구 연산 염 버퍼 (pH 4) 포함 0.015%의 v/v H2O2 와 3, 3', 2 mg/mL 5, 5'-tetramethyl benzidine (TMB)) 각을 잘 하 고 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>그래서 1 M H2의 50 µ L을 추가 하 여 반응을 중지4 각 잘.</li>
	<li>450에 microplate 리더를 사용 하 여 흡 광도 측정 nm. Hybridomas 추가 준비에 대 한 그들의 상쾌한에 NAR 항 체의 높은 농도 분 비 하는 선택 하십시오.</li>
</ol>6입니다. 단일 클로 널 Hybridomas의 준비
<ol><li>제한 희석 메서드를 사용 하 여 단일 클로 널 hybridomas 준비 하.<ol>
<li>선택한 hybridomas에서 HT 매체를 제거한 후 (즉, 그 NAR 항 체 분 비에 대 한 긍정적인) RPMI-1640 년에 셀 resuspend, 그들을 계산.</li>
		<li>셀 1 셀, 2 셀 및 96 잘 접시에서 RPMI 1640의 100 µ L에 잘 당 4 셀의 농도를 희석. 37 ° c, 5% CO2접시를 품 어.</li>
		<li>7-10 일 후 icELISA 프로토콜 (5 단계)을 사용 하 여 표면에 뜨는 문화 NAR 항 체를 감지 합니다. NAR 24-잘 접시, 25 c m2 플라스 크, 및 75 cm2 플라스 크 배양에 대 한 항 체에 대 한 긍정적인 hybridomas에서 세포를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일 클로 널 hybridomas cryopreserve<ol>
<li>세포를 수확 하 고 원심 관에 그들을 전송.</li>
		<li>Centrifuging 셀 (800 x g, 10 분), 후에 상쾌한을 제거 하 고 resuspend (RPMI-1640, 20% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 그리고 10 %DMSO) 중간에 셀. Cryotubes 셀 정지 전송.</li>
		<li>24 h-80 ° C에서 그라데이션 냉각 상자에 있는 cryotubes를 저장 합니다. 다음 장기 저장을 위한 액체 질소는 cryotubes 전송.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+separation+science%22%5BJournal%5D)">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리 제시 자연 제품에서 파생 된 작은 분자에 대하여 mAbs의 성공적인 생산을 위한 프로토콜. 절차의 필수적인 단계를 설명 하 고 우리는 예를 들어 작은 분자도 NAR을 사용 하 여이 프로토콜의 유틸리티 증명 하고있다. 예제에서는 스펙트럼, 반응 분석, 및 icELISA 결과 대표 실험 및 제어 가져온 데이터를이 프로토콜을 사용 하 여 표시 합니다. 예제 이미지는 hybridomas의 연구원 해야 있을 원하는 단일 클로 널과 polyclonal hybridomas 사이 분화 하는 때의 시각적 표현을 제공 합니다. 함께 찍은, 우리는 mAb, 특성화, 생산과 응용 전략 여기에 결과 발표 ELISA 테스트 하는 데 사용할 수 있는 특정 mAb에 따라 소설으로 서 작은 분자에 대 한 효과적인 mAb의 생성 증명 하고있다 다른 천연 제품에 대상 분자의 식입니다.
모든 종류의 항 체를 사용,이 절차 중 발생할 수 있는 가장 일반적인 문제는 mAb의 감도와 연결 됩니다. 실제로, ...

단일 클론 항 체 (mAbs), 모노-특정 항 체로 알려진 단일 B-lymphocyte 복제에서 생산 되며 모두 동일한 epitope1에 바인딩할 여러차례 항 체의 구성. 최근 몇 년 동안, 많은 약 식물 유래 천연 제품2다양 한 질병 치료에 사용 되었습니다. 실제로, 원래 천연 제품에서 파생 된 많은 작은 분자 화합물 artemisinin 말라리아와 암2,3paciltaxel (taxol) 등 첫 줄 약으로 이제 적용 됩니다. 천연 제품의 연구는 엄청난 개발 및 기존의 분석 기술, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분석 (MS) 등의 최적화 때문에 크게 급속 한 진행을 했다. 그러나, 아직도 이러한 방법으로, 그들의 복잡 한 전처리 프로토콜, 시간, 노동/전문 지식, 및 필요한 악기4에 관하여 관련된 비용 등 관련 된 몇 가지 제한 사항이 있습니다.
최근, mAb 기반 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs) 질적 및 양적 분석 음식과 자연 제품 적용 되었습니다. 사실,이 생물 학적 샘플 분석 및 임상 테스트에 적용 된 방법과 또한 다른 분석5와 관련 된 지루한 전처리 단계를 피하 면 서, 민감한, 정확 하 고 고효율로 표시 되었습니다. 6.
MAb 기반 ELISAs를 사용 하 여 복잡 한 천연물 연구, 단일 클론 항 체의 준비 핵심 단계 중 하나입니다. 불행히도, 이러한 유형의 물질6,7,,89,10,11,12에 작은 bioactive 구성 요소에 특정 mAbs ,13,,1415 는 제한 된 단백질 항 원에 비해. 이 문제를 회피, 특히 작은 화합물에 대하여 mAbs를 생성 하는 프로토콜을 개발 했습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 합성 인공 항 원, 마우스 면역, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 단일 클로 널 hybridoma 준비 포함 됩니다.
특히, 우리의 연구 그룹 mAbs 전통 중국 의약품에서 작은 생리 활성 화합물에 대 한 형성을 공부 하 고 수년간 그들의 애플 리 케이 션을 개발 되었습니다는. 우리의 지속적인 연구에 mAbs baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic 산18, paeoniflorin19, ginsenoside 다시20, ginsenoside Rh121, 그리고 다른 많은 작은 분자에 대 한 개발 했습니다. 이러한 mAbs에 따라 우리의 ELISA 프로토콜 연구의 숫자에 다른 생리 활성 화합물과 그들의 상호 작용으로 이러한 작은 분자의 약 동학을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 이러한 mAbs를 사용 하 여, 우리는 또한 개발 immunoaffinity 착 색 인쇄기 방법 epimers를 포함 하 여 구조상 아날로그의 분리에 대 한. 최근에, 우리는 우리의 안티-puerarin mAb 이후에 급속 하 고, 현장이 화합물의 검출에 사용 된를 사용 하 여 측면 흐름 immunoassay 준비. 우리의 결과 우리의 mAb 기반 분석 실험 생물학을 공부 하 고 특히 전통 중국 의약품에 사용 된 천연 제품 파생 된 화합물의 품질에 대 한 편리 하 고 필수적인 도구 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>800 메시(40 &mu; M 나일론) 필터&nbsp;</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 배양 플레이트</td><td>NUNC</td><td>119567</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 플라스크</td><td>랩서브</td><td>310109016</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)</td><td>시그마 알드리치</td><td>860336 1G</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 플라스크</td><td>코닝</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 배양 플레이트</td><td>NUNC</td><td>117246</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>AMRESCO</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>원심분리 튜브 15 mL</td><td>Corning</td><td>430645</td><td></td></tr><tr><td>원심분리 튜브 50 mL</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>경운기</td><td>DRP-9082&nbsp;</td><td>삼성</td><td></td></tr><tr><td>투석막 (10kDa)</td><td>Heng Hui</td><td>45-10000D</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드</td><td>시노팜 화학</td><td>DH105-10</td><td></td></tr><tr><td>전자 저울&nbsp;</td><td>BS124-S&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 플레이트, 96 웰</td><td>NUNC</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 96 %</td> <td>Sinopharm 화학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute; s 보조제, 완전한</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBM2183V</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute; s 보조제, 불완전</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBL0210V</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>AMRESCO</td><td>9764-500g</td><td></td></tr><tr><td>그라디언트 쿨러 용기</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>HAT 미디어 보충제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0262-10VL</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG 항체</td><td>applygen</td><td>C1308</td><td></td></tr><tr><td>HT 미디어 보충제</td><td>시그마 알드리치</td><td>H0137-10VL</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>IX73</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>열쇠구멍 림펫 헤모시아닌</td><td>시그마 알드리치</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF-MS&nbsp;</td><td>Axima-CFR&nbsp; 플러스&nbsp; &nbsp;</td><td>액시마&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>BioTex</td><td>ELX-800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마우스</td><td>바이탈 리버&nbsp;</td><td>BALB/c</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>베이징 BIODEE</td><td>5008-25g</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>시그마 알드리치</td><td>RNBC6325</td><td></td></tr><tr><td>페니실린& 스트렙토 마이신 용액</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>피펫 10 mL</td><td>COSTAR</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>피펫 25 mL</td><td>FALCON</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>applygen</td><td>P1622</td><td></td></tr><tr><td>sodium periodate</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>BW-G0008</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &마이크로; L</td><td>스타랩</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr></tbody></table>

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

식품 및 천연 제품에 생리 활성 구성 요소 분석 전통적인 중국 의학 및 식품 안전/독극물을 포함 한 많은 분야에서 연구의 인기 지역이 되었다. 고전 분석 기술의 많은 고가의 장비 및 전문 지식이 필요합니다. 특히, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs) 식품 및 천연 제품의 분석에 대 한 새로운 방법 되고있다. 이 방법은 항 체 중재 탐지 대상 구성 요소를 기반으로 합니다. 그러나, 많은 자연 제품에서 생리 활성 구성 요소는 작은 (< 1000 다)와 면역 반응을 유도 하지 마십시오, 그들에 대하여 단일 클론 항 체 (mAbs)을 만드는 것은 종종 어려운. 이 프로토콜 mAbs에 대 한 분자를 대상으로 여러 샘플에서 화합물의 빠른 분석에 대 한 관련된 간접 경쟁 (ic) ELISA를 만드는 데 필요한을 생성 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 절차 인공 항 원 (즉, hapten-운반대 공액)의 합성, 면역, 세포 융합, 단일 클로 널 hybridoma 준비, mAb, 특성화 고는 mAb의 ELISA 기반 응용 프로그램에 설명합니다. Hapten-운반대 공액 나트륨에 의해 합성 되었다 메서드를 periodate 하 고 MALDI TOF MS에 의해 평가. 예방 접종, 후 splenocytes 가장 높은 항 체 titer로 면역된 한 마우스에서 고립 되었고 hypoxanthine aminopterin 티 미 딘 (모자)-민감한 마우스 myeloma 세포 선 s p 2/0-Ag14 융합 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 사용 하 여-방법을 기반으로. Hybridomas 은닉 mAbs 대상 항 원에 반응 특이성 및 분에 대 한 icELISA에 의해 상영 했다. 또한, 제한 희석 메서드는 단일 클로 널 hybridomas 준비에 적용 되었습니다. 최종 mAbs icELISA 특징 추가 되었고 예제 hapten (naringin (NAR)) 자연 제품에서의 신속 하 고 편리한 검출 ELISA 기반 응용 프로그램에서 활용.

단일 클로 널 hybridomas의 세대
Hapten-운반대 켤레의 분자량은 MALDI TOF MS 분석에 의해 확인 됐다. BSA와 NAR의 분자량 알려져 있습니다, BSA로 활용 하는 작은 분자의 수를 계산할 수 있습니다. 그림 1 은 NAR BSA22, m/z 77,058에 광범위 한 피크를 표시에 대 한 대표적인 스펙트럼 결과 보여줍니다. BSA의 평균 분자량은 66,430, 그것은 적어도 18 NAR 분자 (MW 581) BSA와 활용 했다 나타납니다 (어 금 니 커플링 비율 (NAR:BSA) = 18:1).
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이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

단일 클론 항체는 단일 B 림프구 클론과 동일한 에피토프에 결합하는 단발성 항체로부터 생산되는 모노 특이적 항체로 알려져 있다. 최근에는 단일클론 항체 기반 ELISA가 식품 또는 천연 물의 질적 또는 정량적 분석을 위한 새로운 플랫폼이 되었습니다. 이 방법은 지루한 전처리 단계없이 정확하고 민감하며 효과적인 방법입니다.따라서 생물학적 샘플과 미래의 임상 적용에 필수적입니다. TCM의 MABs의 준비는 TCM 공식의 복잡한 시스템 특성에 대한 연구에서 중요한 단계입니다. 인공항원 합성, 마우스 예방 접종 및 세포 융합을 포함한 작은 분자 화합물에 대한 mAB를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.상기 햅텐은 인공 항원합성을 위해 담체 단백질과 연결된다. 인공 항원 및 완전한 보조제는 혼합 및 유화됩니다. 마우스는 피하 주입에 의해 면역되었다.예방 접종 마우스의 비장을 꺼내 단일 셀 서스펜션을 합니다. 골수종 세포를 혼합합니다. 비장세포는 PEG 방법에 의한 HAT 에 민감한 마우스 골수종 세포주와 분리되고 융합된다.ELISA에 의해 항체를 준비할 수 있는 세포줄을 선택합니다. 항원에 반응하는 단클론 항체를 분비하는 Hybridomas는 복제됩니다. 잡종 세포주 분주 보존을 확립한다.주기적인 산화 절차는 나리진 BSA 공주물의 합성을 위해 사용되었다. 첫째, narigin은 새로 준비된 나트륨 pariodate 용액의 100 마이크로리터에서 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도에서 나리진 용액의 5밀리리터에 용해되었습니다. 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 저어.둘째, 나리진 나트륨 주기반응 혼합물에 담체 단백질 2밀리리터를 첨가한다. pH 9 용액에 혼합물을 조정하고 6 ~ 8 시간 동안 계속 반응합니다. 셋째, 인공 항원은 CBS를 분리하기 위해 3 일 동안 PDS의 투석 방법으로 정제되었다.Freund의 완전한 보조제와 불완전한 보조제는 마우스 예방 접종에 사용되었습니다. 예방 접종을 위해, 50 마이크로그램의 공주를 Freund의 완전한 보조제와 동일한 양으로 혼합하고 완전히 유화하십시오. 등쪽 피하 주사를 통해 각 BALB/c 마우스에 이 혼합물의 100 마이크로그램을 관리합니다.2주 후 피하 주사를 통해 부스터 예방 접종을 제공하며, 동일한 양의 컨쥬게이트와 불완전한 보조가 섞입니다. 1차 예방접종을 위해, Freund의 완전한 보조제 및 면역원들은 피하 주사를 통해 사용되었습니다. 부스터 예방 접종의 경우,

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 중쇄 및 경쇄 유전자를 가진 플라스미드 벡터를 도입하여 포유류 세포에서 항체를 생성하는 방법을 보여줍니다. 이 벡터는 폴리에틸렌과 상호 작용하고 폴리플렉스를 형성하여 세포에 들어갑니다. 나중에, 그들은 개별 단백질로 번역되어 완전한 항체로 조립되어 세포 외 배지로 분비됩니다.

포유류 세포 배양에서 재조합 단클론 항체 생성

이 비디오는 항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술을 보여줍니다. 분리된 항원 특이적 B 세포에서 복제된 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 진핵생물 발현 벡터는 폴리플렉스를 사용하여 포유류 세포에 도입됩니다. 일단 세포 내부로 들어가면 이러한 벡터는 번역을 거치고, 그 결과로 생성된 중쇄 및 경쇄 펩타이드는 항체로 조립되어 세포에서 분비됩니다.

항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술

인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

하이브리도마 기술을 기반으로 한 단클론 항체 생성을 위해 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마우스는 면역접합체로 면역되었습니다. 비장 세포는 PEG와 전기 충격에 의해 불멸의 골수종 세포와 융합되었습니다. 항체 생산 하이브리도마 세포는 HAT 및 항원 특이적 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었습니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포에서 발현되는 재조합 항체 단백질과 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하여 생산된 단클론 항체는 돼지 아미노펩티다아제 N(APN) 단백질을 인식하고 결합할 수 있습니다.

돼지 장 점막 상피에서 아미노펩티다아제 N을 표적으로 하는 단클론 항체 생산

C57BL / 6 마​​우스는 HC의 pathogenesis을 연구하고 최상의 모델을 제공하는 데 사용되었습니다. 우리는이 곰팡이에 대한 체액성 면역의 가능성 혜택을 탐구하고 [히스톤 H2B와 열 충격 단백질 60kDa로] 여러 mAbs를 생성 우리가 intraperitoneal 행정부 이후에 그들의 보호 효능에 대한 테스트 것을.

반대 단클론 항체의 수동적 관리 H. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을

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천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

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