교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

이 방법은 비암호화 영역의 질병 관련 염기서열 변이가 단백질 결합을 변경하여 유전자 발현 및 조절에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 게놈 조절을 이해하는 데 있어 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 이러한 단백질을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포나 조직의 유전자 조작이나 항체가 필요하지 않으며 해당 자리에서 DNA와 상호 작용할 수 있는 DNA 결합 단백질에 대한 사전 지식이 필요하지 않다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Danu Perumalla입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 올리고뉴클레오티드를 설계한 후, 6ml의 RPMI 1640 배지와 1%Pen Strep, 2mil 이상의 L-글루타민 및 5%FBS가 보충된 T25 플라스크에 2-5배 10의 5번째 림프모세포 또는 기타 세포주를 플레이트로 만듭니다. 섭씨 37도에서 세포를 배양하고 이산화탄소를 5%로 배양합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다.

세포가 1 곱하기 10에서 밀리리터당 6 세포에 도달하기 전에 5분 동안 100배 G로 스핀다운한 다음 이 비디오의 앞부분에서 준비한 25ml의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 T75 플라스크로 옮깁니다. 밀리리터 당 6개의 세포에 1 곱하기 10의 세포 조밀도가 도달할 때까지 세포를 성장시키고, 그 후에 동일한 매체의 38 밀리리터에 있는 T150 플라스크에 세포를 옮기고, 추가 2 일 동안 그(것)들을 성장시킵니다. 다음으로, 5분 동안 100배 G로 세포를 스핀다운하고 10ml의 RPMI 1640 배지에 재현탁합니다.

그런 다음 500밀리리터의 배지가 들어 있는 1850제곱센티미터 롤러 병에 현탁액을 붓고 일정한 회전을 제외하고 이전과 동일한 조건에서 세포를 배양합니다. 원하는 세포 수에 도달하면 100배 G에서 5분 동안 배양액을 스핀다운하고 36ml의 RPMI 1640 배지에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 계수 및 DNA 추출을 위해 작은 부분 표본을 제거합니다.

세포를 교차 결합시키기 위하여는, 37%포름알데히드의 1 밀리리터를 1%의 최종 농도를 도달하기 위하여 추가하십시오그런 다음 10 분 동안 실내 온도에 있는 10에서 30 분당 회전수로 세포를 배양하십시오. 2.5 몰 글리신 용액 2 밀리리터를 첨가하여 최종 농도 125 밀리몰을 만들어 가교 반응을 담금질합니다. 그런 다음 5분 동안 회전하면서 세포를 배양합니다.

원심분리로 세포를 펠릿화한 후 얼음처럼 차가운 1X PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 세포의 용해 및 sheering을 계속하거나 5ml의 세포 용해 완충액에 펠릿을 재현탁하고 액체 질소에서 현탁액을 한 방울씩 스냅 동결합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

용해 및 sheering을 수행하려면 펠릿을 20ml의 세포 용해 완충액에 재현탁합니다. 세포를 400배 G, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 단백질분해효소 억제제로 6ml의 핵 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다.

초음파 처리를 준비하기 위해 샘플을 6-8개의 Microfuge 튜브로 고르게 나눕니다. 샘플을 얼음이나 차가운 선반에 놓고 마이크로 팁이 있는 초음파 발생기를 사용하여 20초 동안 5번의 일정한 버스트로 65% 진폭으로 초음파 처리하여 펄스 사이에 최소 40초 동안 서스펜션을 냉각시킵니다. 12, 000 시간 G 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에 세포를 원심 분리하고, 그 후에 새로운 관으로 상등액을 옮기고, 펠릿을 버리십시오.

형광측정법을 사용하여 총 회수율을 추정한 후 샘플을 스냅 동결합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 혼성화 및 세척 완충액을 준비한 후 1, 200 마이크로 리터의 1X 혼성화 완충액을 사용하여 600 마이크로 리터의 비드를 3 번 세척합니다. 그런 다음 1, 200 마이크로 리터의 2X 혼성화 버퍼를 사용하여 비드를 재현탁시킵니다.

1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 600 마이크로리터의 샘플, 120 마이크로리터의 2X 혼성화 완충액에 현탁된 세척된 비드, 480 마이크로리터의 2X 혼성화 완충액을 추가합니다. 튜브를 섭씨 31도, 30-60rpm에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 비드가 고정될 때까지 튜브를 자석에 놓고 비드를 버리기 전에 샘플을 새 튜브로 옮깁니다.

포획 올리고뉴클레오티드를 마이크로리터당 10피코몰의 작업 용액에 재현탁시키고 이 용액을 각 튜브에 4마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 42도에서 30-60RPM으로 40분 동안 튜브를 배양합니다. 배양 중에는 필요한 비드를 따로 보관하고 이전과 같이 비드를 세 번 세척하되 이번에는 1X 혼성화 완충액을 사용하여 다시 현탁시킵니다.

세척된 비드를 튜브에 넣고 샘플을 실온에서 30-60RPM으로 30분 동안 배양합니다. 튜브를 자석에 놓고 비드가 고정되면 상층액을 제거합니다. 비드를 세척한 후 40마이크로리터의 분자 등급 물을 첨가하여 샘플을 용리시키고 튜브를 섭씨 94도에서 5분 동안 배양합니다.

튜브를 자석에 놓고 용액이 제거될 때까지 몇 분 동안 기다린 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 비드를 버립니다. 시료를 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 텍스트 프로토콜에 따라 단백질체학 분석을 진행합니다. 포획 수율을 평가하려면 분자 등급의 물을 사용하여 용리액의 부분 표본을 1에서 10까지 희석합니다.

동영상의 앞부분에서 채취한 부분 표본에서 DNA를 추출한 후 DNA 샘플과 분자 등급의 물을 사용하여 5개의 연속 1-10회 희석으로 표준 곡선을 준비합니다. 프라이머와 프로브를 첨가하여 qPCR 마스터 믹스를 준비하고 반응의 각 웰에 적절한 양을 분주합니다. 각 웰에 5마이크로리터의 희석된 샘플, 표준 곡선 또는 분자 등급 물을 추가하여 템플릿 제어 없이 사용합니다.

접시를 밀봉하고 1분 동안 100회 G로 돌립니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 있는 매개변수를 사용하여 qPCR 시스템에서 샘플을 실행합니다. 마지막으로, 표준 곡선을 사용하여 수율을 평가하고 스크램블 포획을 사용하여 포획 특이성을 평가합니다.

여기에 표시된 것은 올리고뉴클레오티드의 적정을 사용한 혼성화 캡처입니다. 올리고뉴클레오티드의 수는 점진적으로 증가하며 총 농도는 일정하게 유지됩니다. 이 실험은 최적의 혼성화 효율에 도달하기 위해 얼마나 많은 다른 올리고뉴클레오티드가 필요한지 결정하는 데 도움이 됩니다.

또한 특정 올리고뉴클레오티드 세트 간의 명백한 해로운 혼성화 상호 작용과 특이성이 좋지 않은 올리고가 있는지 여부를 밝혀 높은 백그라운드를 초래합니다. 교차 결합 염색질에 있는 단편의 상당 부분은 혼성화 캡처에 적합하지 않습니다. 혼성화 캡처가 성공적으로 실행되면 다른 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 동일한 염색질 물질에 대한 후속 포획 실험에서 새로운 염색질을 사용할 때와 유사한 수율을 얻을 수 있습니다.

그러나 첫 번째 실험에서 원래 올리고와 남은 염색질을 사용한 두 번째 포획 실험에서는 첫 번째 실험에서 대부분의 혼성화 수정 가능한 물질이 포획된 경우 수율이 약 90% 감소합니다. 이 그림은 서로 다른 염색체 표적 영역의 혼성화 캡처를 보여주며, 각 영역은 다른 영역에 대한 음성 대조군 역할을 합니다. 스크램블된 시퀀스는 진정한 음성 제어 역할도 합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 원하는 영역이 혼성화 포획에 적합한지 확인하기 위해 먼저 포획 올리고뉴클레오티드를 테스트하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 염색질 면역침전법(chromatin immunoprecipitation)과 같은 다른 방법을 수행하여 확인된 DNA 상호 작용 단백질이 게놈의 다른 위치에 결합하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 국소 단백질 상호 작용의 새로운 식별을 목적으로 관심 게놈 영역을 풍부하게 하기 위해 HyCCAPP를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.