Name: DNA는 Cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 학습하세요 형광 염색된 DNA를 메틸화 및 비메틸화 민감성 제한 효소로 소화하는 방법을. 이 실험은 DNA 무결성 평가와 게놈학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 연구소에 의해 투자에 대 한 일반 의료 과학 (NIGMS) (5605100122001), 국립 보건원 (NIH), 뿐만 아니라 키 니 (UNK) 여름 학생 연구 프로그램 (SSRP) 그리고 UNK 네브라스카 대학교의 구성 요소 학부 연구 친교 (URF)입니다.

1. 염료, 버퍼의 Agarose 젤 준비
<ol><li>
얼룩이 DNA 또는 스테인드 DNA의 소화에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>1 x 테 (Tris HCl 및 ethylenediaminetetraacetic 산; 준비 EDTA) 버퍼 10 mM Tris HCl과 1 mM EDTA 졸업된 실린더 또는 부피 측정 플라스 크를 사용 하 여. 실내 온도 (18-25 ° C)에 저장 합니다.</li>
		<li>각 염료의 aliquots 만들기: 토토-1, 요요-1, 포포-1, 보 보-1, 토토-3, 요요 3, 포포-3, 보 보-3 (표 1). 어두운 주황색으로 1mm 염료의 4 µ L 플라스틱 또는 블랙 1.5 mL 튜브 및 1 x 테의 36 µ L을 추가, 피 펫을 사용 하 여 혼합 이 집중은 100 µ M 염료 솔루션 (총 40 µ L)입니다. 각 염료에 대 한이 단계를 완료 합니다. 4 ° c.에 게 참고: photobleaching 또는 염료의 저하를 방지 하기 위해 빛을 염료를 노출 하지 마십시오.</li>
		<li>1 10 mM Tris, Bis, HCl, 프로 판, 10 m m MgCl2및 100 µ g/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 버퍼를 준비 합니다. 버퍼 2 50 mM NaCl를 사용 하 여 준비 10 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 100 µ g/mL BSA. 3 50 mM 칼륨 아세테이트, 트리 아세테이트 20 mM, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA를 사용 하 여 버퍼를 준비 합니다. 각 효소 기능을 이러한 특정 버퍼 중 하나 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
젤 전기 이동 법에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>확인 로드 x 6 블루, 0.25 %bromophenol 결합 하 여 염색 0.25% 자일 렌 cyanol, 15% Ficoll dH2오가 실내 온도에.</li>
		<li>0.7 %agarose 젤, 삼각 플라스 크에 높은 고 온도 (HGT) agarose의 0.07 g 밖으로 무게, 100 mL 1 x TAE 버퍼의 추가 플라스 크 위에 거꾸로 비 커를 배치.<ol>
<li>거품 형태로 플라스 크와 상단에 부동의 하단에 시작 될 때까지 핫 플레이트에 솔루션을 열.</li>
			<li>핫 플레이트에서 솔루션을 제거, 솔루션 쿨 플라스 크 맨 손으로 건드리지 수 수 웰 스를 만드는 젤 빗 24.5 c m x 21.8 c m 젤 형으로 젤을 부 어 때까지.</li>
			<li>피 펫 팁 터지는 여 빗 근처 또는 젤의 표면에 거품을 제거 하 고 적어도 15 분 동안 공고히 하 젤 허용. 이 젤 또는 오염의 건조를 방지 하기 위해 1 주에 대 한 플라스틱 랩에 싸서 냉장고 (4 ° C)에 저장할 수 있습니다. 젤을 실행 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 참조 리 외. 33 . 참고: 30 개별 웰 스와 젤 빗을 사용 합니다. 각 잘 2 m m의 깊이와 폭이 4.5 m m 이어야 한다. 우물의 높이 상자에 부 어 젤의 크기에 따라 달라 집니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>40 mM Tris HCl, 20 m m 초 산, 1 mM EDTA 사용 하 여 1 x TAE (트리 스-아세테이트-EDTA) 버퍼를 준비 합니다. 실내 온도 (18-25 ° C)에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 스테인드 DNA의 준비
<ol><li>
람다 DNA (300-800 ng) 염료의 다른 aliquots를 사용 하 여 얼룩. 각 염료 (표 1) 6 개의 다른 농도 제한 효소 당 48 반응의 총에 대 한 테스트를 할 것 이다. 다음 프로세스 1 반응 (그림 1)에 대 한 최대 집합을 설명합니다.
	<ol>
<li>1 x 테 100을 사용 하 여 람다 DNA를 희석 ng / µ L. 4 ° C에 저장 300 µ L의 총 볼륨으로 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>Unmethylated 람다 DNA 얼룩. 다이제스트에서 예상 각 밴드에 대 한 75-100 ng/밴드 예상. 1.9 µ M, 3.8 µ M, 19.4 µ M, 32.2 µ M, 48.3 µ M, 63.5 μ M의 농도 생산 하는 염료의 적절 한 금액을 추가 / 100 ng의 DNA.</li>
		<li>밤새 품 어 (15-18 시) 4 ° c.에</li>
		<li>한 반응 제어25으로 흠 없는 둡니다. 참고: unmethylated DNA를 사용 하 여 소화 반응에 대 한. 메 틸 화 과민 한 효소 수 없습니다 DNA에 갠 지역 고 불완전 한 소화의 모습을 줄 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 제한 효소 분석 실험의 준비
<ol><li>
다이제스트는 그 효소 prestained DNA (그림 1)을 소화 수 있습니다 경우 결정 하는 제한 효소로 DNA를 스테인드.
	<ol>
<li>다음 날, 제한 효소, 적절 한 버퍼 (표 2)의 3 µ L의 U 20을 추가 하 고 증류수, 압력가 마로 소독 하 고 필터링 된 30 µ L의 총. 각 효소 반응에 대 한 제조업체의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다 가장 높은 절단 효율성으로 버퍼를 선택 합니다.</li>
		<li>반응의 최적 효소 활동, 6 효소 Maschmann 외에 사용에 대 한 표 2에 나열 된 온도에서 물 욕조에 배치., 2-4 h (표 2)25.</li>
		<li>0.5 M EDTA pH 8.0의 2 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting Agarose 젤에서 DNA 스테인드
<ol><li>24.5 c m x 21.8 c m 젤 형 (1.2.2 단계)에서 면을 제거 하 고 젤 젤 전기 이동 법 상자에 놓습니다. 상자에 1 x TAE 버퍼의 2.5 L를 붓으십시오. 조심 스럽게 우물 액세스할 수33그래서, 젤에서 젤 빗을 제거.</li>
	<li>플라스틱 플라스틱 필름에 제한 효소 반응 하 고 염료를 로드 x 6 각 반응 결합. 각 반응 솔루션에 대 한 DNA 솔루션 (1x)의 5-6 µ L 당 염료 로드 x 6의 1 µ L를 추가 합니다. 다음 반응 플라스틱 (로드 염료 포함 된 < 18 µ L) 우물에.</li>
	<li>1 kb 사다리의 1 µ L, 1 x 테의 9 µ L 및 염료 로드 x 6의 2 µ L를 혼합. 다른 솔루션 측면 우물에 솔루션을 로드 합니다.</li>
	<li>어두운 청색 또는 검은색 종이 또는 직물 젤 상자를 커버. 전원 공급 장치, 30 V, 전원 공급 장치를 설정 하 고 그것을 밤새 껏 달린다 (15-20 h)에 젤 상자를 연결 합니다. 젤 레이블이 DNA의 photocleavage를 방지 하기 위해 실행 되는 동안 불을 끕니다.</li>
	<li>다음 날 아침에 전원 공급 장치 해제. 트레이 사용 하 여 밖으로 젤 하 고 45 µ L ethidium 평범한 사람 및 1 x TAE 버퍼의 1 L 용기에 그것을 전송. 빛에 노출 되지 않도록 호 일에 어둠 속에서 실내 온도 또는 표지에 컨테이너를 저장 합니다. 실내 온도에 적어도 45 분 동안 하자 젤 얼룩. 주의: 장갑 ethidium 평범한 사람을 사용 하 고 안전 안경을 착용. Ethidium 평범한 사람 해결책을 포함 하 고 젤을 버리고 컨테이너를 청소 때 참조 사용된 ethidium 평범한 사람; 처리 하는 방법을 결정 하는 상태 처리 지침 서 또한, 다른 얼룩 ethidium 평범한 사람 대신 이용 될 수 있습니다.</li>
</ol>5. 이미징 Agarose 젤
<ol><li>400-500 nm 사이 최대 광 출력을 방출 하는 블루 빛 transilluminator의 위에 젤을 놓습니다. 역에 연결 된 카메라와 함께 사진을 찍을. 주의:는 조명에 대 한 커버를 사용 하 여 광원을 켜기 전에 보호 안경에 넣어 있는지 확인 합니다. 참고:이 단계 수 있습니다 또한 완료 모든 UV 광원 또는 표준 젤 스캐너를 사용 하 여.</li>
	<li>ImageJ ImageJ 상태 표시줄에 파일을 드래그 하 여 그림 목록 그리고 이미지 팝업 됩니다.</li>
	<li>예상 에서 실리콘에서 젤 패턴에 젤에 밴드를 비교 하 여 실험에 대 한 소화 속도 결정 합니다. 소화 속도 결정 하기 위해 실험적인 밴드의 수 DNA 밴드24,25의 예상된 수로 나눕니다. 실험적인 소화 DNA 밴드 패턴 예상된 패턴을가지고, 소화 율은 1입니다. 패턴에 경우 예상 보다 더 많은 파편, 소화 속도가 1 보다 큰입니다. 패턴에 경우 예상 보다 적은 조각, 소화 속도가 1 미만입니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

붙일 레이블된 DNA (그림 1)을소화 하기 위해 일련의 단계를 제시해 주셔야 합니다. 첫째, DNA 하룻밤는 형광 색소로 얼룩진입니다. DNA 수 있습니다 알을 품 cyanine 이합체와 시간;의 짧은 기간에 대 한 그러나, Carlsson 외. 발견 DNA 이중 밴드 때문에 불완전 한 얼룩20각 DNA 크기에 대 한 만든. 이 문제를 해결 하려면 DNA 수 있습니다 얼룩이 질 더블 밴드 발생 하지 않도록 하려면 하룻밤. 이 프로토콜에 중요 한 단계입니다. 염색 하지 오래 충분 한 시간 동안 incubated, 염료-DNA 평형 되지 않을 수도 있습니다 하 고 더블 밴딩 패턴을 줄 것 이다. 이 발생 하는 경우 시간이 더 긴 기간에 대 한 equilibrate를 DNA 염료 혼합을 수 있습니다.
다음, 제한 효소 DNA 염료 혼합에 추가...

토토 시리즈 (토토-1, 요요-1, 포포-1, 보 보-1, 토토-3, 요요 3, 포포-3, 그리고 보 보-3; 표 1) DNA의 시각화가 필요한1,2,3,,45,6,7, 실험의 다양 한 활용 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. cyanine 이합체 가족은 그들의 양자 수율, 감도, 및 DNA 분자18,,1920에 대 한 높은 선호도 널리 사용 된다. Cyanine 이합체 염료 좋은 선택도 두 배 좌초 된 dna와 삽입 된 형광21의 100 ~ 1000 배 증가 했습니다. Pyridinium 염료 (요요-1, 토토 1, 요요-3, 그리고 토토-3) 그들의 quinolium (보 보-1, 포포-1, 보 보-3, 그리고 포포-3) 대응 (표 1)22염색 보다 짧은 방출 파장을가지고. 또한, DNA로 삽입 된 cyanine 이합체의 양자 수율은 높은 (0.2-0.6)22. 그러나, DNA 분자2 의 메 틸 프로필을 확인 하거나 스트레칭23 형광 염료와 스테인드 이미 DNA 분자의 효소를 사용 하 여 어떤 효소 스테인드 DNA를 소화할 것 이다 결정 하는 방법을 필요 합니다. 모든 종류의 DNA에 intercalates 염료 또는 어떤 효소 DNA 기판의 뚜렷한 패턴을 제공 하는이 방법에 대 한 사용할 수 있습니다.
멩 외. 먼저 prestained DNA 젤 전기 이동 법 다른 염료24의 다양 한 사용을 통해의 소화 속도 결정. Maschmann 외 에 파 놓은 광산 염료의 토토 가족 보고 깊은. 둘 다 특정된 염료와 스테인드 DNA 제한 효소25소화 수 경우 보고 스테인드 DNA의 소화 속도 결정. 다른 방법 광학 핀셋26 또는27NMR 사용 하 여 DNA로 삽입 된 염료의 바인딩 효과 연구. 어느 방법을 사용 하려면 전문된 장비; 반면,이 방법을 사용 하면 대부분의 분자 생물학 실험실 염료를 결정 해야 하는 장비는 금지 효소 소화를 방해 합니다.
또한, 주어진된 분자의 길이 측정 하는 다른 방법, 광학 매핑 표면에 흠 없는 DNA 분자를 길쭉한 있으며 스트레치 조각의 크기를 결정 하는 DNA를 소화. 염료의 윤 윤곽선 길이 놓여있는지 스테인드 DNA 분자와 염료 사용에 따라 증가 표시 되었습니다, 그리고 윤곽선 길이 다른21. 이 메서드는 게놈1,3,4,6,13,,2829,30, 의 다양 한 이용 그러나 31., 분자 염료 및 효소에 따라 미리 묻은 경우, 효소 수 없습니다 특정된 염료와 스테인드 DNA를 잘라. 따라서,이 메서드는 특정된 염료와 스테인드 DNA 효소와 함께 소화 수 있습니다 경우 결정 합니다. 또한, 염료와 염료 활용, DNA의 이동성의 농도 따라 젤에 밴드 마이그레이션됩니다32의 기본적인 쌍 사이 삽입할 염료에 대 한 공간을 만들기 위해 DNA 등뼈의 부분 해제로 인해 네이티브 DNA 보다는 더 느리게 .
그러나, 때로는 이러한 염료 수 부분적으로 또는 완전히 특정 제한 효소7,24의 행동을 억제. 이 효소의 특정 시퀀스를 인식 되지 않을 수 있습니다 형광 염료의 부착으로 인 한 DNA 구조 변경 생각 이다. 이러한 염료 제한 효소에 미치는 영향을 이해 실험 메 틸 프로필 또는 스테인드 DNA의 스트레칭은 필요에서 도울 수 있다.
우리의 방법에 DNA의 형광 색소로 얼룩진 고 금지 효소로 소화. 다음 DNA 몇 군데, 젤에 electrophoresed 되었다 그리고 금지 효소 소화 속도 측정 했다. 금지 효소에는 젤 컷된 패턴에 따라 선택 되었다. 너무 많은 악대 DNA 밴드의 중복 발생 하 고 너무 몇 밴드 DNA 분자의 완전 한 그림을 포기 하지 않았다. 명당; 소화 DNA 분자의 프로필을 확인할 수 있다 따라서, 그것은 사용 하는 DNA, 효소에 따라 달라 집니다. 이 방법의 장점은 단순; 그것만 제한 소화와 젤 전기 이동 법에서 사용 하는 장비를 요구 한다.

<table><tbody><tr><td>메틸화되지 않은 람다 DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>피셔</td><td>BP152-1</td><td>자극성</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>피셔</td><td>S316-212</td><td>독성</td></tr><tr><td>HCl</td><td>피셔</td><td>S25358</td><td>부식성 및 자극성</td></tr><tr><td>버퍼 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>버퍼 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>버퍼 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>고겔화 온도 아가로스 젤</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>위험한</td></tr><tr><td>블루 라이트 트랜스일루미네이터</td><td>다크 리더</td><td>DR196</td><td>올바른 안경을 착용하세요&nbsp;</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>피셔</td><td>15585011</td><td>발암 물질; 다른 대안으로는 Nancy 520, Gel red 등이 있습니다.</td></tr><tr><td>캐논 EOS Rebel T3I 카메라</td><td>캐논</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아포지 모델 H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac 기본 전원 공급 장치</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>크실렌 시아놀</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

dna는 cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA의 시각화 cyanine 염료 등 염료의 다양 한을 사용합니다. 이 염료는 DNA에 대 한 그들의 높은 선호도와 감도 활용 됩니다. DNA 분자는 실험의 완료 후 전체 길이 인지 파악 하는 방법 스테인드 분자 DNA를 제한 효소로 소화 하 여 전체 길이 인지 확인 필요 합니다. 그러나, 스테인드 DNA 메서드 하나 형광 색소를 사용할 수 있는 어떤 효소 DNA 스테인드 결정 하는 데 필요한 그래서는 효소를 억제 수 있습니다. 이 방법에서는 DNA는 염료 및 DNA equilibrate를 하려면 밤새 cyanine 염료와 스테인드. 다음, 스테인드 DNA는 제한 효소로 소화, 젤에 로드 이며 electrophoresed. 실험적인 DNA 다이제스트 밴드 제한 효소의 활동을 결정 하기 위해 실리콘에 다이제스트 비교 됩니다. 만약 예상 대로 동일한 수 밴드의 있으면, 반응 완료 됩니다. 더 밴드 부분 소화를 나타내는 예상 보다 적은 밴드 불완전 소화를 나타냅니다. 이 방법의 장점은 단순 하 고 그것은 그 과학자는 제한 효소에 대 한 필요 장비를 사용 하 여 시험 하 고 젤 전기 이동 법. 이 방법의 한계는 대부분의 과학자 들은 수 효소는 상업적으로 이용 가능한 효소; 그러나, 어떤 제한 효소 사용 될 수 있습니다.

경우 intercalating 염료는 DNA를 소화 하는 제한 효소에 영향을 미칠 것 이다, 단계의 올바른 순서로 되어야 합니다 확인 (그림 1)를 따 랐 다. 일단 DNA 스테인드 이며 특정된 효소로 소화, 조각 및 그들의 크기 (그림 2)의 수를 결정 하 젤의 그림을 취할 수 있습니다. 위하여 효소 효율을 보이는 밴드의 수로 나눈 예상된 보이는 밴드의 총 수를 결정 합니다. 효소 효율 같게 화합, 밴드의 수를 예상 하는 경우 및 본된 일치. 다음 예상 젤에 더 많은 밴드 들이 있다면, 값 1 보다 큰 이며 부분적으로 소화 반응을 나타냅니다. 적은 밴드 예상 다음 경우 다음 값 1 미만, 불완전 소화를 나타내는입니다. 그림 2a, 밴드의 이동성은 감소 하 고, 3, 4 차선 표시에에서 우물 쪽으로 이동 하는 악...

형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA 분자를 얼룩이 지는 과학자를 실험 기간 동안 그들을 볼 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법에서 DNA 분자는 미리 형광 염료와 스테인드 하 고 메 틸 화 및 비 메 틸 화 과민 한 금지 효소로 소화.

DNA는 Cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

이 실험의 전반적인 목표는 메틸화 및 비메틸화 민감성 제한 효소로 형광 표지된 DNA 분자를 분해하고 실험의 분해 속도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 유전체학과 같은 화학 또는 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 장점은 과학자가 다른 실험이 완료된 후 DNA가 전체 길이인지 확인하기 위해 효소로 미리 염색된 DNA를 소화할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학부생인 Drew Thompson입니다. 0.7% 아가로스 젤을 만들려면 삼각 플라스크에 1.4g의 높은 겔화 온도 아가로스를 넣으십시오. 그런 다음 200ml의 1x TAE 버퍼를 추가하고 플라스크 위에 거꾸로 된 비커를 놓습니다.플라스크 바닥에 거품이 형성되기 시작하고 상단으로 떠오를 때까지 열판에서 용액을 가열합니다. 핫플레이트에서 용액을 제거하고 맨손으로 플라스크를 만질 수 있을 때까지 식히십시오. 그런 다음 젤 빗을 사용하여 24.5cm x 21.8cm 젤 틀에 젤을 붓고 우물을 만듭니다.피펫 팁을 사용하여 빗 근처 또는 젤 표면의 거품을 터뜨리고 젤이 최소 15분 동안 응고되도록 합니다. 6가지 농도의 염료로 람다 DNA를 염색하려면 먼저 1x TE를 사용하여 람다 DNA 마이크로리터당 100나노그램 300마이크로리터를 준비합니다. 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오.제한 분해물에서 예상되는 각 밴드에 대해 다음 염료 농도 각각에 대한 샘플을 준비하는 동안 75-100 나노그램의 메틸화되지 않은 람다 DNA를 염색합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 제한 효소가 염색된 DNA를 소화할 수 있는지 확인하기 위해 제한 효소 20 단위, 절단 효율이 가장 높은 적절한 완충액 3 마이크로리터, 증류된 오토클레이브 및 여과수를 추가하여 30 마이크로 리터 반응을 일으킵니다.반응을 최적의 효소 활성으로 수조에 넣고 2-4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 0.5 몰 EDTA pH 8.0의 2 마이크로 리터를 추가하여 반응을 중지하십시오. 미리 준비된 겔 몰드에서 측면을 제거하고 겔을 겔 전기영동 상자에 넣습니다.2.5리터의 1x TAE 버퍼를 상자에 붓습니다. 그런 다음 웰에 접근할 수 있도록 젤에서 젤 빗을 조심스럽게 제거합니다. 제한 효소 반응을 플라스틱 필름에 피펫팅하고 각 반응 용액에 대해 5-6 마이크로 리터의 DNA 용액 당 1 마이크로 리터의 6x 로딩 염료를 추가합니다.그런 다음 반응을 우물에 피펫으로 넣습니다. 1마이크로리터의 1킬로베이스 사다리, 9마이크로리터의 1x TE 및 2마이크로리터의 6x 로딩 염료를 혼합합니다. 그런 다음 다른 용액 옆에 있는 웰에 용액을 로드합니다.젤 상자를 짙은 파란색 또는 검은색 종이나 천으로 덮은 다음 젤 상자를 전원 공급 장치에 연결합니다. 전원 공급 장치를 30볼트로 설정하고 밤새 실행하십시오. 겔이 작동하는 동안 조명을 꺼서 표지된 DNA의 광절단을 방지하십시오.다음 날 아침, 트레이의 젤을 45마이크로리터의 브롬화 에티듐과 1리터의 1x TAE 완충액이 들어 있는 용기로 옮깁니다. 용기를 어두운 실온에 보관하거나 빛에 노출되지 않도록 호일로 덮으십시오. 젤을 실온에서 최소 45분 동안 그대로 두십시오.겔을 이미지화하려면 400-500나노미터 사이의 최대 광 출력을 방출하는 청색광 투과광 장치 위에 젤을 놓습니다. 스테이션에 부착된 카메라로 사진을 촬영합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 실험의 소화 속도를 결정합니다.효소 효율은 예상되는 띠의 총 수를 가시 띠의 수로 나누어 결정됩니다. 또한, 밴드의 대략적인 크기를 결정하기 위해서는 염색된 DNA와 비교하여 네이티브 DNA 분자가 예상되는 위치를 알기 위해 대조군이 필요합니다. 3차선과 4차선에 있는 띠의 이동성이 감소하여 띠가 우물에 더 가깝게 이동하게 되었습니다.이 레인에서는 염료의 양이 이동성에 눈에 띄게 영향을 미치지 않으므로 밴드가 컨트롤과 일치합니다. 5번 및 6번 레인은 대조군보다 더 많은 띠를 보여주는데, 이는 부분적 소화를 나타내며, 이는 염료가 인식 부위의 분열에 영향을 미쳤음을 시사합니다. 이 실험에서는 모든 염료 농도에 대해 예상되는 모든 띠가 보이므로 주사위가 DNA의 소화를 방해하지 않았습니다.YOYO-1 염료의 농도가 증가함에 따라 이동성이 어떻게 변화하는지 확인하기 위해 각 밴드 옆에 유색 별표를 삽입했습니다. 예를 들어, 3.5 킬로베이스 밴드는 각 YOYO-1 농도에서 그 옆에 빨간색 별표가 있습니다. 5번 레인과 6번 레인의 예기치 않은 밴드는 밴드 옆에 별표가 없습니다.이 절차를 시도하는 동안 어두운 종이 조각으로 젤을 덮고 어두운 방에서 젤을 완전히 실행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 반응을 위해 어두운 튜브를 사용해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제한 효소로 형광으로 염색된 DNA 분자를 소화하고 반응의 소화 속도를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.브롬화 에티듐으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 절차를 수행하는 동안 장갑과 보안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 또한 트랜스일루미네이터를 사용할 때는 적절한 보안경을 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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