격리 된 괴 경 Protoplasts의 Cytometry에 의해 측정 Endoreduplication

이 실험의 전반적인 목표는 감자 괴경 내의 내중복 수준을 평가하는 것입니다. 이 방법은 괴경 조직이 내복제를 겪는 발달 단계와 같은 감자 괴경 형태학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 유세포 분석 제제에 비해 훨씬 더 명확한 결과를 제공한다는 것입니다.

절차를 시연하는 사람은 Parker Laimbeer입니다. 제 연구실의 대학원생입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용액과 완충액을 준비한 후 감자 괴경을 71% 에탄올에 최소 5분 동안 담가 표면 살균합니다.

에탄올에서 식물 재료를 제거하고 자연 건조시킵니다. 각 샘플에 대해 50ml 원뿔형 튜브를 준비하고 라벨을 부착하고 각 샘플에 15ml의 필터 멸균 플라스몰분해 배양 용액(PIS)을 분취합니다. 멸균된 메스 또는 코르크 보어 샘플을 사용하여 조직을 멸균하려는 욕구의 약 1입방센티미터를 사용합니다.

살균 메스를 사용하여 조직을 약 3입방밀리미터 조각으로 거칠게 자릅니다. 그리고 조직을 PIS가 들어있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 조직을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

감자 원형질체를 생성하려면 먼저 0.71몰 만니톨, 3밀리몰 염화칼슘, 1밀리몰 인산나트륨으로 적절한 양의 효소 용액 또는 ES를 준비하고 여과합니다. 염화 마그네슘 1 개, 4 % Onozuka R-10 셀룰라아제, 0.8 % Macerozyme R-10, 1 % 헤미 셀룰라아제 및 10 밀리 몰 MES 완충액, pH 5.8. 혈청학적 피펫을 사용하여 튜브의 샘플에서 PIS를 흡인합니다.

각 샘플에 10ml의 ES를 추가하고 튜브를 2-3회 뒤집습니다. 그런 다음 밤새 섭씨 29% 및 180RPM에서 샘플을 배양합니다. 3일째에 원형질체를 채취하여 세척하려면 셰이커에서 샘플을 제거하고 약 10분 동안 가라앉힙니다.

혈청학적 피펫을 사용하여 소화된 조직을 피하도록 주의하면서 가능한 한 많은 ES 용액을 흡인합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 튜브를 비스듬히 잡고 분해된 조직을 피해 남아 있는 ES 용액을 다시 제거합니다. 핵의 손상을 방지하기 위해 원형아체 세척 용액을 가능한 한 많이 제거하는 것이 중요합니다.

튜브를 비스듬히 잡으면 원형질체를 유지하면서 용액을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 각 샘플에 15ml의 PWS를 추가합니다. 그리고 튜브를 두세 번 부드럽게 뒤집습니다.

원형질체가 10분 동안 가라앉을 때까지 기다립니다. 그런 다음 혈청학 피펫을 사용하여 PWS를 제거합니다. 그리고 남아있는 액체를 제거하기 위한 마이크로 피펫.

샘플을 얼음 위에 보관하면서 각 튜브에 1.5ml의 얼음처럼 차가운 FCB를 추가합니다. 각 샘플을 짧게 흔들거나 와류로 만들어 응집된 조직을 분해합니다. FCB가 세포에 완전히 침투하여 핵을 방출할 수 있도록 괴경 조직의 덩어리를 분해하는 것이 중요합니다.

이 단계부터 컨트롤을 추가하려면 면도날을 사용하여 1.5ml의 얼음처럼 차가운 FCB에서 작은 잎을 잘게 자릅니다. 대조군 샘플은 실험 샘플과 동일한 plloity여야 하며, 가급적이면 동일한 유전자형이어야 합니다. 팁이 잘리고 106마이크로미터 금속 메쉬가 바닥까지 녹은 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 2ml 마이크로 원심분리기 튜브에 삽입합니다.

그런 다음 FCB 조직 현탁액 1ml를 필터에 통과시킵니다. 각 샘플에 250마이크로리터의 RNA 용액을 추가합니다. 그런 다음 튜브를 뒤집어 실온에서 30분 동안 배양합니다.

이전에 준비된 프로피듐 요오드화물 또는 PI 용액 125마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다. 튜브를 뒤집어 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 가능한 한 빨리 샘플을 사용하고 2시간 이내에 분해를 피하십시오.

전방 산점도 대 측면 산점도 및 PI 대 측면 산점도의 로그 척도를 사용하여 두 개의 점도를 만듭니다. 또한 x축에 PI가 있는 히스토그램을 만듭니다. 로그 스케일은 핵이 형광에서 크게 다를 수 있으므로 모든 이벤트가 스케일 내에 있는지 확인하는 데 필요합니다.

샘플 유전자형에서 in vitro 잎 조직과 같은 알려진 대조군 샘플의 튜브를 로드합니다. 그리고 모든 이벤트가 대규모로 진행되도록 전압을 조정합니다. 대조군 샘플에서 2C 피크의 채널을 기록해 둡니다.

실험 샘플의 2C 피크는 동일한 위치에 있어야 합니다. 실험용 괴경 샘플을 로드하고 모든 이벤트가 규모에 맞는지 다시 확인합니다. 조정이 필요한 경우 제어 샘플의 전압 조정을 반복하여 2C 피크의 채널을 식별합니다.

side scatter versus PI plot을 사용하여 protoplast nuclei를 수동으로 게이트합니다. 그런 다음 게이트된 원형아체 핵 영역만 표시하도록 PI 히스토그램을 설정합니다. 각 샘플에서 원하는 수의 이벤트를 수집합니다.

연구자들은 종종 유세포 분석을 위해 10, 000개의 게이트 이벤트를 사용합니다. 그러나 더 많은 샘플과 낮은 농도의 샘플을 수용하기 위해 괴경 원형질체 샘플에 대해 2000개의 이벤트가 사용됩니다. 프로토플라스트의 생성은 감자 괴경에서 반복 가능한 유세포 분석 결과를 얻는 데 필요합니다.

일반적인 형태가 여기에 표시됩니다. 속과 골수 주위 실질 사이의 분리는 검은 선으로 표시됩니다. 실질(parenchyma)과 피질(cortex)을 분리하는 혈관 고리(vascular ring)는 검은색 화살표로 표시됩니다.

고립된 원형질체(protoplasts)는 원형질세포(plasma membrane)가 손상되지 않은 상태에서 구형이고 대칭이어야 합니다. 잎과 괴경 원형질체의 크기 차이뿐만 아니라 조직 내 크기의 차이에 유의하십시오. 이는 서로 다른 수준의 내복제(endoreduplication)를 나타낼 수 있습니다. 이 그림은 유세포 분석, 산점도, 산점도 및 히스토그램 모두에서 발생할 수 있는 결과의 변동을 표시합니다.

온전한 핵은 세포의 상대적 풍부도를 정량화하기 위해 피크 사이의 깨끗한 분리를 보여주는 반면, 피크 통합 샘플은 이동된 넓고 중첩된 염기를 보여줍니다. 해당 산점도에서 검은색 상자는 히스토그램에 대한 핵 이벤트 게이팅을 나타내며 이벤트의 클러스터링은 히스토그램 피크의 너비에 반영됩니다. Endoreduplication 수준 또는 EI를 분석한 이 실험은 속이 피질 조직보다 더 높은 EI를 나타낸다는 이전 결과를 확인했습니다.

놀랍게도, 실질 조직의 프로필은 피질과 유사했으며 또한 구강 조직과도 유의하게 달랐습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 처음 두 번의 배양 동안 샘플 무균 상태를 유지하고 원형질체가 용해된 후 가능한 한 많은 샘플을 얼음 위에 보관해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 어떤 유전자가 괴경 내중복 수준에 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 유전자 조작과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 감자 괴경에서 프로토플라스트를 추출하고 유세포 분석을 위해 준비하여 내복제 수준을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 요오드화프로피듐으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 PPE와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.