Name: 절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 배우세요 설치류 뇌에서 혈청 없이 고순도 미세아교세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에서 세포 형태학 및 중추신경계 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 크리스토퍼와 다 나 리브 재단 국제 연구 컨소시엄 셀던 G. 샌즈 의료 연구 재단, JPB 재단, 노바 티 스 연구소의 기본 연구, 척수 부상, 박사 미리 암에 의해 지원 되었다 빈센트 고 스텔라 Coates, 그리고 Damon Runyon 암 연구 재단 (DRG-2125-12)에서 관대 한 기여 금.

설치류와 관련 된 모든 절차 스탠포드 대학 지침, 국가 및 국가 법률 및 정책 준수에 맞 췄 나. 모든 동물 절차는 실험실 동물 관리에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 승인 되었다.
참고: 모든 솔루션 및 버퍼 구성 재료의 테이블에에서 제공 됩니다.
1. CD11b Immunopanning (하루 0)에 대 한 페 트리 접시를 준비
참고: 모든 1-2 청소년 쥐 두뇌에 대 한 1 immunopanning 접시를 준비 합니다.
<ol><li>15 cm 배양 접시를 50 mM Tris pH 9.5 솔루션의 25 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>6 µ g/mL의 최종 농도 대 한 접시에 염소 반대로 마우스 IgG (체인 H + L)를 추가 합니다. 균일 하 게 배포 플레이트를 소용돌이 친다.</li>
	<li>1-3 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어</li>
	<li>린스 요리 세 번 DPBS+ + (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +), 다음 1 µ g/mL OX42 항 체를 포함 하는 버퍼를 패닝의 솔루션 바꿉니다. 평평한 표면에 실 온에서 하룻밤 요리를 둡니다.</li>
</ol>2. 조직 컬렉션 (1 일)
참고:이 프로토콜은 3 ~ 4 h 소요 됩니다.
<ol><li>시작 하기 전에, 모든 솔루션은 살 균 및 냉장 얼음에 확인 합니다. 얼음에 모든 악기를 진정 하 고 에탄올을 사용 하기 전에 소독.</li>
	<li>적절 한 규제 절차에 따라 이산화탄소 질 식에 의해 청소년 실험실 쥐를 희생. 참고: 또는, 젊은 동물 수 희생 케 타 민/xylazine (100-200 µ L 24 mg/mL의 마 취 제, 2.4 mg/mL xylazine)의 치명적인 복용량. 케 타 민/xylazine 동물 14 일 미만 경우 사용 되어야 한다. 여러 동물을 사용 하 여, 하나의 동물에서 조직을 추출 하 고 이후 동물에 진행 하기 전에 얼음에 미리 냉장된 DPBS+ + 에 배치.</li>
	<li>핀치는 hindpaw 하 고 진행 하기 전에 동물에서 완전 한 응답을 확인 합니다.</li>
	<li>Transcardially perfuse 버퍼 실행 취소 될 때까지 27½-G 바늘을 사용 하 여 차가운 관류 버퍼의 10-30 mL를 가진 동물. 참고: 볼륨 관류 버퍼의 동물의 크기/나이 따라 달라 집니다.</li>
	<li>재 관류 후 즉시 동물의 머리를 제거 합니다. 해 부가 위, 양쪽에 후 두 관절 돌기를 잘라 척수에서 오는 될 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. 각 측면을 신중 하 게 절단 후 정수 리와 코 뼈를 향해 정면 뼈를 따라 한쪽을 잘라. 집게와 함께 신중 하 게 두개골의 상단을 다시 세우고, 신속 하 게 뇌 (또는 관심의 CNS 구조), 제거 고 미리 냉장된 DPBS+ + 얼음에 합니다.</li>
	<li>모든 나머지 동물에 대 한 반복 합니다. 참고: 모든 진행 단계는 적절 한 무 균 조건 하에서 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다.</li>
</ol>3. 기계적 분리 (1 일)
<ol><li>모든 두뇌가 수집 하 고, 차가운 메스 블레이드, 얼음에 페 트리 접시에 1 m m3 덩어리로 한 뇌를 잘라 고 5-7 mL 차가운 douncing 버퍼와 얼음 dounce 균질 화기를 전송. 한 번에 하나의 뇌를 분리.</li>
	<li>느슨한-피팅 dounce 균질 화기와 10-20 부드럽고 불완전 한 스트로크를 사용 하 여 조직의 해리 알아서 하지 직접 분쇄, 균질 화기의 하단에 조직 하지만 대신 억지로 피스톤의 측면과 균질 화기 사이 공간을 통해 조직.</li>
	<li>조심 스럽게 기포의 소개를 방지 하기 위해 피스톤을 제거. 제대로 끊된 조직 덩어리, 균질 화기의 바닥에 정착 하 고 상쾌한 새로운 냉장된 50 mL 원뿔 튜브에 전송.</li>
	<li>신선한 douncing 버퍼에 제거 된 볼륨을 바꿉니다 고 3-4 라운드, 또는 모든 조직의 해리 되었습니다 때까지 총 3.2 및 3.3 단계를 반복 합니다. 각 두뇌에 대 한 절차를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 수 초 제거 (1 일)
참고: 수 초 제거 microglia P12 보다 더 오래 된 동물에서의 절연을 위해 사용 됩니다.
<ol><li>25 mL 피 펫을 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을의 볼륨 측정 다음 33.5 ml 전체 볼륨을 조정 하려면 얼음 douncing 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액을 혼합 수 초 분리 버퍼 (MSB)의 10 mL 추가 철저 하 게 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여. 이 43.5 mL의 볼륨에 MSB의 23% 최종 농도 발생 합니다.</li>
	<li>셀 느린 제동 4 ° C에서 500 x g에서 15 분 동안 원심 참고:는 원심 분리기 감속을 약 1.5-2 분 소요 됩니다. 이 myelin 및 죽은 세포 파편, 다소 어두운 상쾌한, 그리고 라이브 셀에 대 한 풍부 하 게 더 작은 펠 릿의 상위 계층을 생성 합니다.</li>
	<li>수 초/파편과는 피 펫과 상쾌한의 상위 레이어를 제거 합니다. 그것의 다량은 가능한 제거를 보장 하기 위해 상위 계층을 분리할 때 주의 합니다.</li>
	<li>버퍼를 패닝의 12 mL에서 셀 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 헤어 셀 수 있는 어떤 덩어리 셀 서 스 펜 션 triturate.</li>
</ol>5입니다. Immunopanning (1 일)
<ol><li>70 µ m 셀 거르는 큰 파편 또는 셀 덩어리 제거를 통해 세포 현 탁 액을 전달 합니다.</li>
	<li>세 번 DPBS+ +와 OX42 코팅 패닝 접시를 헹 구 십시오. 접시를 허용 하지 않습니다 완전히 건조 세척 사이.</li>
	<li>마지막 DPBS+ + 세척을 부 어와 패닝 접시에 필터링 된 셀 서 스 펜 션 적용. 부드럽게 셀, 배포 접시 소용돌이 다음 준수를 셀 수 있도록 20 분 동안 실 온에서 평평한 표면에 접시를 품 어. 20 분 이상 품 어 하지 마십시오 또는 셀 매우 어려운 요리에서 복구 될 것 이다.</li>
	<li>비 부착 한 세포를 제거 하 DPBS+ + 와 함께 패닝 접시 10 번을 씻어. Microglia 됩니다 그래서 다른 비 부착 한 세포의 제거를 보장 하기 위해 각 린스 접시 소용돌이 플레이트에 단단히 고정 되어.</li>
	<li>마지막 DPBS+ + 세척을 부 어와 15 mL DPBS+ + 와 200 μ 트립 신 (1.25% 재고 솔루션)을 바꿉니다.</li>
	<li>10% CO2 trypsinize를 37 ° C에서 ≤ 10 분 요리를 품 어. 참고: 10 분 이상 계속 하지 마십시오 또는 microglia 제거 하기 어려운 될 것 이다.</li>
	<li>Trypsinization의 10 분 후 microglia 여전히 접시에 붙어 있을 것입니다. 트립 신/DPBS+ + 를 부 어와 부드럽게 씻어 트립 신을 제거, 얼음 처럼 차가운 microglia 성장 매체 (MGM)의 12 mL 바꿉니다 DPBS+ + 2 x.</li>
	<li>셀/기판 상호 작용을 약하게 하 고 접시를 확인 데 접시 2 분 동안 얼음에 이동 하는 장소는 패닝 접시의 영역 밖으로 건조 하지 않도록 플랫.</li>
	<li>10 mL 피 펫 및 피펫으로 컨트롤러와 고속 패닝 접시에서 세포를 회복 하기 위해 적극적으로 플라스틱. 시도 하 고 모든 셀을 제거 피 펫에서 액체의 흐름으로 16 × 16 그리드를 그립니다.</li>
	<li>세포는 접시에서 분리 되도록 20 배 확대에 현미경으로 세포를 확인 합니다. 어디 셀 여전히 붙어 접시 위에 마크 명소 그리고 그 지역에 pipetting 반복.</li>
	<li>셀 서 스 펜션과 15 mL 원뿔 튜브 당 상쾌한의 aliquot 3-4 mL를 수집 합니다. 천천히 브레이크와 4 ° C에서 500 x g에서 15 분 회전 합니다. 참고: 회전 하는 작은 볼륨을 통해 microglia 셀의 최대 복구 할 수 있습니다.</li>
	<li>셀 펠 릿으로 MGM의 0.5 mL를 떠나 상쾌한 발음</li>
	<li>나머지 MGM에서 각 펠 릿을 resuspend 하 고 모든 튜브에서 셀 수영장.</li>
	<li>Hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>6 단계-응용 프로그램에 따라 7에에서 설명 된 대로 세포를 플레이트.</li>
	<li>10% CO2와 37 ° C에 문화 세포. 참고: 셀 일반 미디어 변경 최대 3-4 주 또는 미디어 변경 없이 1 주일에 대 한 문화를 수 있습니다.</li>
</ol>6. 현장 조직 문화 접시/Coverslips (주 1) 코팅
<ol><li>24 잘 음이온/양이온 코팅된 조직 문화 접시의 중앙에 직접 콜라겐 IV 코팅의 15 µ L 플레이트 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조) 및 10% CO2와 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>후에 MGM에 105/mL x 2.3 hemocytometer 희석 셀과 셀을 카운트. 콜라겐 4 자리를 하 고 즉시이 자리;에 세포 현 탁 액의 접시 15 µ L 발음 이 3.5 x 103 셀/자리를 줄 것 이다. 품 어 준수,의 CO2-500 µ L equilibrated TGF-β2/IL-34/콜레스테롤 포함 성장 매체 (TIC) 추가 셀 수 있도록 10% CO2 와 37 ° C에서 5-10 분 동안 부드럽게 잘 하.</li>
	<li>Coverslips, 10 µ g/mL 계략-D-라이 신 (PDL) H2O에서 RT, 1 시간에 대 한 첫 번째 코트 불 임 유리 coverslips에 도금 하는 경우 H2O, 3 번 세척 하 고 후드 UV 빛의 밑에 건조 하자. Coverslips는 건조, 일단은 coverslips에 자리 도금 단계 6.2에서 설명 된 대로 진행.</li>
</ol>7. RNA/단백질 격리 도금
<ol><li>하루에 1, 코트는 24-잘 음이온/양이온의 전체 영역 콜라겐 IV 코팅 조직 배양 플레이트를 코팅에 대 일 분-1 시간 10% CO2, 37 ° c를 품 어 다음 제거 하 고 즉시 접시 3-5 x 104 셀/CO2 잘 equilibrated TIC 미디어입니다.</li>
	<li>2 일에 수행 50% 미디어 변화를 각각에 대 한 준비 후 잘 날. 우물의 센터에서 클러스터, 그래서 미디어 거기에서 죽은 세포에 의하여 경향이 있다.</li>
	<li>문화를 유지 하기 위해 50% 미디어 변화 2-3 일 마다 수행 합니다. 미디어 변경 문화에 대 한 원치 않는 변수, 소개 셀 미디어 변경, 정기적인 유지 보수와 함께 3 주 이상 반대 없이 대략 1 주 동안 살아남을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
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<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
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<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

Microglia CNS의 센 티 넬 면역 세포 역할을, 때문에 그들은 높은 반응 환경 변화; 따라서, 주의 그들의 고립과 문화8동안 셀 내에서 선 동적인 응답을 최소화 하기 위해 필요 합니다. 이것은 속도 온도 통해이 프로토콜에서 수행 됩니다. 동물 차가운 관류 버퍼 끼얹는다는 가능한 크게 저하 활성화, 모든 원심 분리 단계 4 ° C에서 열릴 때마다 얼음에 또는 4 ° C에서 세포를 유지, 그리고 프로토콜 조직 사이 시간을 최소화 간소화 되었습니다. 추출 하 고 세포의 경작입니다. 갓 고립 된 세포의 유전자 표현 패턴을 평가 하는 경우 세포 lysates trypsinization 최소한 절연 유도 된 변화를 계속 하기 전에 CD11b immunopanning 요리에서 직접 수확. 주목 해야 한다도 신중 하 게 고립 된 해당 microglia 실행의 본질적으로 격리 절차와 관련 된 피해 관련 신호 인식, 아마도 따뜻한 온도에 배치 되 고 즉시 염증 반응. 프로토콜을 성공적으로 수행한...

CNS 실질의 대 식 세포로 microglia 신경 회로 폐해 신호 네트워크의 광대 한 배열을 상호 작용 합니다. 그들은 개발 및 시 냅 스의 가지 치기, apoptotic 세포 클리어런스 및 신경 프로세스1,2과도 상호 작용을 통해 뇌의 항상 성에 중요 한 역할. Microglia는 선 동적인 응답을 조정 및 제한 출혈3,4병 변 사이트에 그들의 길고, 얇은 프로세스를 확장 하는 신경 상해에 초기 응답자. Microglial 형태 및 기능에 변화는 급성 및 만성 CNS 상해에 유비 쿼터 스와 microglia 전시 변경 형태학, 지역화, 그리고 다양 한 질병 상태1에 염증 성 중재자의 표현. 인간 유전자 연구는 신경 퇴행 성 질환에 대 한 위험을 변경 하는 돌연변이 종종 주로 또는 독점적으로 표현 microglia microglia 질병 병 인 또는 진행5에 대 한 중요 한 역할을 가리키는 그대로 CNS에 의해 나타냅니다. . 상해 및 질병에 그들의 굴지를 감안할 때, 새로운 치료 접근을 개발 하기 위한 높은 우선 순위는 microglial 생물학의 이해 발전.
Microglial 생물학의 이해에 많은 중요 한 발전 기술과 문화 방법, 기능 정의 진 식 프로필, 등 다른 대 식 세포 인구의 학문에서 발견 하는 메커니즘을 바탕으로 발현 형태 / 상태. 대 식 세포 기능 CNS 풍경 내 놀라운 방법으로 자주 연주 일반화 microglia 스스로 매우 전문, 전시는 없는 형태 그리고 다른 조직 들을 차별 하는 독특한 유전자 식 서명 대 식 세포6. Microglia는 혈통은 다른 대부분의 다른 조직 대 식 세포; 그들은 원시 조의 초기 배아 파도 동안 CNS 식민지 하 고 자기 인생에 걸쳐, 최종 조7에서 기여의 독립 갱신. 성인 microglia의 완전히 성숙한 진 식 서명 하지 두 번째 출생 후 주8까지 이루어집니다. 주위 조직에서 환경 신호 특정 조직 대 식 세포 기능6, CNS에서 포함 하는 혈액-뇌 장벽9에 의해 부여 된 혈액 부담 요인에 제한 노출을 지시에 주요 역할을 한다.
완전히 microglial 기여 CNS 항상성 및 질병을 이해 하는 데 하나의 장애물은 업과 성숙한 microglia 본 비보에 순화 된 세포의 특수 속성의 어려움 생체 외에서. 많은 방법은 격리 하기 위해 개발 되었습니다 그리고 세포 생존을 지원 하기 위해 혈 청에 의존 하는 문화 그대로 microglia, 하지만 대부분의 방식. 우리는 본질적으로 가변 시 생리 활성 분자의 광대 한 배열을 포함 하는, 특히 문제가 microglia 작업 amoeboid 형태학 촉진 하기 때문에 증가 확산, 혈 청의 그 추가 나타났습니다 그리고 microglia 혈액-뇌 장벽 파괴 후 요소를 부담 하는 혈액에 노출 되 면 증가 먹어서9 vivo에서 수시로 보인다. 이 통계에 의해 혈 청 노출 셀 부상이 나 질병 상태, microglia 비슷하지만 이러한 변경 감소 때 microglia CSF-1 (또는 IL-34)를 포함 하는 정의 된 성장 매체, TGF-β, 콜레스테롤, 및 selenite 교양.
이 프로토콜 조건 하에서 혈 청 무료, 최근에 출판 된 작품9관련 청소년 쥐 microglia 경작에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜에서 출생 후 하루 21-30 (P21-P30), 쥐를 간소화 하지만 수율과 전반적인 생존 종 및 동물의 나이 따라 달라 집니다 하지만 microglia 쥐 및 쥐의 모든 나이에서 분리를 적용할 수 있습니다. 최대한 하 고 최적의 생존 때 약간 미 숙 microglia를 사용 하 여 얻을 수 있다 (~ P9), 수율 및 점차적으로 성인 동물에 있는 저수준에 다소 가늘게 생존. Microglia 또한 마우스에서 격리 될 수 있습니다 하지만 우리는 쥐 세포 보여 상당히 높은 수익률, 생존, 그리고 없는 형태학의 복잡성 마우스 셀 세럼 무료 문화에 비교 될 때 나타났습니다. 동물 세 P50 보다 큰이 프로토콜 평가 되지 않았습니다. 이 immunopanning 격리 절차는 격리 하는 동안 microglial transcriptional 프로필에 변화를 최소화 하 고 셀의 다운스트림 생존 능력을 극대화 하기 위해 최적화 되었습니다. 이러한 기술과 미디어 공식 사용, 높은 생존 능력 주 문화는 주에 대 한 지속 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 경작 Microglia 급속 한 확장 및 프로세스의 철회와 관련 된 매우 없는 형태를 전시 하 고 상대적으로 낮은 확산의 속도. 우리는 이러한 속성에 대 한 혈 청 노출의 중요성을 강조 하 고 힘과 다른 접근에 상대적으로이 방법의 약점을 토론.

<table><tbody><tr><td>쥐 : Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat # 400</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 쥐 CD11b 단클론 (클론 OX42)</td> <td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>패닝 : 1 : 1,000; 염색: 1:500</td></tr><tr><td>염소 다결장 항-IBA1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>토끼 다클론 항-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey 항-마우스 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey 항-염소 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (ICC 염색 시 세제)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td>Galen Laboratory Supplies</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&nbsp;</td>우유 고형물에서 나온 <td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>쥐 IL-34</td><td>R& D 시스템</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>양모 콜레스테롤</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>코닝&nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>올레산</td><td>케이맨 화학&nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) 산</td><td>케이맨 화학제품&nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM 염료</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/ 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 셀레나이트</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (고포도당)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신&nbsp;</td><td>시그마</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 플레이트&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>재고 시약&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>재구성: PBS 에 있는 10 mg/mL 사용된 농도: 1:100 저장: -20°C; C</td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인</td><td></td><td></td><td>재구성 : H2O 에서 5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C</td></tr><tr><td>나트륨 셀렌 산염</td><td></td><td></td><td>재구성 : H2O 에서 2.5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 25,000 저장 : -20 °C; C</td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td></td><td></td><td>재구성 : 200 &mu; PBS의 g/mL 사용된 농도: 1:100 저장: -80°C; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>재구성 : PBS 에서 2 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 < / > 저장 : -20 °C; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>재구성 : 200 &mu; PBS의 g/mL 사용된 농도: 1:1,000 저장: -80°C; C</td></tr><tr><td>양모 콜레스테롤</td><td></td><td></td><td>재구성 : 100 % 에탄올에서 1.5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 < / > 저장 : -20 °C; C</td></tr><tr><td>헤파란 설페이트</td><td></td><td></td><td>재구성 : H2O 에서 1 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C</td></tr><tr><td>올레산/곤도산</td><td></td><td></td><td>재구성: 곤도익: 0.001 mg/mL; 올레산 : 100 % 에탄올에서 0.1 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C</td></tr><tr><td>헤파린</td><td></td><td></td><td>재구성 : PBS 에서 50 mg / mL 사용 농도 : 1 : 100 저장 : -20 °C; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>관류 버퍼</td><td></td><td></td><td>레시피: 50 &mu; g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 코멘트: 얼음처럼 차가울 때 사용</td></tr><tr><td>버퍼</td><td></td><td></td><td>레시피: 200 &mu; L DPBS 50 mL에 0.4 % DNaseI의 >< 코멘트 : 얼음처럼 차가운</td></tr><tr><td>패닝 버퍼</td><td></td><td></td> 레시피 : DPBS ++ Microglia 성장 배지 (MGM)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>의 우유 고형물에서 펩톤의 2 mg / mL 레시피 <td>: 100 units / mL 페니실린, 100 &mu를 포함하는 DMEM / F12; g/mL 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 5 &μ; g/mL N-아세틸 시스테인, 5 &mu; g/mL 인슐린, 100 &mu; g/mL 아포 트랜스페린 및 100ng/mL 아셀렌산나트륨 코멘트: 얼음처럼 차가운 MGM을 사용하여 접시에서 미세아교세포를 제거합니다.</td></tr><tr><td>콜라겐 IV 코팅</td><td></td><td></td><td>레시피 : MGM 함유 2 &mu; g/mL 콜라겐 IV</td></tr><tr><td>미엘린 분리 버퍼</td><td></td><td></td><td>레시피: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ 및 Mg++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &뮤; L 1 M MgCl2 코멘트: 첨가 후 잘 섞어주세요&nbsp; CaCl2 및 MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/콜레스테롤 함유 성장 매체(TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>조리법: 인간 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL 쥐 IL-34, 1.5 &mu를 함유한 MGM; g/mL 양모 콜레스테롤, 10 &mu; g/mL 헤파란 황산염, 0.1 &mu; g/ml 올레산, 및 0.001 &mu; g/ml 곤도산 코멘트: 37°C로 데워진 매체에 콜레스테롤을 추가하는 것을 확인하십시오 &deg; C를 선택하고 1.5 이상을 추가하지 마십시오 &mu; g/mL 또는 침전됩니다. 콜레스테롤 함유 매체를 여과하지 마십시오. 최적의 pH를 보장하기 위해 세포에 추가하기 전에 30분-1시간 동안 TIC 배지를 10% CO2로 평형을 이룹니다.</td></tr></tbody></table>

절연 및 동적 홍보 설치류 microglia의 문화 ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia 모든 중앙 신경 시스템 (CNS) 세포의 5-10%를 대표 하 고는 점점 더 주목 그들의 공헌으로 인해 개발, 항상성, 및 질병. 세포 연구 세부에 십 년간, microglia의 특수 기능, CNS의 주민 조직 대 식 세포, 비록 성숙 microglial를 정리 하는 능력에서 제한 때문에 부분에서 크게 신비 남아 있다 문화에서 속성입니다. 여기, 우리는 성숙한 쥐 두뇌에서 순수한 microglia의 신속한 격리에 대 한 간단한 절차를 보여 줍니다. 우리는 또한 시간이 지남에 microglial 생존 능력의 높은 수준을 지 원하는 혈 청 무료 문화 조건을 설명 합니다. 이 정의 매체 조건 하에서 경작 Microglia 전시 정교한 없는 프로세스와 동적 감시 동작. 우리는 교양된 microglia에 혈 청 노출의 일부 효과 설명 하 고 이러한 혈 청 무료 문화 microglia 시내 vivo으로 혈 청 노출 문화 모두를 비교 하는 방법에 대해.

이 프로토콜 젊은 쥐에서 문화 고 순도 ramified microglia를 방법을 설명합니다. 비슷한 결과 얻어질 수 있다, 주 미 숙 하 고 성인 동물을 사용 하 여 아래 설명 된 대로. 셀 격리는 종종 미묘한 뉘앙스와 죽을 셀에 대 한 많은 기회를 포함, 우리는 다양 한 단계에서 성공을 확인 하는 데 품질 관리 검사점을 사용. 우리는 일반적으로 셀 정지는 hemocytometer를 사용 하 여 격리 프로토콜 (그림 1A)의 여러 단계에서 모니터링 합니다. 성공적인 격리 2.5-5 105 셀/청소년 동물 배를 양보 한다. P7-P15에서에서 동물 반면 P30 보다 더 오래 된 동물에서 분리 된 세포 가까이 105 세포/동물 x 2.5 수익률 105 세포/동물, x 5에 가까운 수익률을 보여줍니다. 총 셀 모니터링 넘어 프로토콜을 통해 건의 그것은 microg...

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

이 세포 배양 프로토콜의 전반적인 목표는 혈청에 노출되지 않고 유지될 수 있는 개발 중이거나 성체 설치류로부터 매우 순수한 미세아교세포 배양을 생성하는 것입니다. 이 절차는 미세아교세포의 형태학, 섬유성 케토시스 및 미세아교세포와 다른 CNS 세포 유형의 상호 작용과 관련된 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 미세아교세포가 모든 연령의 설치류 조직에서 빠르게 분리되고 혈청에 노출되지 않고 배양될 수 있다는 것입니다.뇌를 제거하려면 뇌가 손상되지 않도록 주의하면서 박리 가위로 동물의 척수에서 후두과를 양쪽으로 잘라냅니다. 그런 다음 두개골 위쪽을 따라 피부를 자르고 두정골과 전두골을 따라 코뼈 쪽으로 한쪽 면을 자릅니다. 집게로 두개골 상단을 조심스럽게 뒤로 당기고 뇌를 빠르게 제거한 다음 얼음 위의 미리 식힌 DPBS에 넣습니다.나머지 모든 동물에 대해 절차를 반복합니다. 차가운 DPBS에 뇌를 모은 후, 차가운 메스 칼날로 얼음 위의 페트리 접시에 담긴 각 뇌를 1입방미터 덩어리로 자르고 5-7밀리리터의 얼음 냉각 완충액이 있는 얼음 차가운 도운싱 균질기로 옮깁니다. 다음으로, 느슨한 dounce 균질화기를 사용하여 10-20 번의 부드럽고 불완전한 스트로크로 조직을 해리합니다.균질기 바닥의 조직을 직접 부수지 않도록 주의하십시오. 대신, 피스톤의 측면과 균질화 장치 사이의 공간을 통해 조직을 밀어 넣으십시오. 미세아교세포의 생존력을 보존하기 위해 여러 차례의 돌림으로 조직을 천천히 균질화하는 것이 중요합니다.그런 다음 기포가 유입되지 않도록 피스톤을 조심스럽게 제거하십시오. 제대로 해리되지 않은 조직 덩어리가 균질기의 바닥에 가라앉고 상등액을 새로운 냉각된 50ml 원추형 튜브로 옮기도록 합니다. 그런 다음 제거된 부피를 새로운 도운싱 버퍼로 교체하고 총 3-4회 동안 또는 모든 조직이 해리될 때까지 해리 절차를 반복합니다.이 절차에서는 세포 현탁액이 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 얼음처럼 차가운 완충액을 추가하고 총 부피를 33.5ml로 조정합니다. 다음으로, 10ml의 MSB를 세포 현탁액에 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 철저히 혼합합니다. 그 결과 43.5 밀리리터의 부피에서 MSB의 최종 농도가 23 %가 됩니다.그 후, 섭씨 500도에서 4 x g의 속도로 15분 동안 세포를 천천히 제동하여 원심분리합니다. 그런 다음 피펫으로 수초와 파편과 상층액의 최상층을 제거합니다. 상단 레이어를 제거할 때 가능한 한 많이 제거되도록 주의하십시오.그런 다음 세포 펠릿을 12ml의 패닝 버퍼에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 분해하여 남아 있는 세포 덩어리를 분해합니다. 이 단계에서는 70마이크로미터 세포 여과기에 세포 현탁액을 통과시켜 큰 파편이나 세포 덩어리를 제거합니다.OX42 코팅된 패닝 접시를 DPBS로 세 번 헹굽니다. 세탁 사이에 접시가 완전히 마르지 않도록 하십시오. 마지막 DPBS 세척을 붓고 여과된 세포 현탁액을 패닝 접시에 적용합니다.플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 세포를 분산시킵니다. 그런 다음 세포가 부착될 수 있도록 실온의 평평한 표면에 플레이트를 20분 동안 배양합니다. 20분 이상 배양하지 마십시오. 그렇지 않으면 접시에서 세포를 회복하기가 매우 어려워집니다.그런 다음 패닝 접시를 DPBS로 10회 헹구어 비부착 세포를 제거합니다. Microglia는 플레이트에 단단히 부착되므로 헹굴 때마다 플레이트를 휘젓어 다른 비부착성 세포를 제거할 수 있도록 합니다. 마지막 DPBS 세척을 붓고 15ml의 DPBS와 200마이크로리터의 트립신으로 교체합니다.세포를 트립신화하려면 섭씨 37도에서 10분 미만 또는 그 이상 접시를 배양합니다. 트립신화 10분 후에도 미세아교세포는 여전히 플레이트에 달라붙습니다. 혼합물을 붓고 DPBS로 플레이트를 두 번 부드럽게 세척하여 트립신을 제거합니다.그런 다음 12ml의 얼음처럼 차가운 MGM으로 교체하십시오. 그런 다음 패닝 접시를 얼음 위에 2분 동안 올려 세포와 기질 상호 작용을 약화시키고 접시가 평평하여 패닝 접시 부분이 마르는 것을 방지합니다. 그 후, 10 밀리리터 피펫과 피펫 컨트롤러로 고속으로 격렬하게 피펫을 사용하여 패닝 접시에서 세포를 회수합니다.피펫에서 액체가 흐르는 16 x 16 그리드를 그려 모든 세포를 제거합니다. 전반적인 세포 회복과 배양의 건전성 사이의 균형을 찾는 것이 중요합니다. 패닝 접시에 세포 상층액을 반복적으로 피펫팅하면 배양액의 생존력이 감소합니다.20배 배율로 현미경으로 세포를 검사하여 플레이트에서 분리되었는지 확인합니다. 접시 위에 세포가 붙어 있는 부분을 표시하고 해당 영역에서 피펫팅을 반복합니다. 세포 현탁액을 수집하고 각 15ml 원추형 튜브에 3-4ml의 상층액을 할당합니다.섭씨 4도에서 500 x g으로 15분 동안 천천히 제동하면서 돌립니다. 15분 후 상층액을 흡인하여 세포 펠릿과 함께 0.5ml의 MGM을 남깁니다. 그런 다음 각 펠릿을 잔여 MGM에 재현탁시키고 모든 튜브에서 세포를 당겨냅니다.그런 다음 혈구계로 세포를 세십시오. 이제 15마이크로리터의 콜라겐 IV 코팅을 24웰 음이온성 코팅 조직 배양 플레이트의 중앙에 직접 플레이트하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 혈구계로 세포를 계수한 후 MGM에서 2.3 x 10으로 5밀리리터로 희석합니다.콜라겐 IV 스폿을 흡인하고 즉시 15마이크로리터의 세포 현탁액을 이 스폿에 플레이트하여 스폿당 3개의 세포에 3.5 x 10을 산출합니다. 다음으로, 세포가 부착될 수 있도록 섭씨 37도에서 5분에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 CO2 평형 TIC를 웰에 부드럽게 추가합니다.커버 슬립에 도금하는 경우 먼저 멸균 유리 커버 슬립을 실온에서 1시간 동안 물에 10마이크로리터 PDL로 코팅합니다. 그런 다음 물로 세 번 씻고 자외선 아래에서 후드에서 건조시킨 후 커버 슬립에 스폿 도금을 진행합니다. 고순도 미세아교세포의 성공적인 분리 및 배양을 입증하기 위해 P21 쥐에서 미세아교세포를 분리하고 10% FCS가 보충된 TIC 또는 TIC에서 8일 동안 배양했습니다.그런 다음 세포를 고정하고 미세아교세포 마커와 증식 마커로 염색했습니다. TIC에서 배양된 세포는 ramified 형태, 낮은 수준의 증식 및 미세아교세포 마커의 발현을 보여줍니다. 이에 비해 10%FCS가 보충된 TIC에서 배양된 세포는 미세아교세포(microglial marker)로도 염색되었지만, 활성화된 미세아교세포에서 흔히 볼 수 있는 특성인 높은 수준의 증식 및 아메바 형태를 보여줍니다.세포 마커에 대한 염색 외에도 새로 분리된 세포의 RNA-Seq는 세포의 RNA 프로파일을 평가하기 위한 강력하고 민감한 도구를 제공할 수 있으며 배양의 시작 순도를 알리는 데 도움이 될 수 있습니다. CD11b 마이크로패닝은 일반적으로 CD11b 양성 미세아교세포 외에도 CD11b 양성 호중구 및 단핵구 캐리오버의 작은 비율을 초래합니다. 이러한 세포는 며칠 후에 TIC에서 사멸하지만 이전 시점의 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다.다음은 TIC에서 14 DIV 후 P21 쥐 미세아교세포의 타임랩스 동영상입니다. 2주 후, 무혈청 배양액은 접시 전체에 걸쳐 빠른 프로세스 확장 및 수축을 통해 역동적인 감시 행동을 보여줍니다. 다음은 태아 송아지 혈청에 노출되기 전과 후의 TIC에서 5개의 DIV 후 P21 쥐 미세아교세포의 타임랩스 동영상입니다.혈청 노출 후 급격한 형태학적 변화가 분명합니다. 일단 숙달되면 이 프로토콜은 적절하게 수행되면 4-5시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 미세아교세포 기능에 대한 추가 질문에 답하기 위해 식세포작용, 화학주성, 생존, 사이토카인 방출, 자극에 대한 전사 반응을 모니터링하기 위한 다른 분석을 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 성인 설치류 조직에서 미세아교세포를 신속하게 분리하고 혈청이 없는 조건에서 배양하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해...

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

이 비디오는 쥐의 뇌에서 미세아교세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여줍니다. 그것은 미세아교세포에 특이적인 단클론 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 다른 신경 세포와 비신경 세포에서 미세아교세포를 분리하는 것을 수반합니다.

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free 배지를 이용한 쥐 뇌로부터의 미세아교세포(Microglia)

이 비디오는 1차 쥐 신경 세포 배양에서 미세아교세포를 선택적으로 제거하는 기술을 보여줍니다. 소뇌 과립 뉴런은 증식하는 신경교세포를 제거하기 위해 항대사산물로 처리됩니다. 또한, 배양물에서 미세아교세포를 고갈시키기 위해 리소좀 표적화제로 처리됩니다.

쥐 소뇌 과립 뉴런 배양에서 미세아교세포를 선택적으로 제거

우리는 신생아 대뇌 피질 성인 척수 가능한 미세 아교 세포의 효율적이고 신속한 분리 / 문화 방법을 설명합니다. 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 해부 및 도금은 초기 박리 다음 장소 ~ 10 일을 복용 이후 미세 아교 수확으로 90 분 이내에 수행 할 수 있습니다.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

이 프로토콜은 살아있는, 성인, 인간의 뇌 조직에서 기본 microglia를 격리하는 효율적이고 비용 효율적이며 강력한 방법입니다. 고립 된 1 차적인 인간 microglia는 항상성 및 질병에 있는 세포 프로세스를 공부하기 위한 공구역할을 할 수 있습니다.

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

미세아교세포는 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며, 형태학적, 기능적 적응이 가능합니다. 이들의 이질성과 다기능성은 뇌의 항상성을 유지하는 동시에 다양한 신경학적 병리와 관련이 있습니다. 여기에서는 척수 미세아교세포를 정제하는 기술에 대해 설명한다.

마우스 척수 미세아교세포(Mouse Spinal Cord Microglia)의 빠르고 효율적인 농축

배우세요 설치류 뇌에서 혈청 없이 고순도 미세아교세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에서 세포 형태학 및 중추신경계 상호작용 연구에 활용됩니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

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