심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

이 방법의 전반적인 목표는 임상 실험실에서 사용되는 국물 미세 희석 감수성 테스트의 변형을 사용하여 잠재적인 항진균 화합물의 활성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 천연 또는 합성 화합물의 곰팡이 활성을 평가하는 데 사용되며, 이는 항진균 요법 개발의 첫 번째 테스트 중 하나입니다. 우리는 특히 실험이 자동화로 수행되는 경우 짧은 시간에 소량을 사용하여 새로운 항진균제에 대한 초기 스크리닝에 대한 지침을 제공합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 후 연구원인 Daniel Zamith-Miranda입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 분석을 위한 곰팡이 균주를 성장시켜 이 절차를 시작합니다. 다음 날에는 실온에서 5분 동안 1200G에서 원추형 튜브를 원심분리하여 세포를 수집합니다.

상등액을 버리고 각 튜브에 10ml의 PBS를 첨가한 다음 세포를 재현탁합니다. 실온에서 1200G에서 5분 동안 다시 원심분리기를 합니다. PBS 세척과 원심분리를 두 번 더 반복합니다.

세 번째 세척 후, 5ml의 이중 강도 RPMI 1640 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액의 탁도에 따라 마이크로 원심분리기 튜브에 각 균주의 1-100 또는 1-1000 희석액을 1ml씩 준비합니다. 이 희석액을 10마이크로리터로 추출하여 혈구계 챔버에 넣고 현미경으로 4개의 모서리 사분면에 있는 총 세포 수를 계산합니다.

각 세포 현탁액의 밀도를 계산한 후 이중 강도 RPMI 1640 배지에서 스톡 세포 현탁액을 준비합니다. C.albicans 긴장을 위한 밀리리터 당 4, 000의 세포, 및 20, C.neoformans 긴장을 위한 밀리리터 당 000의 세포를 준비하십시오. 리폴화된 펩타이드는 영하 20도에서 한 번 사용하기 위해 aliquats에 보관되며 각 실험 전에 탈이온수에만 용해됩니다.

펩타이드 농도는 분석에서 테스트된 가장 높은 최종 농도의 2배여야 합니다. 참고 항진균제도 준비하고 있습니다. 항진균 분석은 3중 및 96웰 폴리스티렌 마이크로플레이트에서 수행됩니다.

각 펩티드의 2배 연속 희석을 사용하고 항진균제를 제어하고 웰당 50마이크로리터의 최종 부피를 조절합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 연속 희석이므로 전체 분석을 손상시킬 수 있는 오류를 방지하기 위해 다음 몇 단계 동안 매우 주의하십시오. 피펫을 사용하여 1열에서 3열까지 A.의 열 1에서 3까지 원하는 가장 높은 최종 농도의 이중 강도 농도로 항진균 펩타이드 100마이크로리터를 추가합니다.다채널 피펫을 사용하여 B열의 다른 웰에 50마이크로리터의 멸균수를 추가하여 H.농도가 가장 높은 웰 50마이크로리터를 제거합니다.

다음 농도의 해당 웰로 옮기고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 균질화합니다. 농도가 가장 낮은 웰에 도달할 때까지 연속 희석을 반복하고 이 웰에서 50마이크로리터를 버립니다. 행 A, B 및 C의 열 11과 12는 빈 컨트롤 또는 음의 성장 컨트롤을 위해 물만 남겨 둡니다.

RPMI 1640 배지의 이중 강도 조정 접종물 50마이크로리터를 1-3열의 각 웰과 11열에 추가합니다. C.albicans를 위한 마지막 농도는 2, 밀리리터 당 000의 세포일 것이다. C.neoformans를 위한 마지막 농도는 10, 밀리리터 당 000의 세포일 것이다.

항진균제 없이 50마이크로리터의 물과 50마이크로리터의 조정된 접종물을 혼합하여 음의 성장 억제를 준비합니다. 50마이크로리터의 물과 50마이크로리터의 배지(셀 없음)를 결합하여 블랭크 대조군을 준비합니다. 컨트롤을 적절한 웰에 로드합니다.

도립 광학 현미경을 사용하여 모든 웰을 관찰한 다음 200rpm으로 흔들면서 37도에서 플레이트를 배양합니다. 잠복기가 끝나면 모든 웰을 다시 관찰하여 형태의 변화를 확인하고 오염 징후를 확인합니다. 디지털 카메라를 사용하여 각 플레이트의 이미지를 획득합니다.

이 대표적인 분석법에서는 100마이크로몰에서 7점 8마이크로몰 범위의 농도를 가진 3개의 항균 펩타이드(AMP)를 C.neoformans에 대한 항진균 활성에 대해 평가했습니다. 성장 대조군과 블랭크가 포함되었습니다. 블랭크 웰과 유사한 투명한 매체가 있는 모든 웰은 긍정적인 결과로 간주되는 반면, 음의 성장 제어 웰과 유사한 탁도를 가진 모든 웰은 부정적인 결과로 간주됩니다.

최소 억제 농도(MIC)는 배양 기간이 끝날 때 눈에 보이는 곰팡이 성장을 완전히 억제하는 가장 낮은 항균 화합물 농도로 정의되기 때문에 25마이크로몰은 AMP1의 MIC로 간주됩니다. 그리고 12 포인트 5 마이크로 몰, AMP2 용 마이크. AMP3는 테스트된 모든 농도에서 곰팡이가 성장했기 때문에 재평가해야 합니다.

같은 방식으로, C.albicans에 대해 테스트된 3개의 별개의 펩타이드, 기소된 50마이크로몰은 AMP1에 대한 MIC입니다. 6마이크로몰은 AMP2의 MIC이고 25마이크로몰은 AMP3의 MIC입니다. 희석 단계 중 부적절한 피펫팅으로 인한 불량 결과의 예는 이 플레이트의 C행 5-7열에서 볼 수 있으며, 여기서 C.neoformans 성장의 차이는 반복 간에 존재합니다.

일단 숙달되면 이 기술은 약 2시간 안에 완료할 수 있으며, 제대로 수행되면 곰팡이 성장 시간을 더할 수 있습니다. 이러한 테스트된 분자의 물리적 화학적 특징을 알고 있어야 합니다. 그런 다음 필요한 경우 적절한 용매를 대조군으로 사용하고 항상 동일한 성장 단계에서 세포를 사용합니다.

이 절차에 따라 시간 사멸 분석, 생존력 염료 사용 및 ST60 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 화합물에 살균 또는 살균 효과가 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 의료 미생물학 분야의 연구자들이 항진균 화합물을 찾기 위해 천연 또는 합성 화합물의 여러 공급원을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 곰팡이 배양을 시작하고, 분석을 위해 세포를 준비하고, 연속 희석을 수행하고, 테스트된 화합물로 곰팡이 균주를 배양한 후 결과를 읽는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

곰팡이 병원체와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비 착용, 생물학적 안전 후드 내부 작업, 적절한 안전 관행 사용과 같은 준비를 해야 합니다.