Name: 교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 배우세요 HyCCAPP 방법으로 포유류 세포에서 특정 유전자좌의 DNA 결합 단백질을 식별하는 기술입니다. 유전자 조작이나 항체 없이도 단백질-DNA 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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이 작품 NIH 교부 금 P50HG004952와 모에 R01GM109099에 의해 지원 되었다

1. 캡처 Oligonucleotide 디자인
<ol><li>
대상 지역/s의 하이브리드 캡처 동안 사용할 oligonucleotides의 패널 디자인.
	<ol>
<li>4-8 oligonucleotides 대상 지역, 그러나 최소한 디자인, 하나 이상의 oligonucleotide 대상 영역의 각 끝을 대상으로 디자인을 목표로 합니다.</li>
		<li>대상 시퀀스는 긴 경우 (> 500의 기본적인 쌍), 전체 대상 지역 chromatin의 효과적인 농축을 최대한 밖으로 보기로 oligonucleotides 디자인. 참고: 우리는 4-8 oligonucleotides와 최적의 캡처 관찰. 이 프로세스는 더 많은 oligonucleotides 잘 사용할 수 있습니다, 하지만 너무 많은 oligonucleotides 사용 하는 경우 농축 수율의 감소를 관찰 하는 것은 드물지 않다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유사한 녹는 온도, oligonucleotides 디자인 하 고는 그들이 하지 강한 헤어핀을 형성 않으며 강한 상호 작용 (고려 내 42 ᵒC에서 실시 될 것입니다)를가지고 있는지 확인 하십시오. 참고: 발 차입 (4.12.3)을 선택 하는 경우는 추가적인 외부 8 기준 시퀀스는 oligonucleotide에 추가 되어야 합니다 그리고 필요 합니다 보완 '릴리스' oligonucleotides 차입17시. 선택 하 고 분석 하는 oligonucleotides 여러 상용 소프트웨어 도구를 사용할 수 있습니다. 25 메 좋은 결과 보이고 있다 그러나 게놈 크기 순서에 따라, 캡처 oligonucleotides 포함 될 수 있습니다 어딘가에 사이 20-80 기지. 일반적으로, 캡처 oligonucleotides 62 ᵒC, 가까운 녹는 온도 하지만 그는 그들의 길이 따라 변경할 수 있습니다. 일관 된 용융 온도 및/또는 캡처 믹스 전체 oligonucleotide 길이 농축에 원치 않는 편견을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>캡처 oligonucleotides는 biotin moiety (선호 캡처 시퀀스에서 공백 구분 함) 3' 끝에와 함께 디자인.</li>
</ol>2. 세포 배양
<ol><li>
37 ᵒC와 5% CO2에 인간 lymphoblastoid 셀 (예: GM12878 여기에 표시) 또는 다른 셀 라인 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스, 2 mM L-글루타민 보충 RPMI 1640 미디어에서를 성장 한다.
	<ol>
<li>시드 초기 RPMI 1640 미디어 2.1에서 준비의 6 mL와 T-25 플라스 크에서 aliquots (2-5 105 셀 x) 냉동입니다.</li>
		<li>셀 밀도 생존을 모니터링 합니다.<ol>
<li>대표 셀의 aliquot 고 블루 trypan 같은 적절 한 염료와 얼룩.</li>
			<li>hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 측정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>셀에 1 x 106 셀/mL의 조밀도 도달 하면, 전에 5 분 x 100g에 셀 아래로 회전 하 고 2.1에서 준비 RPMI 1640 미디어의 25 mL와 T-75 플라스 크에 세포를 전송. 셀 밀도 접근 1 x 106 셀/mL까지 세포 성장.</li>
		<li>RPMI 1640 미디어 (2.1)의 38 ml T-150 플라스 크에 세포를 전송 추가 2 일에 대 한 셀을 성장 하 고. 참고: Lymphoblastoid 세포 현 탁 액에서 성장. 성장 하는 lymphoblastoid 세포에 대 한 일반 지침 셀 밀도를 0.2-1 x 106 셀/mL 사이 보관 될 것이 좋습니다. 이 기술에 필요한 자료의 큰 양 때문에 현재 프로토콜 고의로 넘어 무엇 일반적으로 사용 되는 셀 밀도 세포 성장에 기록 됩니다. 세포 성장 프로토콜 개정 하 고 적응 사용할 수 세포 유형에 따라 독자 수 있습니다.</li>
		<li>5 분 x 100g에 셀 아래로 회전 RPMI 1640 미디어 (2.1) 10 mL에 셀 resuspend 하 고, 미디어의 500 mL를 포함 하는 850 cm2 롤러 병에 현 탁 액을 부 어. 앞으로 동일한 조건 하에서 세포를 품 어 하지만 시점에서 지속적인 회전 (~0.5 rpm)를 사용 하 여 시작 합니다.</li>
		<li>세포 성장 모니터링 하 고 미디어 (일반적으로 매 3-4 일) 필요할 때 변경. 2 x 106 셀/mL (총에서 1 x 109 셀)에 최대한 가까이 밀도 성장 세포를 하자.</li>
		<li>원하는 셀 수에 도달 하면 5 분 동안 100 x g에 아래로 셀을 회전 시켜 세포를 수확 하 고 RPMI 1640 미디어 (2.1)의 36 ml 셀 resuspend. 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 셀 계산 및 DNA 추출을 위한 작은 aliquots를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1%의 최종 농도 도달 Crosslink 37% 포름알데히드의 1 mL을 추가 하 여. 주의: 포름알데히드는 발암 물질 이며, 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.<ol>
<li>회전 셀을 품 어 (~ 30-60 rpm) 실 온 (RT)에서 10 분.</li>
		<li>125 mM의 최종 농도 대 한 2.5 M 글리신 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 crosslink 반응을 끄다.</li>
		<li>회전 셀을 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에서 5 분 5 분 동안 100 x g에서 centrifuging 여 셀을 펠 렛 및 얼음 감기 1 x PBS로 두 번 셀을 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>계속 해 서 다음 단계 또는 세포 세포의 용 해 버퍼 (5 mM Hepes, 85 m m KCl, 0.5 %Igepal, protease 억제제 (PI)) 5 mL에 펠 릿을 resuspend 스냅-동결 정지 액체 질소에 의해 드롭. -80 ᵒC에서 샘플을 저장 합니다. 참고: 준비 > 25 mL Igepal 및 PI 없이 세포 세포의 용 해 버퍼의 그 시 약 신선한 때 사용할 준비가 추가. Igepal 및 PI 추가 되었습니다 일단 세포 세포의 용 해 버퍼의 장기 저장을 하지 마십시오. 최대 3 개월까지 4 ᵒC에서 세포 세포의 용 해 버퍼를 저장 합니다. Igepal 비, 비 변성 시키기 세제입니다. NP-40 Igepal 안으로 잠재적으로 사용 될 수 있지만 우리가 그것을 사용 하지이 샘플은 결국 DNA 의무적인 단백질을 특성화 하는 질량 분석에 의해 분석 하면 NP-40은 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>3. 세포 및 전단
<ol><li>준비 > 핵 세포의 용 해 버퍼 (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.0, 1 %SDS, PI)의 15 mL. 참고: 추가 PI 사용 될 금액을 신선한. PI를 추가 핵 세포의 용 해 버퍼의 장기 저장을 하지 마십시오. 핵 세포의 용 해 버퍼 최대 1 개월 RT에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>세포 세포의 용 해 버퍼 (Igepal, PI 포함) 20 mL에 펠 릿을 resuspend. 잘 한 번 해 동 얼음에 녹여와 섞어 알 약에 하자. 샘플 얼음에 추가 10 분 동안 앉아 보자. 4 ᵒC 5 분 동안에 400 x g에서 셀 원심</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 PI와 핵 세포의 용 해 버퍼의 6 mL에 셀 resuspend (볼륨 증가 될 수 있다 경우에 세포는 현 탁 액을 형성 하지 않는다).</li>
	<li>
쥡니다 위한 준비, 분할 ~ 6-8에 균등 하 게 샘플 microfuge 관 (각 관에 대 한 1000 600 µ L).
	<ol>
<li>얼음 이나 차가운 랙에 샘플을 놓고는 sonicator는 microtip을 사용 하 여 샘플을 sonicate. 5 x 20 s 일정 한 필요, 적어도 40에 대 한 진정 서 스 펜 션 수 65% 진폭을 사용 하 여 펄스 사이 s. 참고: 볼륨이 증가 하는 경우 > 샘플, 세포를 냉각 하는 유리 당 10 mL 대신 사용할 수 있습니다. 점점 더 이상 파열을 해야 할 것 이다 다음. Sonicators는 크게 다릅니다. 조건은 독자에 의해 최적화 할 수 있습니다. 다른 쥡니다 대안 뿐만 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>12000 x g 4 ᵒC에서 10 분 동안에 세포를 원심, 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 알 약을 삭제.</li>
	<li>Fluorometric 메서드를 사용 하 여 전체 복구를 예상 하고있다.</li>
	<li>계속 해 서 다음 단계 또는 스냅-동결-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.</li>
	<li>선택 사항: 0.3 M NaCl에 67 ᵒC에서 하룻밤 배양 하 여 aliquot, crosslinks을 가져가 라. DNA를 깨끗 하 고 조각 길이 결정 하는 Bioanalyzer에 그것을 실행. 파편의 대부분은 500 그리고 1000 bp 사이 이어야 한다. 참고: 그것은 시점에서 중지 하 고-80 ᵒC에서 샘플을 저장 하려면 확인입니다.</li>
</ol>4. 교 잡 캡처
<ol><li>교 잡 (Hyb) 버퍼 x 2의 500 mL를 준비 (200mm MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0.02% 트윈-20) 워시 버퍼 (200 m m NaCl, 0.2 %SDS, 50 mM Tris pH 8)의 500 ml. 저장 Hyb 및 워시 버퍼 4 ᵒC 및 실 온에서 각각 최대 3 개월까지 합니다. 교 잡 버퍼 x 1을 준비 하는 2 x Hyb 버퍼의 절반을 사용 합니다. 또한 최대 3 개월까지 4 ᵒC에 저장할. 참고: 교 잡 캡처의 전체 볼륨은 이전 단계에서 결과 샘플의 볼륨을 두 번 있을 것입니다 (지금까지 설명 된 대로 샘플 볼륨 약 6 mL 것과 따라서 총 교 잡 볼륨 12 mL 것).</li>
	<li>따로 설정 구슬 총 교 잡 캡처 볼륨 (이 경우 600 µ L)의 5%. 적절 하 고 적합 한 자석 구슬 다음 단계에 함께 작동 하도록 필요 합니다.</li>
	<li>워시 세 번 Hyb 버퍼 두 번 구슬 볼륨 (1200 µ L)를 사용 하 여 x 1와 구슬. 2x Hyb 버퍼의 1200 µ L에 구슬 resuspend. 해결 될 때까지 자석에 튜브를 배치 하 고 버퍼를 제거.</li>
	<li>1.5 mL 튜브 당 샘플의 700 µ L의 최대 microfuge 관 전 개간 반응을 수행 합니다. 충분 한 구슬 (5%)와 2 배 희석 (10 튜브 샘플의 600 µ L, 씻어 구슬 Hyb 버퍼, x 2에 resuspended의 120 µ L와 Hyb 버퍼 x 2의 480 µ L) x 1 Hyb 버퍼 Hyb 버퍼 추가 합니다. 최종 회전 이상 끝 31 ᵒC에서 10 분 동안 그들을 품 어 (~ 30-60 rpm).</li>
	<li>구슬 움직일 수는 새로운 관에 샘플을 전송 때까지 자석에 튜브를 놓습니다. 비즈를 삭제 합니다. 참고:이 시점에서 앞으로, 낮은 바인딩 튜브는 권장 됩니다.</li>
	<li>10 pmol / µ L의 작업 솔루션을 캡처 oligonucleotides resuspend 고 각 관에이 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 참고: 다른 지역, 서로 대 한 제어 역할을 할 수 있지만 진정한 부정적인 제어 역할을 발진의 시퀀스 캡처 oligonucleotide를 포함 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>마지막 회전에 엔드와 42 ᵒC에서 40 분 동안 튜브를 품 어 (~ 30-60 rpm).</li>
	<li>부 화, 동안 필요한 구슬 (0.3 µ L/캡처 oligonucleotide의 pmol) 제쳐 설정 합니다. 4.3, 단계에서 설명한 대로 구슬 세 번 씻어 하지만 Hyb 버퍼 x 1에 있는 셀을 resuspend.</li>
	<li>씻어 구슬 샘플을 추가 하 고 최종 회전 이상의 끝에서 RT 30 분 샘플을 품 어 (~ 30-60 rpm). 자석에 튜브를 놓고 일단 구슬이 움직일 수 있는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>
구슬 세척
	<ol>
<li>워시 버퍼의 1.2 mL을 추가 하 고 최종 회전 동안 끝 5 분에 대 한 샘플을 품 어 (~ 30-60 rpm) 자석 및 대기에 실시간 장소 튜브에서 솔루션까지 최소 몇 지웁니다. 버퍼를 제거 하 고이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>워시 버퍼의 1.2 mL을 추가 하 고 최종 회전 이상 끝 1 h 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에 튜브 자석에 놓고 솔루션 지웁니다 때까지 몇 분을 기다립니다. 버퍼를 제거 하 고 2 시간 30 분에 부 화 시간을 단축 하는이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>워시 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 최종 회전 이상 끝 15 분 동안 품 어 (~ 30-60 rpm) 31 ᵒC에서. 자석에 튜브를 놓고 솔루션 클리어까지 몇 분 기다려야 합니다. 버퍼를 분리 합니다.</li>
		<li>PBS의 200 µ L을 추가 하 고 최종 회전 동안 끝 5 분 동안 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에 튜브 자석에 놓고 솔루션 지웁니다 때까지 몇 분을 기다립니다. 버퍼를 제거 하 고이 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
간단한 차입
	<ol>
<li>구슬에 분자 학년 물 40 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 94 ᵒC에서 품 어.</li>
		<li>자석에 튜브를 놓고 몇 분 해결 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>새로운 관으로는 상쾌한을 전송 합니다. 비즈를 삭제 합니다.</li>
		<li>Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할. 참고:이 유형의 차입 작품 나중 정량 분석 및 일부 단백질 측정을 위해 잘 하지만 다른 경우에 항복 "청소기" 있다 아래에 설명 된 두 가지 대체 방법을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNase 차입입니다.
	<ol>
<li>각 튜브를 DNase 버퍼 x 1과 DNase의 U 2의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ᵒC에 15 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>자석에 튜브를 놓고 해결 될 때까지 몇 분 기다려야 합니다.</li>
		<li>구슬에서 eluted 샘플을 제거 하 고 새로운 낮은 바인딩 튜브에서 샘플을 배치.</li>
		<li>효소를 비활성화 및 proteomic 분석 진행 7 분 94 ᵒC에서 튜브를 품 어. 참고: 낮은 DNase 농도 간섭 proteomic 분석 관찰 되는 경우 사용할 수 있습니다. 그것은이 차입 메서드 DNase 치료 샘플에서 DNA 자료를 완전히 파괴 이후 사용 하는 경우 캡처 풍부 정량 계산 가능한 되지 않습니다.</li>
		<li>Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
발 차입17. 참고:이 메서드는 권장 되지 않습니다 오래 oligonucleotides (> 40 기지). 이 방법은 게놈 시퀀스와 오버랩 되지 않는 한 추가 8 기지를 포함 하는 캡처 oligonucleotides 및 보완 자료 oligonucleotides 캡처 oligonucleotides에서 대상을 제거 하려면 필요 합니다.<ol>
<li>SSC 버퍼의 40 µ L에서 릴리스 oligonucleotides의 2 nanomoles 희석.</li>
		<li>실시간에서 20 분 동안 품 어</li>
		<li>자석에 튜브를 놓고 몇 분 해결 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>구슬에서 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 평가 대상 캡처 영역의 관심에 대 한 뇌관으로 정량 하 여 항복 캡처
<ol><li>적절 한 소프트웨어 또는 온라인 도구를 사용 하 여 뇌관 및 대상 지역에 대 한 프로브 디자인. 참고:이 실험에서 DUSP3 및 DUSP5 의 발기인 지역 대상으로 했다. 뇌관 및 프로브 사용 되는 다음입니다. DUSP3: 뇌관 1-GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, 뇌관 2-CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM 표시 된 프로브-TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: 뇌관 1-TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, 뇌관 2-GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM 표시 된 프로브 TGC ATT 태그 AGC AGC CAG ATG AGG TT.</li>
	<li>Eluate (10 개 이상 µ L)의 약 수를가지고 고 희석 1:10 분자 학년 H2o.</li>
	<li>2.1.7 단계에서 aliquots의 한의 DNA를 추출 하 고 그 DNA 샘플 5 직렬 1:10 희석 분자에 H2o. 학년을 수행 하 여 표준 곡선을 사용 하 여</li>
	<li>정량 마스터 믹스 (다양 한 상업 대안) 준비, 뇌관 및 프로브를 추가 하 고 적절 한 금액 (15 µ L 20 µ L 반응을 실행 하는 경우)에 각 잘 분배.</li>
	<li>추가 5 µ L의: a) 희석 샘플, b)는 표준 곡선 또는 c) 분자 급료 H2O (템플릿 제어 역할)을 각 잘 하.</li>
	<li>접시를 밀봉 하 고 1 분 동안 100 x g에서 원심.</li>
	<li>다음 매개 변수는 정량 시스템에서 실행: 95 ᵒC에서 5 분 뒤에 20 95 ᵒC의 40 주기 s, 20 59 ᵒC s 및 25 72 ᵒC s.</li>
	<li>엉덩이 수율과 뒤섞여 캡처를 표준 곡선을 사용 하 여 캡처 특이성 평가.</li>
</ol>

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공개 관심의 없습니다 충돌을 확인 하 고 있습니다.

여기서 설명 하는 HyCCAPP 메서드는 그것에 게 밝히기 애매 남아 것 이다 DNA 상호 작용 하는 강력한 접근 방식을 많은 독특한 기능이 있습니다. 과정의 성격 HyCCAPP 다른 유기 체와 게놈의 지역에서 작동 하도록 유연성을 제공 합니다. 그러나 그것은 방법,, 그는 몇 가지 제한이 간주.
HyCCAPP 일차 전지, 세포 배양 시스템, 또는 심지어 조직 샘플에서 잠재적으로 적용할 수 있도록 셀 수정 방지 하는 방법입니다. 그러나 그 때문에,, 그것은 요구 한다 가교 화, proteomic 분석에서 감도 감소 하 고 따라서 입력된 대용량을 필요로 하는 샘플을. CRISPR 및 주변 가교 반응12,13,,1418없이 작동할 수 있는 단백질의 biot...

지난 10 년 동안 많은 수의 샘플, 그리고 놀라운 해상도 다양 한 게놈의 연구를 수 있도록 시퀀싱 기술에 극적인 개선을 보았다. 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 컨소시엄, 국가 인간 게놈 연구소는 건강의 국가 학회의 주도로 대규모 다 기관 노력 개별 녹음 방송 요인에 대 한 통찰력을 제공 하고있다 그리고 다른 규제 단백질 바인딩할 게놈 상호 작용. 초기 노력 Chromatin immunoprecipitation (칩)에 의해 100 개 이상의 알려진된 DNA 묶는 단백질1에 대 한 평가 특정 DNA 단백질 상호 작용, 특징. 등 DNase 프린팅2 포름알데히드 규제 요소 (시 키)3 의 보조 절연 단백질, 하지만 분명 한 제한으로 작용 하는 게놈의 특정 영역을 찾을 사용 되었습니다 또한 다른 방법에 실험 방법 팬 들은 상호 작용 단백질의 정보를 식별 하지 않습니다. 지난 년 동안 광범위 한 노력에도 불구 하 고 아무 기술 염색 질, 그리고 식별에 단백질 DNA 상호 작용의 포괄적인 특성화 및 정량화 chromatin 관련 단백질의 효율적으로 있도록 떠오르고 있다.
이 필요를 해결 하기 위해 우리는 우리가 Hybridization Capture of Chromatin-Associated 단백질으로 단백질 (HyCCAPP)에 대 한 불리는 새로운 접근 방식을 개발. 처음 개발 된 효 모4,5,6, 접근 가교 된 chromatin 관심 영역 (바인딩된 단백질)와 시퀀스 관련 교 잡 캡처를 사용 하 여 격리 합니다. 단백질-DNA 복합물의 고립, 후 질량 분석 등 접근 관심사의 순서에 바인딩된 단백질의 세트의 특성을 사용할 수 있습니다. 따라서, HyCCAPP 소설 DNA 단백질 상호 작용의 항 체 그리고 그것에 의존 하지 않습니다 의미를 밝히기 위해 바이어스 비 접근은 완전히 찾을 수 있는 단백질에 대 한 불가 지론으로 간주 될 수 있습니다. 다른 방법을 밝히기 소설 DNA 상호 작용 단백질7, 하지만 대부분 칩 같은 방법8,,910, 플라스 미드 삽입11,12,에 의존 하는 능력 13,14또는 높은 복사 번호15지역. 반면, HyCCAPP는 다중 및 단일 복사 영역에 적용할 수 있는 그리고 지역에서 단백질에 대 한 사전 정보는 필요 하지 않습니다. 또한, 일부 방법 중 위는 중요 한 기능, 특히 DNA-단백질 가교 반응, HyCCAPP의 독특한 특징은에 단일 복사 영역에 적용할 수 있습니다 필요를 피하고 수정 되지 않은 셀, 언급 하 고 없이 상 상속 의무적인 단백질, 또는 사용할 수 있는 항 체에 대 한 사전 지식.
이 시점에서, HyCCAPP 효 모4,,56, 다양 한 게놈 지역 분석에 주로 적용 되 고 최근 알파 위성 DNA 반복 영역에에서 단백질 DNA 상호 작용을 분석 하는 데 사용 했다 인간 게놈16. 우리의 지속적인 작업의 일환으로, 우리 처음 효 모 chromatin 인간 세포의 분석에 적용 되 고 현재 여기 단일 복사 대상의 선택적 캡처 수 있도록 수정 된 프로토콜에 대 한 개발 교 잡 캡처 접근을 적응 시켰다 우리의 초기 연구에서 효 모와 유사한 효율성으로 인간 게놈에 있는 영역입니다. 이 새로운 최적화 된 프로토콜 적응 및 질량 분석 또는 다른 분석 접근을 사용 하 여 인간 게놈 전체 DNA 단백질 상호 작용을 심문 기술의 활용 수 있습니다.
그것은 HyCCAPP 메서드를 사용 하면 특정 대상 지역 분석을 위한 게놈 넓은 분석에 적합 하지 않습니다 강조 하는 것이 중요. 기술 영역 상호 작용 단백질에 대 한 부족 한 정보는 거래 할 때 또는 특정 게놈 소재 시에 상호 작용 단백질의 더 포괄적인 심층 분석을 원할 때 특히 유용 하다. HyCCAPP은 DNA 묶는 단백질을 폭로 하지만 정확 하 게 genomic DNA에 특정 단백질 바인딩 사이트 특성을 하지 의미입니다. 현재 구현, 방법론 DNA 바인딩 시퀀스 또는 개별 단백질에 대 한 주제에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 따라서, 그것은 멋지게 시 키, 같은 기존 기술을 보완 하 고 게놈 지역에 소설 묶는 단백질의 id는 초기 시 키 분석으로 식별 하는 것을 허용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PrimerQuest 도구</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td>분석 캡처 올리고뉴클레오티드</td></tr><tr><td>PairFold</td><td>UBC</td><td></td><td>분석 상호 작용</td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Countess 자동 세포 카운터</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>850 cm2 롤러 병&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>680058</td><td></td></tr><tr><td>롤러 시스템</td><td>Wheaton</td><td>22-288-525</td><td></td></tr><tr><td>37 % 포름알데히드&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이게팔 CA-630</td><td>시그마-알드리치</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>써모 피셔</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>브랜슨 디지털 초음파 SFX 150</td><td>에머슨</td><td></td><td></td></tr><tr><td>큐빗 3.0 형광측정기</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 분석 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>MES sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr>, <tr><td>DynaMag-15 자석</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>12301D</td><td></td></tr>, <tr><td>Dynabeads M-280 atreptavidin</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>60210</td><td></td></tr>, <tr><td>저결합 튜브</td>, <td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>SciGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜브 쉐이커 및 로테이터</td><td>Thermo Fisher</td><td>415110Q</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>SSC 버퍼 20&times; 농축</td>액 <td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr></tbody></table>

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 chromatin 관련 단백질의 캡처

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

단백질 (HyCCAPP) 기술에 대 한 단백질 chromatin 관련의 교 잡 캡처 효 모에 소설 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 처음 개발 되었다. 분석을 대상 지역에 바인딩된 가능성이 단백질에 대 한 사전 지식 없이도 관심의 대상 영역을 수 있습니다. 이론에서 그러면 관심, 어떤 게놈 영역을 분석 하는 데 사용할 HyCCAPP 그리고 다른 세포 시스템에서 작동 하도록 충분 한 유연성을 제공 합니다. 이 방법은 알려진된 전사 인자, Chromatin Immunoprecipitation (칩) 및 칩 같은 방법에 대 한 더 적합 한 작업의 바인딩 사이트를 공부 하는 것은 아닙니다. HyCCAPP의 힘은 제한 된 DNA 영역을 탐구 하는 능력 또는 그것에 바인딩 단백질에 대 한 지식에 있다. 그것은 편견 (칩 같은 방법에 존재 하는) 단백질 기반 chromatin 농축 항 체를 사용 하 여 도입을 방지 하는 편리한 방법을 수 있습니다. 잠재적으로, HyCCAPP를 진정으로 새로운 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 강력한 도구를 수 있습니다. 날짜 하려면, 기술은 주로 적용 된 효 모 세포 또는 포유류 세포에서 높은 복사 반복 시퀀스. 우리가 구상 하는 강력한 도구가 되었다, HyCCAPP 접근 포유류 세포에서 단일 복사 loci를 효율적으로 캡처를 최적화 해야 합니다. 여기, 선물이 우리의 적응 초기 효 HyCCAPP 프로토콜 인간의 세포 라인을 캡처하고 표시 단일 복사 chromatin 지역이 수정 프로토콜 효율적으로 격리 될 수 있습니다.

때문에 성공 하려면 HyCCAPP chromatin의 대용량 입력된에 대 한 필요성, 세포 confluency의 상대적으로 높은 수준에 성장 된다. Trypan 세포 사망률은 보통 확인 하는 데 사용은 블루 얼룩 (&lt; 10%). 단일 복사본 실험, chromatin 콘텐츠 교 잡 캡처 해야 femtomolar 범위에서 이전에 보통 시작 물자로 적어도 109 셀을 필요 합니다. 전체 규모 실험, 이전에 더 작은 일괄 처리 캡처 oligonucleotide 성능을 테스트 하는 것이 좋습니다. 교 잡 캡처 oligonucleotides의 적정을 사용 하 여 그림 1에 표시 됩니다. 캡처 oligonucleotides의 수는 총 농도 일정 하 게 유지 하는 동안에 점차적으로 증가 했다. 이 실험은 명확 하 게 세 가지 주요 측면을 보여준다. 첫째, 그것은 얼마나 많은 oligonucleotides 최...

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

이 방법은 비암호화 영역의 질병 관련 염기서열 변이가 단백질 결합을 변경하여 유전자 발현 및 조절에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 게놈 조절을 이해하는 데 있어 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 이러한 단백질을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포나 조직의 유전자 조작이나 항체가 필요하지 않으며 해당 자리에서 DNA와 상호 작용할 수 있는 DNA 결합 단백질에 대한 사전 지식이 필요하지 않다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Danu Perumalla입니다.텍스트 프로토콜에 따라 올리고뉴클레오티드를 설계한 후, 6ml의 RPMI 1640 배지와 1%Pen Strep, 2mil 이상의 L-글루타민 및 5%FBS가 보충된 T25 플라스크에 2-5배 10의 5번째 림프모세포 또는 기타 세포주를 플레이트로 만듭니다. 섭씨 37도에서 세포를 배양하고 이산화탄소를 5%로 배양합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다.세포가 1 곱하기 10에서 밀리리터당 6 세포에 도달하기 전에 5분 동안 100배 G로 스핀다운한 다음 이 비디오의 앞부분에서 준비한 25ml의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 T75 플라스크로 옮깁니다. 밀리리터 당 6개의 세포에 1 곱하기 10의 세포 조밀도가 도달할 때까지 세포를 성장시키고, 그 후에 동일한 매체의 38 밀리리터에 있는 T150 플라스크에 세포를 옮기고, 추가 2 일 동안 그(것)들을 성장시킵니다. 다음으로, 5분 동안 100배 G로 세포를 스핀다운하고 10ml의 RPMI 1640 배지에 재현탁합니다.그런 다음 500밀리리터의 배지가 들어 있는 1850제곱센티미터 롤러 병에 현탁액을 붓고 일정한 회전을 제외하고 이전과 동일한 조건에서 세포를 배양합니다. 원하는 세포 수에 도달하면 100배 G에서 5분 동안 배양액을 스핀다운하고 36ml의 RPMI 1640 배지에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 계수 및 DNA 추출을 위해 작은 부분 표본을 제거합니다.세포를 교차 결합시키기 위하여는, 37%포름알데히드의 1 밀리리터를 1%의 최종 농도를 도달하기 위하여 추가하십시오그런 다음 10 분 동안 실내 온도에 있는 10에서 30 분당 회전수로 세포를 배양하십시오. 2.5 몰 글리신 용액 2 밀리리터를 첨가하여 최종 농도 125 밀리몰을 만들어 가교 반응을 담금질합니다. 그런 다음 5분 동안 회전하면서 세포를 배양합니다.원심분리로 세포를 펠릿화한 후 얼음처럼 차가운 1X PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 세포의 용해 및 sheering을 계속하거나 5ml의 세포 용해 완충액에 펠릿을 재현탁하고 액체 질소에서 현탁액을 한 방울씩 스냅 동결합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.용해 및 sheering을 수행하려면 펠릿을 20ml의 세포 용해 완충액에 재현탁합니다. 세포를 400배 G, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 단백질분해효소 억제제로 6ml의 핵 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다.초음파 처리를 준비하기 위해 샘플을 6-8개의 Microfuge 튜브로 고르게 나눕니다. 샘플을 얼음이나 차가운 선반에 놓고 마이크로 팁이 있는 초음파 발생기를 사용하여 20초 동안 5번의 일정한 버스트로 65% 진폭으로 초음파 처리하여 펄스 사이에 최소 40초 동안 서스펜션을 냉각시킵니다. 12, 000 시간 G 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에 세포를 원심 분리하고, 그 후에 새로운 관으로 상등액을 옮기고, 펠릿을 버리십시오.형광측정법을 사용하여 총 회수율을 추정한 후 샘플을 스냅 동결합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 혼성화 및 세척 완충액을 준비한 후 1, 200 마이크로 리터의 1X 혼성화 완충액을 사용하여 600 마이크로 리터의 비드를 3 번 세척합니다. 그런 다음 1, 200 마이크로 리터의 2X 혼성화 버퍼를 사용하여 비드를 재현탁시킵니다.1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 600 마이크로리터의 샘플, 120 마이크로리터의 2X 혼성화 완충액에 현탁된 세척된 비드, 480 마이크로리터의 2X 혼성화 완충액을 추가합니다. 튜브를 섭씨 31도, 30-60rpm에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 비드가 고정될 때까지 튜브를 자석에 놓고 비드를 버리기 전에 샘플을 새 튜브로 옮깁니다.포획 올리고뉴클레오티드를 마이크로리터당 10피코몰의 작업 용액에 재현탁시키고 이 용액을 각 튜브에 4마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 42도에서 30-60RPM으로 40분 동안 튜브를 배양합니다. 배양 중에는 필요한 비드를 따로 보관하고 이전과 같이 비드를 세 번 세척하되 이번에는 1X 혼성화 완충액을 사용하여 다시 현탁시킵니다.세척된 비드를 튜브에 넣고 샘플을 실온에서 30-60RPM으로 30분 동안 배양합니다. 튜브를 자석에 놓고 비드가 고정되면 상층액을 제거합니다. 비드를 세척한 후 40마이크로리터의 분자 등급 물을 첨가하여 샘플을 용리시키고 튜브를 섭씨 94도에서 5분 동안 배양합니다.튜브를 자석에 놓고 용액이 제거될 때까지 몇 분 동안 기다린 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 비드를 버립니다. 시료를 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 텍스트 프로토콜에 따라 단백질체학 분석을 진행합니다. 포획 수율을 평가하려면 분자 등급의 물을 사용하여 용리액의 부분 표본을 1에서 10까지 희석합니다.동영상의 앞부분에서 채취한 부분 표본에서 DNA를 추출한 후 DNA 샘플과 분자 등급의 물을 사용하여 5개의 연속 1-10회 희석으로 표준 곡선을 준비합니다. 프라이머와 프로브를 첨가하여 qPCR 마스터 믹스를 준비하고 반응의 각 웰에 적절한 양을 분주합니다. 각 웰에 5마이크로리터의 희석된 샘플, 표준 곡선 또는 분자 등급 물을 추가하여 템플릿 제어 없이 사용합니다.접시를 밀봉하고 1분 동안 100회 G로 돌립니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 있는 매개변수를 사용하여 qPCR 시스템에서 샘플을 실행합니다. 마지막으로, 표준 곡선을 사용하여 수율을 평가하고 스크램블 포획을 사용하여 포획 특이성을 평가합니다.여기에 표시된 것은 올리고뉴클레오티드의 적정을 사용한 혼성화 캡처입니다. 올리고뉴클레오티드의 수는 점진적으로 증가하며 총 농도는 일정하게 유지됩니다. 이 실험은 최적의 혼성화 효율에 도달하기 위해 얼마나 많은 다른 올리고뉴클레오티드가 필요한지 결정하는 데 도움이 됩니다.또한 특정 올리고뉴클레오티드 세트 간의 명백한 해로운 혼성화 상호 작용과 특이성이 좋지 않은 올리고가 있는지 여부를 밝혀 높은 백그라운드를 초래합니다. 교차 결합 염색질에 있는 단편의 상당 부분은 혼성화 캡처에 적합하지 않습니다. 혼성화 캡처가 성공적으로 실행되면 다른 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 동일한 염색질 물질에 대한 후속 포획 실험에서 새로운 염색질을 사용할 때와 유사한 수율을 얻을 수 있습니다.그러나 첫 번째 실험에서 원래 올리고와 남은 염색질을 사용한 두 번째 포획 실험에서는 첫 번째 실험에서 대부분의 혼성화 수정 가능한 물질이 포획된 경우 수율이 약 90% 감소합니다. 이 그림은 서로 다른 염색체 표적 영역의 혼성화 캡처를 보여주며, 각 영역은 다른 영역에 대한 음성 대조군 역할을 합니다. 스크램블된 시퀀스는 진정한 음성 제어 역할도 합니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 원하는 영역이 혼성화 포획에 적합한지 확인하기 위해 먼저 포획 올리고뉴클레오티드를 테스트하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 염색질 면역침전법(chromatin immunoprecipitation)과 같은 다른 방법을 수행하여 확인된 DNA 상호 작용 단백질이 게놈의 다른 위치에 결합하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 국소 단백질 상호 작용의 새로운 식별을 목적으로 관심 게놈 영역을 풍부하게 하기 위해 HyCCAPP를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

adaptation-hybridization-capture-chromatin-associated-proteins-for

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

캡처 화합물 사진 crosslinking 및 정화하여 다음 기능을 가역 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 의한 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 trifunctional 작은 분자 수 있습니다. 여기있는 캡처 컴파 운드를...

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

질량 분광법의 발전은 조직의 호스트에 단백질 표현 및 수정의 높은 처리량 분석을 허용하고 있습니다. subcellular 분류 및 질병 모델, 분광 및 생물 정보학은 생물 시스템에 새로운 속성을 표시 할 수 있습니다 양적 질량과 결합. 여기에 설명 된 방법은 심장 질환의 설정에 염색질 - 관련 단백질을 분석하고 다른 사람에게 쉽게 적용 할 수...

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

여기서는 동위원소 2-플렉스 표지 전략과 ArgC 소화를 사용하여 단일 세포 히스톤 번역 후 변형 후 분석을 자동화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 단일 세포 해상도에서 염색질 이질성과 후생유전학적 반응을 정량적이고 재현 가능하며 고민도로 프로파일링할 수 있게 합니다.

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

배우세요 HyCCAPP 방법으로 포유류 세포에서 특정 유전자좌의 DNA 결합 단백질을 식별하는 기술입니다. 유전자 조작이나 항체 없이도 단백질-DNA 상호작용을 연구할 수 있습니다.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

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