초기 여자 배아 Morphogenesis 물리적 힘의 역할을 프로 빙

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 ex ovo 실험을 통해 초기 배아 뇌 발달에서 기계적 힘의 역할을 연구하는 것입니다. 이 방법은 생물학적 형태의 생성인 형태 형성에서 기계적 단서의 역할과 같은 발생 생물학 및 생체 역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 및 유기체 수준에서 형태 형성에서 기계적 힘의 역할을 특성화할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 70% 에탄올이 함유된 섬세한 물티슈를 사용하여 수정된 특정 병원체가 없는 White Leghorn 닭 달걀을 세척합니다. 그런 다음 홀더에 계란을 세로 방향으로 배열합니다. 그 후, 계란 부화기를 목표 온도인 섭씨 37.5도로 설정하고 습도를 48-55%로 유지 습도는 부화기에 적당량의 물을 첨가하여 습도를 조절합니다.

약 40-44시간 동안 알을 HH11-13까지 부화시킵니다. 그 후, 계란을 실온에서 약 15-30분 동안 식힌 후 70% 에탄올로 세척합니다. 이 단계에서 바닥에서 계란을 깨고 껍질을 부드럽게 당겨 분리한 다음 내용물을 150 x 15mm 페트리 접시에 조심스럽게 넣습니다.

배아 쪽이 위로 향하도록 하려면 난자를 깨는 동안 부화한 것과 동일한 방향으로 난자를 유지하십시오. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 얇은 알부민을 제거합니다. 끝이 뭉툭한 집게를 사용하여 두꺼운 알부민과 노른자를 분리합니다.

노른자의 윗부분을 가볍게 긁어서 두꺼운 알부민이 제거되었는지 확인합니다. 그런 다음 끝이 가는 집게를 사용하여 여과지 링을 배아 위에 놓고 중앙에 놓고 링의 긴 축을 배아의 긴 축과 일치시킵니다. 그런 다음 여과지 링을 둘러싼 노른자를 가위로 자릅니다.

그런 다음 고리와 배아를 노른자에서 난황이 처음 절단된 부위를 향해 비스듬한 방향으로 당겨냅니다. 그런 다음 실온 PBS를 사용하여 100mm 접시 2개에 담아 배아를 헹굽니다. 그런 다음 여과지 링을 35mm 페트리 접시에 넣습니다.

배아 등쪽을 위로 향하게 하여 35mm 페트리 접시의 다른 여과지 위에 놓습니다. 그런 다음 여과지 샌드위치 위에 스테인리스 스틸 링을 놓습니다. 배아가 손상되지 않도록 주의하십시오.

이제 이전에 준비된 CCM을 3ml를 각 페트리 접시에 추가합니다. 당겨진 모세혈관 바늘을 배아 상단을 가로질러 가볍게 훑어내어 각 배아의 유리막 막을 제거합니다. 그런 다음 앞쪽 끝에서 시작하여 노토코드까지 진행하여 vitelline 막을 벗겨냅니다.

그런 다음 35mm 페트리 접시 8개를 물에 적신 물티슈를 깐 150mm 접시에 넣어 습도를 유지합니다. 그런 다음 150mm 페트리 접시를 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣고 95% 산소와 5% CO2로 구성된 가스 혼합물로 봉지를 채웁니다. 백을 밀봉하고 섭씨 37.5도의 인큐베이터에 넣습니다.

이제 인큐베이터에서 배아를 제거하고 OCT 시스템을 사용하여 이미지를 만들고 신경관의 비틀림 각도를 결정합니다. 배아를 광학 현미경으로 옮기고 10X 배율로 시각화합니다. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 0.2ml의 매체를 점진적으로 제거합니다.

각 배지 제거 후 명시야 이미지를 촬영하여 배지-공기 계면이 배아에 미치는 영향을 관찰합니다. 배아를 가로지르는 표면 장력이 비틀림을 유발할 때까지 배지를 계속 제거합니다. 대조 배아와 비교하기 위한 최종 비틀림 각도를 설정하기 위해 OCT 시스템을 사용하여 배아를 다시 한 번 이미지

심장 고리의 방향을 변경하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 여과지를 뒤집어 배아가 복부 쪽이 위로 향하게 합니다. 그런 다음 당겨진 모세혈관을 사용하여 스플란치노흉막의 슬릿을 절단하고 기계적인 힘을 가하여 심장을 오른쪽에서 왼쪽으로 밀어 넣습니다. 심장이 왼손잡이에 위치하도록 유체 표면 장력을 가합니다.

그런 다음 배아를 다시 20시간 동안 배양하여 비틀림의 키랄성 변화를 확인합니다. 여기에 표시된 것은 HH11에서 VM이 제거된 채취된 배아입니다. VM 제거 후 27시간 동안 배양한 동일한 배아는 염전이 감소된 것으로 나타났습니다.

다음은 유체 표면 장력을 가할 때 뇌 비틀림을 겪은 동일한 배아이며, 다음은 비슷한 단계에서 정상적인 뇌 비틀림을 가진 대조 배아입니다. 이 절차를 시도하는 동안 배아가 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 물리적 힘이 형태에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 계산적으로 모델링하기 위해 유한 요소 해석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

따라서 여기에서 개발된 이 기술은 병아리 배아의 형태 형성 역학에 대한 향후 연구를 위한 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 체외 배양을 위해 병아리 배아를 채취하는 방법, 유리관막을 미세수술로 제거하고, 유리세포막이 제공하는 힘을 다시 요약하고, OCT 및 명시야 이미징을 통해 배아 형태를 모니터링하는 방법을 이해해야 합니다.