DNA는 Cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정

이 실험의 전반적인 목표는 메틸화 및 비메틸화 민감성 제한 효소로 형광 표지된 DNA 분자를 분해하고 실험의 분해 속도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 유전체학과 같은 화학 또는 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 장점은 과학자가 다른 실험이 완료된 후 DNA가 전체 길이인지 확인하기 위해 효소로 미리 염색된 DNA를 소화할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학부생인 Drew Thompson입니다. 0.7% 아가로스 젤을 만들려면 삼각 플라스크에 1.4g의 높은 겔화 온도 아가로스를 넣으십시오. 그런 다음 200ml의 1x TAE 버퍼를 추가하고 플라스크 위에 거꾸로 된 비커를 놓습니다.

플라스크 바닥에 거품이 형성되기 시작하고 상단으로 떠오를 때까지 열판에서 용액을 가열합니다. 핫플레이트에서 용액을 제거하고 맨손으로 플라스크를 만질 수 있을 때까지 식히십시오. 그런 다음 젤 빗을 사용하여 24.5cm x 21.8cm 젤 틀에 젤을 붓고 우물을 만듭니다.

피펫 팁을 사용하여 빗 근처 또는 젤 표면의 거품을 터뜨리고 젤이 최소 15분 동안 응고되도록 합니다. 6가지 농도의 염료로 람다 DNA를 염색하려면 먼저 1x TE를 사용하여 람다 DNA 마이크로리터당 100나노그램 300마이크로리터를 준비합니다. 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오.

제한 분해물에서 예상되는 각 밴드에 대해 다음 염료 농도 각각에 대한 샘플을 준비하는 동안 75-100 나노그램의 메틸화되지 않은 람다 DNA를 염색합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 제한 효소가 염색된 DNA를 소화할 수 있는지 확인하기 위해 제한 효소 20 단위, 절단 효율이 가장 높은 적절한 완충액 3 마이크로리터, 증류된 오토클레이브 및 여과수를 추가하여 30 마이크로 리터 반응을 일으킵니다.

반응을 최적의 효소 활성으로 수조에 넣고 2-4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 0.5 몰 EDTA pH 8.0의 2 마이크로 리터를 추가하여 반응을 중지하십시오. 미리 준비된 겔 몰드에서 측면을 제거하고 겔을 겔 전기영동 상자에 넣습니다.

2.5리터의 1x TAE 버퍼를 상자에 붓습니다. 그런 다음 웰에 접근할 수 있도록 젤에서 젤 빗을 조심스럽게 제거합니다. 제한 효소 반응을 플라스틱 필름에 피펫팅하고 각 반응 용액에 대해 5-6 마이크로 리터의 DNA 용액 당 1 마이크로 리터의 6x 로딩 염료를 추가합니다.

그런 다음 반응을 우물에 피펫으로 넣습니다. 1마이크로리터의 1킬로베이스 사다리, 9마이크로리터의 1x TE 및 2마이크로리터의 6x 로딩 염료를 혼합합니다. 그런 다음 다른 용액 옆에 있는 웰에 용액을 로드합니다.

젤 상자를 짙은 파란색 또는 검은색 종이나 천으로 덮은 다음 젤 상자를 전원 공급 장치에 연결합니다. 전원 공급 장치를 30볼트로 설정하고 밤새 실행하십시오. 겔이 작동하는 동안 조명을 꺼서 표지된 DNA의 광절단을 방지하십시오.

다음 날 아침, 트레이의 젤을 45마이크로리터의 브롬화 에티듐과 1리터의 1x TAE 완충액이 들어 있는 용기로 옮깁니다. 용기를 어두운 실온에 보관하거나 빛에 노출되지 않도록 호일로 덮으십시오. 젤을 실온에서 최소 45분 동안 그대로 두십시오.

겔을 이미지화하려면 400-500나노미터 사이의 최대 광 출력을 방출하는 청색광 투과광 장치 위에 젤을 놓습니다. 스테이션에 부착된 카메라로 사진을 촬영합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 실험의 소화 속도를 결정합니다.

효소 효율은 예상되는 띠의 총 수를 가시 띠의 수로 나누어 결정됩니다. 또한, 밴드의 대략적인 크기를 결정하기 위해서는 염색된 DNA와 비교하여 네이티브 DNA 분자가 예상되는 위치를 알기 위해 대조군이 필요합니다. 3차선과 4차선에 있는 띠의 이동성이 감소하여 띠가 우물에 더 가깝게 이동하게 되었습니다.

이 레인에서는 염료의 양이 이동성에 눈에 띄게 영향을 미치지 않으므로 밴드가 컨트롤과 일치합니다. 5번 및 6번 레인은 대조군보다 더 많은 띠를 보여주는데, 이는 부분적 소화를 나타내며, 이는 염료가 인식 부위의 분열에 영향을 미쳤음을 시사합니다. 이 실험에서는 모든 염료 농도에 대해 예상되는 모든 띠가 보이므로 주사위가 DNA의 소화를 방해하지 않았습니다.

YOYO-1 염료의 농도가 증가함에 따라 이동성이 어떻게 변화하는지 확인하기 위해 각 밴드 옆에 유색 별표를 삽입했습니다. 예를 들어, 3.5 킬로베이스 밴드는 각 YOYO-1 농도에서 그 옆에 빨간색 별표가 있습니다. 5번 레인과 6번 레인의 예기치 않은 밴드는 밴드 옆에 별표가 없습니다.

이 절차를 시도하는 동안 어두운 종이 조각으로 젤을 덮고 어두운 방에서 젤을 완전히 실행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 반응을 위해 어두운 튜브를 사용해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제한 효소로 형광으로 염색된 DNA 분자를 소화하고 반응의 소화 속도를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

브롬화 에티듐으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 절차를 수행하는 동안 장갑과 보안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 또한 트랜스일루미네이터를 사용할 때는 적절한 보안경을 착용하십시오.