Name: 심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 배우세요 국물 미세희석법을 이용한 항진균 화합물 선별 방법을 통해 새로운 항진균제의 활성을 평가하는 기술을 익히세요. 이 방법은 소량의 시약과 자동화를 통해 신속하고 효율적인 선별이 가능합니다.

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우리는 망 토-브라질, CNPq-브라질, FAP/DF 재정 지원에 대 한 감사합니다. 우리는 수정 원고에 대 한 박사 휴고 코스타 Paes에 감사입니다.

1. 솔루션 및 미디어
<ol><li>2 X 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), Sabouraud 포도 당 국물, 및 표 1에 의하여 Sabouraud 포도 당 한 천 준비.</li>
</ol>2. 균 Inoculum 성장 조건
<ol><li>필요할 때까지-80 ° C에서 35% 글리세롤에 냉동된 주식으로 모든 곰 팡이 긴장을 저장 합니다.</li>
	<li>각 실험 하기 전에 다음 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>Candida albicans 종자에 대 한:<ol>
<li>재고 유리병을 해 동 하 고 동요 (200 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 문화와 모자 살 균 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 200 µ L를 전송. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 문화의 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>대 한 Cryptococcus neoformans 긴장:<ol>
<li>재고 유리병의 얼어붙은 표면 다쳤어요. 플레이트 Sabouraud 포도 당 한 천 배지 위에 셀 및 48 h 30 ° c.에 대 한 품 어 고립 된 식민지의 성장을 볼 수, 후 최대 15 일 동안 파라핀 필름으로 밀봉 냉장고 (4 ° C)에 번호판을 유지.</li>
			<li>메 마른이 쑤 시 게 또는 살 균 접종 루프를 사용 하 여 접시에서 중간 크기의 고립 된 식민지를 수집 하 고 살 균 50 mL 원뿔 튜브에서 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 접종. 동요 (200 rpm)에서 30 ° C에서 약 24 h에 대 한 품 어.</li>
			<li>24 시간 보육을 초과 하지 마십시오. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오. 그것은 항상 좋은 항균 성 저항에 영향을 미치는 중요 한 요소 이므로 각 테스트 전에 세포의 성장 단계를 표준화. 참고: 두 균 급속 한 전파, 우리의 실험에서 30 ° C에서 성장 했다 하지만 온도 예 임상 치료 (37 ° C) 연구의 목적에 맞게 변경할 수 있습니다. 가장 중요 한 것은,이 초기 보육 시간 미리 각 균 분리 설립 한다 고 재현성을 보장 하기 위해 모든 테스트를 통해 유지.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>곰 팡이 성장 후 실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 원뿔 관 centrifuging 여 세포를 수집 합니다. 삭제는 상쾌한 고 PBS의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 세포와 원심 분리기 다시 resuspend.</li>
	<li>PBS 세척 및 원심 분리 두 번 더 반복 합니다. 3 세척 후 2 X RPMI-1640 매체의 (에 따라 펠 릿 크기) 5 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 (에 따라 세포 현 탁 액의 탁도)에서 1: 100 또는 1:1,000 희석의 1 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>이 희석의 aliquot 10 µ L 그것 hemocytometer 챔버에 놓고 현미경은 4 개의 코너 사분면에 셀의 총 수를 계산 합니다. 농도 계산 하는 수식으로: (총 셀 수/4) x 희석 요인 x 104 (챔버 희석 상수).<ol>
<li>가능성 조사 및 성장 조건을 체계적으로 공부 되 고 격리에 대 한 상관 되었다 있다 100% 생존 능력을 고려 합니다. 참고: 표준화 및 품질 관리의 생존 할 수 효 모10에 대 한 항균 성 자화 율 테스트 (EUCAST) 항진균 최소 억제 농도 (MIC) 방법에 유럽 위원회에 따라에서 다시 도금 .</li>
		<li>성장/생존 상관 관계 연구 분리에 대 한 설립 되지 않았습니다, phloxine B11, trypan 블루 등 죽은 세포를 선택적으로 색상 염료의 도움으로 hemocytometer 라이브 셀을 계산 하 여 곰 팡이 생존 능력을 측정 12, 야누스 그린13또는. 이 프로토콜에 대 한 곰 팡이 세포를 사용 하 여 경우에이 시점에서 인구의 생존 능력은 90% 이상. 참고: 죽은 살아 있는 염료 선택의 균 류와 함께 잘 작동 하지 않을 수 있습니다. 제발 그들을 사용 하기 전에 테스트 합니다. 예를 들어 trypan blue 염료 C. neoformans와 함께 잘 작동 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그 후, 2 X RPMI-1640 중간에 셀 정지 준비 (2 X 조정 inoculum RPMI 1640 매체에서). 96 잘 접시 각 접시 5 mL의 볼륨을 고려 하십시오.<ol>
<li>모든 C. albicans 변종에 대 한 4 x 103 셀/mL의 재고 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 이 농도 각 음 (2 x 103 셀/mL)에서 최종 셀 농도의 2 배입니다.</li>
		<li>C. neoformans 변종에 대 한 셀 2 × 104 셀/mL의 사진 문화를 준비 합니다. 이 농도 각 잘 (1 x 104 셀/mL)에서 최종 셀 농도 두 번.</li>
		<li>다른 버섯에 대 한 어떤 농도 부 화 시간에 관하여 특정 연구에 대 한 이상적인 것 알려진된 항진균 테스트. 곰 팡이의 물질 대사 및 복제 시간 고려해 서.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 펩 티 드 (알 수 없는 에이전트)
<ol><li>-20 ° C에서 동결 건조 된 펩 티 드를 저장 하 고 각 실험 전에 이온된 수에 그들을 분해. 최대 저장 시간 한 번 물속에에서 녹아 있는 각 펩 티 드의 성격에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>두 번 분석 결과 (2 배)에 테스트 높은 최종 농도의 aliquots을 준비 합니다. 이상적으로, freeze-thaw 주기를 피하기 위해 사용 하는 한 시간에 대 한 충분 한 펩 티 드와 aliquots의 작은 수를 준비 합니다. 참고: 농도 문학 및 펩 티 드의 속성에 근거 한다. 직렬 희석, 펩 티 드의 약 100 µ M와 함께 시작 하 고 다음 줄이거나 얻은 결과 따라이 농도 범위를 증가 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 참조 Antifungals (긍정적인 컨트롤)
<ol><li>그 물에 희석: 분석의 높은 농도의 2 배 솔루션 준비 (섹션 5 참조: 희석 단계에 대 한 항진균 분석 결과).<ol>
<li>C. albicans 변종에 대 한 fluconazole의 128 µ g/mL 또는 caspofungin의 128 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 모두 접시 농도 64 µ g/mL를 될 것입니다.</li>
		<li>C. neoformans 변종에 대 한 암포 B (수용 성 솔루션)의 32 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 플레이트 농도 16 µ g/mL를 될 것입니다. 참고: 일반적으로 암포 B는 희석 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 이후이 항진균 저조한 물에 용 해. 그러나, 상업적으로 이용 가능한 수용 성 암포 B 준비 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antifungals 유기 용 매에 희석에 대 한: DMSO, 재고 솔루션 X 100을 준비 다음에 사용 하기 위해 물에 10 배 희석. 참고: 이렇게, 잘, DMSO의 최종 농도 초과 하지 않습니다 1%. 곰 팡이 컨트롤은 필요한 일부 버섯 용납 하지 않습니다 잘 솔벤트의이 농도 1 %DMSO 포함 하는 미디어에서 성장할 것입니다 우물. DMSO는 감광, 그래서 호 일 접시 커버 또는 잠복기 동안 어두운 챔버에 배치.</li>
</ol>5. 항진균 분석 결과
참고: 항진균 분석 실험 체 외에 는 국물 microdilution 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침 일부 수정에서 시험에 따라 수행 됩니다.
<ol><li>각 펩 티 드의 두 배 직렬 희석을 준비 하 고 항진균 50 µ L의 최종 볼륨을 96 잘 폴리스 티 렌 microplates에서 제어.<ol>
<li>100 µ L의 최고 2 배 농도에서 항진균/펩 티 드의 원하는 열에 최종 농도 1-3, 시내 행 대답 하는 것을 추가 피 펫을 사용 하 여</li>
		<li>H. B 행에, 다른 우물으로 살 균 물의 50 µ L을 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여,</li>
		<li>최고 농도 (A 행)와 우물의 50 µ L을 제거 하 고 농도 (B 행)의 다음에 전송 균질.</li>
		<li>최저 농도와 잘 때까지 위의 단계를 반복 하 고이 잘 (행 H) 50 µ L를 삭제. 빈 컨트롤 또는 네거티브/성장 제어에 대 한만 물에 두고 열 11 및 12 (행 A, B, C).</li>
		<li>추가할 조정된 inoculum X 2의 50 µ L RPMI 1640 매체에 각 음 (열 1-3 플러스 열 11 (네거티브/성장 제어)); C. albicans 에 대 한 최종 농도 2 x 103 셀/mL, 그리고 최종 농도 C. neoformans 변종 104 셀/mL에 될 것입니다 될 것입니다.</li>
		<li>빈 컨트롤을 준비 (50 µ L 물 + 50 µ L 2 셀 없이 X RPMI-1640 매체) 및 부정/성장 제어 (50 µ L 물 + 항진균 없이 50 µ L 조정 inoculum 2 X RPMI-1640 매체), 그리고 위의 설명 대로 잘 플레이트에 부하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테스트할 각 화합물에 대 한 절차 및 선택한 항진균 제어 (열 4-10)를 반복 합니다. 참고: 직렬 희석 할 수 있습니다 세로로 또는 가로로 (즉, 테스트 하는 주어진된 화합물/추출의 희석 수는 8 개 이상의 경우) 접시에 아래, 실험으로.<ol>
<li>화합물, 참조 하는 경우 약물, 또는 그 구성 요소 중 하나는 감광, 감소 빛에 분석 결과 수행, 호, 플레이트 커버 또는 외피 동안 어두운 챔버에 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 옵션 권장 사항을 고려 하십시오.<ol>
<li>로이 증발 감소 가스 교환을 허용 하는 명확한 커버 플레이트 플레이트를 봉인.</li>
		<li>습 한 챔버;에 접시를 놓으십시오 그것은 또한 증발 줄일 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>C. neoformans를 흔들어 200 rpm으로 24 시간 또는 48 h 모든 C. albicans 긴장, 및 48 h 37 ° C에서 번호판을 품 어. 낮은 최종 볼륨 (100 µ L) 아무 일 좀 발생 하는 것을 보장 합니다. 참고: 24 시간에 마이크 읽기와 C. albicans 긴장에 대 한 48 h 사이 상당한 차이가 관찰 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 48 h 수치는 시각화 하기 쉽습니다.</li>
	<li>형태 또한 오염의 흔적을 확인으로 변경 사항을 확인 하려면 잠복기 전후 반전된 광학 현미경의 도움으로 모든 우물을 관찰 합니다. 참고: 읽기 시각적으로 수행 및 실험의 끝에 촬영 될 수 있습니다. 각 읽기 전에 접시 약간 균질. 600의 OD를 측정 하 여 읽기를 수행할 수 있습니다, 셀 묶습니다 경우 또는 filamentation 하지 관찰 된다.</li>
	<li>별도 날짜에 세 번 이상 실험을 수행 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Microdilution 테스트는 화합물, 화합물의 소량을 사용 하 여 대상의 잠재적인 항진균 성 활동을 분석 하 고 동시에 농도의 범위에서 테스트 수 있습니다. 이 따라,이 프로토콜은 잠재적인 새로운 항진균 성 화합물에 대 한 심사의 첫 번째 단계도 권장 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 처음 클리닉, 항진균 치료의 선택에 도움을 설계 되었습니다 M27-A3 프로토콜에 기반은 그리고 새로운 항진균 성 화합물의 다양 한 적응 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 추출 물 또는 화합물의 물리 화학적 기능에 집중할 수 있습니다. 예를 들어 분석 결과에서 잠재적인 후보 나타날 수 있습니다 잘못 효과 미디어에서 화합물 Histatin 514RPMI의 효과 같은 곰 팡이 세포와의 상호 작용을 차단할 수 있습니다. 이 경우에 RPMI 방해 하는 경우에 대 한 대체 매체 MOPS pH 715효 질소 기지 (YNB) 버퍼입니다.
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곰 팡이 감염 되는 중요 한 의료 우려 최근 수십 년간, 상당히 immunocompromised 개인 등 암 치료 및 HIV/에이즈와 함께 사는 사람들의 숫자에 있는 상승 때문에 주로 증가 하는 데 또는 이식 장기1,2. 그러나, 매우 제한 된 배열 사용 가능한 항진균 약물의과 그들에 게 곰 팡이 저항에 대 한 보고서의 증가 조직의 사상 균 병3의 치료제에 관한 주요 문제에 기여.
새로운 항진균 성 화합물의 항균 성 펩 티 드 (암페어), 작은 양이온 펩 티 드 감염4그들의 타고 난 면역 반응의 일환으로 많은 유기 체에 의해 생산 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 심사 방법 곰 팡이 병원 균에 대 한 이러한 화합물을 테스트 하는 표준화 되지. 다른 절차 때때로 동일한 모델 미생물5,,67에 대 한 앰프의 항진균 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 차이 부족의 일부 프로토콜 세부 화합물 및 저해 재현성 사이 비교를 복잡 하 게.
새로운 약 후보자의 테스트를 표준화 하기 위한 한 가지 방법은 항진균 민감성은 임상 등 임상 설정에서 정의 하는 데 사용 하는 지침 및 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침입니다. 그러나, 이러한 antifungal 감도 테스트 너무 제한적 그리고 받지 않습니다 고려 대사에서 변화에 종에 걸쳐 그들은 단지 몇 가지 선택 에이전트에 대 한 설립 했다. 예를 들어 그들은 할 고려 하지 계정 비 발효 효 모에의 대사 요구.
이 프로토콜 잠재 항진균 성 화합물의 활동의 평가 허용 하 고 항진균 펩 티 드에 대 한 검색에 대 한 여기에 구현 됩니다. 그것은 국물 microdilution 새로운 화합물8,9의 심사를 최적화 하는 수정 CLSI M27-A3 지침에서 시험 기반으로 합니다. 이러한 변경 내용은 컨트롤로 참조 antifungals 사용 하 여 결과 표준화 하는 동안 최적의 사전 테스트 성장 위한 소량의 화합물, 온도 또는 초기 inoculum와 다른 미디어를 사용 하 여 허용 합니다. 다 잘 배양 배지를 사용 하 여이 방법을 신속 하 고 안정적으로 화면 화합물의 많은 수를 가능 하 게.
그것의 고유의 유연성으로 인해이 프로토콜 및 몇 가지 각 색으로 다른 미생물에 대 한 화합물의 다른 화학 클래스와 함께 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Media and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) 프로판 설폰산 (MOPS) (o que a gente usa tem um s&oacute; DIO, Completa o Nome Dele Please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2X RPMI 중간</td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Din&acirc를 버퍼링하는 데 사용; 운모</td><td>1528-1</td><td>인산염 완충 식염수(PBS)용 137mM,</td></tr> <tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>인산염 완충 식염수(PBS)용 2.7mM,</td></tr> <tr><td>인산나트륨 이염기성(Na2HPO4),</td> <td>인</td><td></td><td>산염 완충 식염수(PBS)V000129 10mM, 인산</td></tr>이<tr><td>수소 인산칼륨(KH2PO4),</td> 인산염 완충 식염수(PBS)용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2mM</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud 포도당 육수</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud 포도당 한천</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>V000123</td><td>35% for (solu&ccedil; &물결표; o de estoque? 크리오프레세르바&ccedil; &물결표; o?)</td></tr><tr><td>메마른 물</td><td></td><td></td><td>Para dilui&ccedil; &물결표; o das drogas na dilui&ccedil; &물결표; o seriada</td></tr><tr><td>항진균제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>접시 페트리</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>멸균 용액 저장소</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td> 다중 채널 피펫장비 및 기타 재료<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Nikon을 사용하여 용액을 파이펫하는 데 사용</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>원심</td>분리기 <td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>는 37°C로 설정합니다. C</td></tr><tr><td>셰이커</td><td>뉴브런즈윅 사이언티픽</td><td>엑셀라 E25</td><td>37°C로 설정; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>셀 계수 챔버, Neubauer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

심사에 생체 외에서 국물 microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

곰 팡이 감염 마지막 십 년간에 중요 한 의료 상태 되 있지만 사용 가능한 항진균 약물의 수는 제한. 이 시나리오에서는 새로운 항진균 약물에 대 한 검색이 필요 합니다. 여기 보고 프로토콜 화면 펩 티 드 그들의 항진균 속성에 대 한 방법을 자세히 설명 합니다. 그것은 잠재적인 새로운 antifungals로 항균 성 펩 티 드의 연구에 맞게 수정 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침에서 국물 microdilution 자화 율 시험을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 항진균 성 화합물의 활동을 평가 하는 기능 분석 결과 설명 하 고 조사 분자의 특정 클래스에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 분석 실험 96 잘 접시 작은 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다, 이후 대규모 심사 자동화 환경에서 실시 하는 경우에 특히 시간, 짧은 시간에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 표준화 되 고 조정 가능한 임상 프로토콜 곰 팡이 질병의 치료를 개선 하기 위해 새로운 분자의 벤치 작업 추구를 도울 수 있는 방법를 보여 줍니다.

마이크는 완전히 잠복기의 끝에 보이는 곰 팡이 성장을 억제 하는 최저 항균 화합물 농도로 정의 됩니다. 반면 탁도 부정/성장 제어 웰 스에 유사한 어떤 잘 분명 미디어 빈 우물에 유사한 어떤 잘 긍정적인 결과 여겨진다이 프로토콜의 목적은 화면 잠재적인 antifungals 빠른 방법 이므로, 부정적인 것으로 간주. 그러나, 주어진된 앰프 fungistatic 또는 살 진 균 인지 알고에 관심이 있는 경우에, 긍정적인 우물에서 미디어 또한 수 Sabouraud 포도 당 한 천에 도금 하거나 또 다른 생존 능력 테스트로 확인.
주어진 소설 화합물의 행동의 메커니즘은 알려진, 그것 따라서 필수적입니다 경우 참조 항진균 이루어졌고 예상된 범위는 곰 팡이 분리 (확인 공식 지침, 테이블, 또는 문학에서 데이터)을 검사 하기 전에 대 한 확인 하는 (이 경우, 앰프;에 화합...

항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

이 방법의 전반적인 목표는 임상 실험실에서 사용되는 국물 미세 희석 감수성 테스트의 변형을 사용하여 잠재적인 항진균 화합물의 활성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 천연 또는 합성 화합물의 곰팡이 활성을 평가하는 데 사용되며, 이는 항진균 요법 개발의 첫 번째 테스트 중 하나입니다. 우리는 특히 실험이 자동화로 수행되는 경우 짧은 시간에 소량을 사용하여 새로운 항진균제에 대한 초기 스크리닝에 대한 지침을 제공합니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 후 연구원인 Daniel Zamith-Miranda입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 분석을 위한 곰팡이 균주를 성장시켜 이 절차를 시작합니다. 다음 날에는 실온에서 5분 동안 1200G에서 원추형 튜브를 원심분리하여 세포를 수집합니다.상등액을 버리고 각 튜브에 10ml의 PBS를 첨가한 다음 세포를 재현탁합니다. 실온에서 1200G에서 5분 동안 다시 원심분리기를 합니다. PBS 세척과 원심분리를 두 번 더 반복합니다.세 번째 세척 후, 5ml의 이중 강도 RPMI 1640 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액의 탁도에 따라 마이크로 원심분리기 튜브에 각 균주의 1-100 또는 1-1000 희석액을 1ml씩 준비합니다. 이 희석액을 10마이크로리터로 추출하여 혈구계 챔버에 넣고 현미경으로 4개의 모서리 사분면에 있는 총 세포 수를 계산합니다.각 세포 현탁액의 밀도를 계산한 후 이중 강도 RPMI 1640 배지에서 스톡 세포 현탁액을 준비합니다. C.albicans 긴장을 위한 밀리리터 당 4, 000의 세포, 및 20, C.neoformans 긴장을 위한 밀리리터 당 000의 세포를 준비하십시오. 리폴화된 펩타이드는 영하 20도에서 한 번 사용하기 위해 aliquats에 보관되며 각 실험 전에 탈이온수에만 용해됩니다.펩타이드 농도는 분석에서 테스트된 가장 높은 최종 농도의 2배여야 합니다. 참고 항진균제도 준비하고 있습니다. 항진균 분석은 3중 및 96웰 폴리스티렌 마이크로플레이트에서 수행됩니다.각 펩티드의 2배 연속 희석을 사용하고 항진균제를 제어하고 웰당 50마이크로리터의 최종 부피를 조절합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 연속 희석이므로 전체 분석을 손상시킬 수 있는 오류를 방지하기 위해 다음 몇 단계 동안 매우 주의하십시오. 피펫을 사용하여 1열에서 3열까지 A.의 열 1에서 3까지 원하는 가장 높은 최종 농도의 이중 강도 농도로 항진균 펩타이드 100마이크로리터를 추가합니다.다채널 피펫을 사용하여 B열의 다른 웰에 50마이크로리터의 멸균수를 추가하여 H.농도가 가장 높은 웰 50마이크로리터를 제거합니다.다음 농도의 해당 웰로 옮기고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 균질화합니다. 농도가 가장 낮은 웰에 도달할 때까지 연속 희석을 반복하고 이 웰에서 50마이크로리터를 버립니다. 행 A, B 및 C의 열 11과 12는 빈 컨트롤 또는 음의 성장 컨트롤을 위해 물만 남겨 둡니다.RPMI 1640 배지의 이중 강도 조정 접종물 50마이크로리터를 1-3열의 각 웰과 11열에 추가합니다. C.albicans를 위한 마지막 농도는 2, 밀리리터 당 000의 세포일 것이다. C.neoformans를 위한 마지막 농도는 10, 밀리리터 당 000의 세포일 것이다.항진균제 없이 50마이크로리터의 물과 50마이크로리터의 조정된 접종물을 혼합하여 음의 성장 억제를 준비합니다. 50마이크로리터의 물과 50마이크로리터의 배지(셀 없음)를 결합하여 블랭크 대조군을 준비합니다. 컨트롤을 적절한 웰에 로드합니다.도립 광학 현미경을 사용하여 모든 웰을 관찰한 다음 200rpm으로 흔들면서 37도에서 플레이트를 배양합니다. 잠복기가 끝나면 모든 웰을 다시 관찰하여 형태의 변화를 확인하고 오염 징후를 확인합니다. 디지털 카메라를 사용하여 각 플레이트의 이미지를 획득합니다.이 대표적인 분석법에서는 100마이크로몰에서 7점 8마이크로몰 범위의 농도를 가진 3개의 항균 펩타이드(AMP)를 C.neoformans에 대한 항진균 활성에 대해 평가했습니다. 성장 대조군과 블랭크가 포함되었습니다. 블랭크 웰과 유사한 투명한 매체가 있는 모든 웰은 긍정적인 결과로 간주되는 반면, 음의 성장 제어 웰과 유사한 탁도를 가진 모든 웰은 부정적인 결과로 간주됩니다.최소 억제 농도(MIC)는 배양 기간이 끝날 때 눈에 보이는 곰팡이 성장을 완전히 억제하는 가장 낮은 항균 화합물 농도로 정의되기 때문에 25마이크로몰은 AMP1의 MIC로 간주됩니다. 그리고 12 포인트 5 마이크로 몰, AMP2 용 마이크. AMP3는 테스트된 모든 농도에서 곰팡이가 성장했기 때문에 재평가해야 합니다.같은 방식으로, C.albicans에 대해 테스트된 3개의 별개의 펩타이드, 기소된 50마이크로몰은 AMP1에 대한 MIC입니다. 6마이크로몰은 AMP2의 MIC이고 25마이크로몰은 AMP3의 MIC입니다. 희석 단계 중 부적절한 피펫팅으로 인한 불량 결과의 예는 이 플레이트의 C행 5-7열에서 볼 수 있으며, 여기서 C.neoformans 성장의 차이는 반복 간에 존재합니다.일단 숙달되면 이 기술은 약 2시간 안에 완료할 수 있으며, 제대로 수행되면 곰팡이 성장 시간을 더할 수 있습니다. 이러한 테스트된 분자의 물리적 화학적 특징을 알고 있어야 합니다. 그런 다음 필요한 경우 적절한 용매를 대조군으로 사용하고 항상 동일한 성장 단계에서 세포를 사용합니다.이 절차에 따라 시간 사멸 분석, 생존력 염료 사용 및 ST60 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 화합물에 살균 또는 살균 효과가 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 의료 미생물학 분야의 연구자들이 항진균 화합물을 찾기 위해 천연 또는 합성 화합물의 여러 공급원을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 곰팡이 배양을 시작하고, 분석을 위해 세포를 준비하고, 연속 희석을 수행하고, 테스트된 화합물로 곰팡이 균주를 배양한 후 결과를 읽는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.곰팡이 병원체와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비 착용, 생물학적 안전 후드 내부 작업, 적절한 안전 관행 사용과 같은 준비를 해야 합니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

우리는 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한 방법을...

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을...

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

출처: Koeth, LM, et. al., 호기성 성장 박테리아의 달바반신 체외 감수성 테스트에 대한 참조 국물 미세 희석 방법. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 그람 양성균에 대한 리포글리코펩타이드 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위한 국물 미세 희석 방법을 보여줍니다. 박테리아 콜로니 분리, 희석, 다양한 항생제 농도의 마이크로플레이트 웰 접종, 배양 순도 및 세포 수 검증을 다룹니다. 이 비디오는 또한 항생제 결합이 세포벽 합성을 방해하여 용해를 유발하는 방법과 눈에 보이는 성장 억제를 기반으로 MIC를 식별하는 방법을 설명합니다.

그람 양성균의 항생제 감수성 시험을 위한 국물 미세 희석 방법

이 비디오는 국물 미량 희석 분석을 사용하여 항진균 화합물을 스크리닝하는 체외 분석을 보여줍니다. 테스트 화합물은 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 희석되고 진균 접종물로 배양됩니다. 배양 후, 테스트 화합물의 항진균 가능성과 최소 억제 농도(MIC)를 평가하기 위해 플레이트에 눈에 띄는 곰팡이 성장이 없는 웰이 있는지 검사합니다.

항진균 화합물 스크리닝을 위한 In vitro Broth Microdilution Assay

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

여기에서는 국물 미량 희석 참조 방법론을 사용하여 임상적으로 관련된 그람 양성 박테리아의 dalbavancin 감수성을 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Dalbavancin에 대한 참조 국물 Microdilution 방법<em&gt; 체외</em호기성 박테리아의 성장&gt; 감수성 테스트

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

식물 유래 제품의 항진균 효과를 정량화하도록 설계된 수정된 한천 기반 방법을 설명합니다. 항진균 활성에 대한 휘발성 및 비휘발성 기여는 모두 이 프로토콜을 통해 평가될 수 있다. 또한, 곰팡이에 대한 효능은 단일 실험 설정에서 주요 발달 단계에서 측정될 수 있다.

바이오 제어 제품의 휘발성 및 비휘발성 항진균 활성 측정

C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하기 위해 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 환원 분석을 사용하는 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 프로토콜이 본원에 설명되어 있습니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석

배우세요 국물 미세희석법을 이용한 항진균 화합물 선별 방법을 통해 새로운 항진균제의 활성을 평가하는 기술을 익히세요. 이 방법은 소량의 시약과 자동화를 통해 신속하고 효율적인 선별이 가능합니다.

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

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