Name: 다른 빛 자질에 애기 thaliana 성장 행동의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 학습하세요 다양한 빛 조건에서 Arabidopsis thaliana의 성장 행동을 분석하는 방법을. LED 조명과 형광 측정을 활용하여 재현 가능하고 정량화된 식물 표현형 분석을 수행할 수 있습니다.

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F.S. 인정이 연구의 부분을 통해 Rhenac 그린 Tec AG에서 지원 합니다. 제와 B.B. DFG (SFB TR175)에서 자금을 받았다.

이 프로토콜에는 A. thaliana 식물의 성장 행동을 분석 하는 방법의 몇 가지 예제가 있습니다.
1입니다. 준비
<ol><li>시작 하기 전에, 얼마나 많은 식물 실험의 신뢰할 수 있는 통계 분석 하 고 필요한 것입니다 그리고 다음 냄비의 적절 한 금액을 준비에 대 한 주의 깊은 계획을 확인 합니다. 참고: 항상 일부 씨앗 발 아 하지 수 가능성에 대 한 허용.</li>
	<li>다른 개별적으로 프로그래밍 가능 LED 수준의 기후 챔버를 사용 하 여 동일한 일반적인 환경 조건 (자료 테이블)에서 식물 성장 비교.</li>
</ol>2. 식물 성장 및 LED 조명의 설정
<ol><li>6 x 7 cm 화분 토양의 (따라서 다른 조건 및 돌연변이 분석) 적절 한 수를 준비 하 고 그들의 각 하나의 씨를 설치. 참고:이 경우에, 조건 당 36 식물 했다 뿌려.</li>
	<li>4 ° c.에 2 일 vernalize</li>
	<li>설정 상대적 공기 습도 65%와 온도를 22 ° C/16 ° C 16 h 하루 / 8 h 밤 주기. 모든 레벨 200 µ M/c m2/s1의 강렬의 빛을 조정 합니다. 이렇게 기후 상공 회의소의 전면에 터치 스크린을 통해 프로그램에 각각 값을 입력 합니다. 표 1에 제공 된 4 개의 다른 가벼운 질을 비교 하려면 다음 매개 변수를 Led를 설정 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Identifyier</td>
			<td>395 nm [%]</td>
			<td>440 nm [%]</td>
			<td>3 K [%]</td>
			<td>660 nm [%]</td>
			<td>770 nm [%]</td>
		</tr>
<tr>
<td>"햇빛"</td>
			<td>100</td>
			<td>11</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>빨간색과 파란색 (RB)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>파랑 (B)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Red (R)</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: Led에서 방출 하는 가벼운 강렬의 구성
<ol start="4"><li>스펙트럼 출력, 예를 들어 기본 제공 보정된 분석기를 사용 하 여 모니터링 합니다.</li>
	<li>다른 수준에 기후 챔버에 식물을 배치 하 고 발달된 cotyledons 표시 될 때까지 투명 한 탑으로 덮여 유지. 식물은 충분히 물을 뿌린 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>모니터와 문서 식물 눈으로 그리고 자주, 예: 2 일 마다 선택한 조건에서 얼마나 빨리 식물 성장에 따라 적절 한 사진으로. 카메라와 모든 사진에 대 한 개체 사이 동등한 거리를 확인 하 고 그로 인하여 비교를 사용 하는 카메라 삼각대를 사용 해야 합니다. 경우 적절 한 눈금 막대를 사용 합니다. 참고: 용어 DAS (파 종 후 일) vernalization를 포함 한 씨의 실제 설치를 말합니다.</li>
</ol>3입니다. PSII의 결정
<ol><li>펄스 변조 fluorimeter를 사용 합니다. 설정 적절 한 거리에서 카메라 머리를 공장에서 완전 한 장미 라이브 윈도우에서 볼 수 있습니다.</li>
	<li>소프트웨어 시작에 "선택 단위" 창이 나타납니다. "미니" 및 다음 "ok."를 체크 다음 팝업 창에서 "파란" 색을 선택 합니다. 클릭 "ok." 참고: 펄스 변조 형광 빛 측정은 자동으로 전환 됩니다. 모니터에서 이미지 창이 나타납니다 형광 매개 변수 Ft를 보여주는. 카메라 아래에 배치 하는 식물 이제 오렌지를 이미지로 볼 수 있습니다.</li>
	<li>이미지를 집중 하는 식물의 특정 영역을 선택, "라이브 비디오" 박스에 체크 함으로써 라이브 비디오를 전환 하 고 대물 렌즈의 조정 링을 설정 합니다. 라이브 비디오 창 오른쪽 상단에 있는 종료 상자를 클릭 하 여 종료 합니다.</li>
	<li>광합성 매개 변수를 측정, 관심 (아오이)의 영역을 정의 합니다. 기본 설정을 사용 하 여이 자동으로 화면에 나타나는 원입니다. 그것의 옆에 빨간색 상자가 아오이 내의 모든 픽셀의 평균된 피트 값을 나타냅니다. 오른쪽 패널에서 다른 형태를 사용할 수 있는 아오이 상자에서 선택 하 여 적절 한 아오이 정의 합니다. 아오이 탭에서 "추가"를 클릭 하 고 리프 지역 내 원 장소. 잎 당 5 회를 반복 한다.</li>
	<li>제조업체 (표 2)에서 제공 하는 기본 값 (오른쪽 탭) 설정을 유지 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>측정 빛</td>
			<td>Int.</td>
			<td>주파수</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>행동. 빛</td>
			<td>Int.</td>
			<td>너비</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>이미지 수정</td>
			<td>미니</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>이미지 변환</td>
			<td>배터리</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>16.7V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>이득</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>댐핑</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>토 펄스</td>
			<td>Int.</td>
			<td>아니요</td>
			<td>간격 s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>천천히 유도</td>
			<td>지연 s</td>
			<td>시계 s</td>
			<td>기간 s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>40</td>
			<td>20</td>
			<td>315</td>
		</tr>
<tr>
<td>Absortivity</td>
			<td>빨간 이득</td>
			<td>빨간 강도</td>
			<td>NIR 강도</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>340</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>디스플레이</td>
			<td>색</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>추 신: 제한</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Inh입니다. 참고. 아오이</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fm 요소 (진드기)</td>
			<td>1,030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: PAM 측정 제조 업체에 의해 제공에 대 한 기본 설정.
<ol start="6"><li>형광 분석 (채도 펄스)를 냉각 하 여 광합성 매개 변수 측정을 수행 하는 saturating 라이트 플래시를 적용 합니다. 그 전에, dark-adapted 식물의 최소 및 최대 형광 수확량을 측정 하 여 냉각 계수를 결정 합니다. 이 위해, (예를 들면 서랍 또는 어두운 상자) 몇 분 동안 어둠 속에서 공장을 놓습니다. 다음 카메라 머리 아래 공장, 확인란을 측정 및 ML (빛) 측정, 이미지 선택 "Fv/Fm"는 원으로를 클러킹 하 여 행 아래에 놓고 Fo, Fm 화면 하단의 클릭 합니다. 참고: Fo/Fm dark-adapted 식물의 PSII 수익률을 나타냅니다. 따라서, 그것은 빛을 적용 한 후 측정 정규화 된 값입니다. 현재 Fo/Fm 측정 새 레코드 활성화 될 때까지 유지 됩니다. 모든 F와 Fm' 채도 펄스에 의해 결정 값 Fo/Fm 관련 및 냉각 매개 변수 따라 계산 됩니다.</li>
	<li>보고서 탭에서 이러한 결과 찾아서 확인란 모든 오른쪽에 실험 (예관련 된. Y(II), qP, qN, 등).</li>
	<li>분석 소프트웨어 예를 결과 내보냅니다. 왼쪽된 상단에 있는 내보내기 버튼을 클릭 하 여 및 적절 한 파일 이름 저장 합니다. 잎 당 적어도 5 개의 AOIs를 생성 하 고 동일한 식물의 여러 가지 잎을 측정 (잊지 마세요 곧 어두운 각 측정 후 다시 공장을 적응), 한 상태에서 몇 가지 식물 뿐만 아니라 있는 다음 통계적으로 평가.</li>
	<li>통계 분석에 대 한 평균값 및 표준 편차에서에서 생성 모든 AOIs 모든 적어도 3 개의 독립적인 식물 포인트/조건 시간 하 고 학생의 t-테스트 데이터는 중요 한12평가를 수행. 데이터는 p-값이 0.05 이하로 크게 다른 것으로 평가 됩니다.</li>
</ol>4입니다. Stomata 밀도의 결정
<ol><li>수집 3 완전히 확장 장미 잎 조건 당 3 개별 공장에서 엽록소를 추출 하 고 유리 페 트리 접시에 70% 에탄올으로. 하룻밤 실 온 이나 4 ° c.에가 게에서이 용 매에 품 어</li>
	<li>안료에서 전체 클리어런스 chloral 하이드 레이트 솔루션에서 품 어 (chloral 하이드 레이트: 물: 글리세롤 = 8: 2: 1 w/v/w) 단풍이 완전히 흰색 나타날 때까지.</li>
	<li>40 X 확대에서 미분 간섭 현미경 검사 법 (DIC) 이미지의 abaxial 표면을 가져가 라. Stomata 시야에 고 ² 당 stomata 눈금 막대의 도움으로 추정. 조건 당 단풍 4 적어도 위한이 절차를 반복 합니다. 한 조건의 모든 잎에 대 한 평균 값을 계산 하 여 통계 분석을 수행 하 고 평균 오차를 계산 하는이.</li>
</ol>5입니다. 신선한 무게의 결정
<ol><li>면도날으로 조건 당 6 개의 식물에서 근 엽에서 자루를 포함 한 모든 잎을 제거 합니다. 즉시 모든 잎 무게 있으며 데이터 통계 분석을 위에서 설명한 대로.</li>
</ol>6입니다. 장미 잎 지역 결정
<ol><li>조건 당 8 개의 식물에서 그림을 사용 하 여 리프 영역을 그래픽으로 분석. 하나의 이미지에서 한 조건에 대 한 그림을 결합 하 고 *.jpeg으로 저장 또는 *.tiff.</li>
	<li>적절 한 소프트웨어 (자료 테이블)를 다운로드 합니다. 참고: 그것은, 물론,이 작업을 수행할 수 있는 다른 프로그램을 적용 하입니다.</li>
	<li>이미지 파일을 엽니다. 선택 도구 "무료 손을 선택." 잎을 자루의 한 장미를 포함 하 여 둘러싸십시오 "분석-측정 설정된" 클릭 "영역", "최소 및 최대 회색 값"을 체크 하 고 "통합된 밀도," 및 "평균 회색 값입니다." 적절 한 소수 장소, 최고의 2 또는 3을 선택 하 고 클릭 하십시오 "확인."</li>
	<li>M m를 픽셀 대신2 "규모 설정" 명령을 사용 합니다. 이미지의 눈금 막대에서 계산 다음 비율 설정 대화 상자를 열고이 정의 된 거리 및 단위를 입력 하기 쉽게 떠나 직경 예: 알려진된 거리에 해당 하는 라인 선택 하도록 직선 선택 도구 적용 측정입니다. 그런 다음 돌아가서 "분석" 하 고 "측정"을 클릭</li>
	<li>새로운 창이 권리 "결과" 현재 장미에 대 한 관련 데이터를 포함 하는 나타납니다. 이미지에서 모든 식물을 가진이 절차를 반복 하 고 Ctrl + M 모든 새로운 공장에 대 한 측정 영역을 초기화 합니다. 참고: 겹치지 않는 잎을 가진 작은 식물에 대 한 "선택 도구"는 빠르고 쉽게 과정을 만들기 위해 사용할 수 있습니다. 잎 서로 취재 시작,이 도구는 신뢰할 수 있는 결과 제공 하지 않습니다.</li>
	<li>또는, 모든 잎을 잘라 고 개요 그림 반입할 수 있습니다 및 다음 선택 도구를 사용 하 여 방법에 그들을 배치 합니다. 고려 때이 메서드를 사용 하 여 더 많은 식물 필요는.</li>
	<li>"파일"-"다른 이름으로 저장" 결과 창에서 컴퓨터 디렉터리에 적절 한 파일 이름 및 위치를 생성 하 고. Excel 형식으로 파일을 자동으로 저장 됩니다.</li>
</ol>7입니다. RNA의 준비
<ol><li>모든 조건에 대 한 10 개의 개별 공장에서 3 샘플을 수확. 공장 제조 업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 전체 RNA를 추출 합니다. bioanalyzer을 사용 하 여 RNA 농도, 순도, 및 무결성을 확인 합니다. RNA 다음 예: RNASeq13여 qRT-PCR 또는 유전자 표정 분석 같은 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li>
<li>An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Tobacco%2C+Tomato%2C+Potato%2C+and+Arabidopsis+thaliana+Using+a+Binary+Ti+Vector+System%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System.</a> Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).</li>
<li>Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-4931-1">Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols</a>. Murata, M. , Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).</li>
<li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRivero%2C+L+%22Arabidopsis+Protocols%22">Arabidopsis Protocols</a>. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).</li>
<li>Ubbens, J. R., Stavness, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Plant+Phenomics%3A+A+Deep+Learning+Platform+for+Complex+Plant+Phenotyping+Tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Suppression+of+Growth+by+Blue+Light%3A+OCCURRENCE%2C+TIME+COURSE%2C+AND+GENERAL+CHARACTERISTICS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS.</a> Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).</li>
<li>Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Phenotypical+and+Molecular+Analyses+of+Arabidopsis+Grown+under+Fluorescent+and+LED+Light%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light.</a> Plants. 6 (2), 24(2017).</li>
<li>Janda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+stress+response+in+Arabidopsis+thaliana%2C+Nicotiana+benthamiana%2C+Glycine+max%2C+Solanum+tuberosum+and+Brassica+napus+cultivated+under+polychromatic+LEDs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs.</a> Plant Methods. 11 (1), 31(2015).</li>
<li>Olle, M., Viršile, A. <a target="_blank" href="https://journal.fi/afs/article/view/7897">The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality.</a> Agricultural and food science. 22 (2), 12(2013).</li>
<li>Lin, K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423812004797">The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata).</a> Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).</li>
<li>Castronuovo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.pagepress.org/journals/index.php/pb/article/view/6281">Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings.</a> International Journal of Plant Biology. , (2016).</li>
<li>Student, <a target="_blank" href="http://seismo.berkeley.edu/~kirchner/eps_120/Odds_n_ends/Students_original_paper.pdf">THE PROBABLE ERROR OF A MEAN.</a> Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5548/rna-seq">Essentials of Genetics. RNA-Seq.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Klermund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LLM-Domain+B-GATA+Transcription+Factors+Promote+Stomatal+Development+Downstream+of+Light+Signaling+Pathways+in+Arabidopsis+thaliana+Hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls.</a> The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).</li>
<li>Annunziata, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+back+to+nature%3A+a+reality+check+for+experiments+in+controlled+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments.</a> J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).</li>
<li>Palus, S. <a target="_blank" href="https://www.smithsonianmag.com/smart-news/japans-indoor-farm-supplies-10000-heads-fresh-lettuce-every-day-180952142/">Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day.</a> Smithonian.com. , (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

식물 성장을 공부 하는 첫 번째 단계는 원하는 조건에 따라 기후 챔버 설정 합니다. 이것은 쉽게 (그림 1A) 해당 소프트웨어의 프로그램 마스크에 모든 변수를 입력 하 여 이루어집니다. 이 단계에서 많은 수정 빛 체제 또는 온도 변경 하 여 구현할 수 있습니다. 온도, 습도, 조명 조건 (그림 2) 실험을 망치고에서 기술적인 실패를 방지 하기 위해 지속적으로 모니터링 해야 합니다. 이것은 재현 가능한 결과 얻기위한 중요 한 포인트 이다. 이 설정 많은 변수를 제공 하 고 유연 하 게 조정 될 수 있다, 그것은 한계가 있다. 현재 사용할 수 있는 LED 조명은 백 % 햇빛을 모방 수 없습니다 그리고 기후 챔버 내부 기후 조건 결코 완전 하 게 반영 하 고 있습니다 외부15일어나.
널리 사용에 비해 형광 전구 LED 빛은 더 다재 다능 한, 더 적은 에너지를 필요로 하 고 거의 아니 열 방사선 표시. 이러한 장점을 기후 챔버와 Led16온실 장비 실내 농업의 큰 산업을 이끌어 왔습니다. 이 분야에서 보고 거 대 한 성공을 고려 LED 기술을 확실 하 게 많은 더 많은 애플 리 케이 션을 찾을 것입니다.
표현 형을 관찰 하 고 특히 고려 하는 것이 중요 하다 잎 면적의 결정에 대 한 이전 식물에 있는 잎 오버랩 (그림 3). 따라서, 전체 근 엽의 그래픽 평가 정확 하 경향이 있다. 이 경우, 그것은 훨씬 더 정확 하 게 하 고 거기에서 모든 잎을 잘라입니다.
성장 행동의 평가 성장 및 다른 조건 하에서 개발의 차이 특히 충분 한 샘플 크기에 따라 달라 집니다. 이 연구에서 6 식물 예: 광합성 수확량 (그림 5), 신선한 무게 (그림 7)의 결정에 대 한 사용 되 고 보장 하기 위해 연구의 시작에서 리프 지역 (그림 8A) 하지만 30 개별 씨앗 심어 그 첫 번째, 충분 한 씨앗 발 아 하 고 둘째, "전형적인" 식물의 선택 할 수 있다. 동일한 인구, 즉 정확한 동일한 조건 하에서 동일한 트레이 단일 냄비에 공장 내 에서도 다양 한 고기를 보여주었다. 이 다음 과정에 반영 됩니다 표준 편차 통계 분석 중 하지만 데이터의 해석 때 일반적으로 더 신뢰할 수 있는 작은 통계 오류 (그림 8B) 관찰 된다.
여러 매개 변수에 대 한 PAM (그림 4, 그림 5)에 의해 광합성 성능 측정을 할 수 있습니다. 이 경우에, 초점은 PSII 수율 예를 들어 Y(II)에 했지만 그것은 또한 예를 들어 비 광화학 냉각, 레 귤 레이트 및 비 레 귤 레이트 된 에너지 소비 또는 빛 면제의 양자 수율을 확인할 수 있습니다. 여기 잎 잎 표면에 균등 하 게 분산 당 적어도 5 개의 AOIs를 선택 하 고 다음 다른 식물에서 적어도 6 개의 잎을 측정 하는 중요 한. 이 방법의 단점은 PSI에 어떤 영향을 감지할 수 없습니다; 그 목적을 위해 다른 장비는 필요 하다.

애기 thaliana 십년 이상에 대 한 분자의 식물 연구의 모델 생물 되었습니다. 여러 특성에 게 브라 시카 가족의 작은 대표가 유전과 분자 연구를 위한 이상적인 후보자: 그것은 단지 5 개의 염색체 (24 염색체를 가진 예를 들면 Nicotiana tabacum 에 비해) 상대적으로 작은 게놈과 그것의 게놈 20001에 시퀀싱 완전히 했다. A. thaliana Agrobacterium 감염2 로 쉽게 유전자 변형 수 이며 심지어는 최신 유전 같은 도구 CRISPR/Ca3의무가 있습니다. 비록 작은, 성장 주기는 물질의 높은 금액 필요한 생화학 실험 가능 하 게 충분히 빨리 이다. 식물과 성장 한 천 배지 또는 토양에도 액체 문화4으로 경작 될 수 있다. 애기 는 기후 상으로 제어 찬 장, 예: 퍼시벌에서에서 성장 될 수 있다 기후 챔버 또는 온실에서. 성장 동작을 비교 하 고 분석 하는 돌연변이의 고기 수 재현 하 고 같은 시간 유연한 성장 조건5에서 제공 하는 중요 한입니다. 과학적 문제를 해결 하는 것입니다 따라 하나 다른 온도 일정 조명 조건, 다양 한 빛 농도 또는 동일한 온도에 다른 빛 질 수도 있습니다. 빛은 식물 성장에 매우 중요 한 매개 변수 그리고 그 영향력은 종종 다양 한 접근6공부. 재현성 및 comparability 얻은 데이터의 안정적인 출력을 보장 하 여 광원의 동일한 종류를 적용할 결정적 이다.
나트륨 수증기 또는 형광 램프를 만족 식물의 성장을 촉진 하지만 몇 가지 단점이 온실 및 기후 챔버에 일반적인 광원에 의하여 이루어져 있다. 첫째, 그들은 강도 뿐만 아니라 품질 (자신의 관측)에 스펙트럼 출력을 변경 하는 시간이 지나면서 나이. 그러나,만 강도 빛 품질에 변화를 수 들 키 지 하지만 여전히 상당한 효과 지속적으로 모니터링 일반적으로 이다. 둘째, 두 가지 유형의 램프 열 생성 높은 가벼운 강렬에 자체 식물 성장에 심오한 생리 적 영향이 고 어떤 종속 효과 마스크 수 있습니다. 셋째, 이러한 광원의 스펙트럼 출력 이며 불변 자연 햇빛7와 달리 꽤. Led의 경우 이러한 단점 극복 했습니다)8,9,,1011. 그들은 긴 수명을 방출에서 거의 어떤 변경으로도 매우 높은 가벼운 강렬에 폐 열을 생산 하지 않습니다 그리고 그들은 매우 유연 그들의 스펙트럼 출력에 관한.
여기 우리는 빨강, 파랑 및 백색 빛에 대 한 별도 LED 조명을 갖춘 기후 챔버를 설정 하 고 식물의 성장 시간이 지남에 따라 다른 매개 변수를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 신선한 무게, 잎 지역, stomata 밀도, 그리고 광합성 성능을 측정합니다. 같은 시간에 제대로 통계 평가를 설정의 중요성을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>LED 패널이 장착된 기후 챔버</td><td>Rhenac Green Tec AG</td><td></td><td>이 챔버는 맞춤 제작됩니다.</td></tr><tr><td>분광계&nbsp;</td><td>OceanOptics</td><td>USB-650</td><td></td></tr><tr><td>이미징 PAM</td><td>Walz</td><td>IMAGING-PAM M-시리즈</td><td>광범위한 용도에 따라 몇 가지 적합한 모델이 있습니다.</td></tr><tr><td>현미경+ 40x 대물</td>렌즈 <td>Leica&nbsp;</td><td>DM1000</td><td>다른 회사들도 적합한 현미경을 생산합니다.</td></tr><tr><td>Software: ImageJ</td><td></td><td></td><td>웹사이트에서 무료 다운로드</td></tr><tr><td>식물 RNA 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyser</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>추가 컴퓨터 필요</td></tr></tbody></table>

다른 빛 자질에 애기 thaliana 성장 행동의 분석

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

식물 생물학 그들의 선택한 종족의 성장 동작을 관찰 해야 하는 경우가 종종. 이 위해, 식물 지속적인 환경 및 안정적인 조명 조건, 다른 설정을 연구 실시 될 수 있도록 가급적 수량 및 품질에 변수는 필요 합니다. 이러한 요구 사항은 갖춘 빛 발광 다이오드 (LED) 조명-형광등-달리 설정 될 수 있는 다른 파장을 기후 챔버에 의해 충족 됩니다. Led는 에너지 절약 및 방출 거의 열 빛 농도 에서도 종종 다른 광원으로 문제를 구성. 제시 프로토콜 가변 LED 조명 장착으로 성장 고기의 심층 분석에 대 한 몇 가지 방법을 설명 기후 챔버를 프로그래밍 하는 방법에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다. 실험 설정에 따라 성장 하는 식물의 다양 한 특성 관찰 하 고 분석 될 수 있습니다. 여기는 신선한 무게, 잎 지역, 광합성 활동, stomatal 조밀도 결정 하는 방법에 설명 합니다. 신뢰할 수 있는 데이터를 얻을 하 고 통계적 평가 대 한 개인의 충분 한 번호를 사용 하는 유효한 결론을 설명 합니다. 높은 통계 오류에 분석 결과의이 종류에 대 한 몇 가지 식물을 복용 하 고 결과적으로 데이터의 더 적은 명확한 해석에서.

관찰 및 분석 식물의 성장과 특히 고기 돌연변이 식물에서의 안정적이 고 재현 가능한 환경 조건에 의존합니다. 이러한 기후 실에서 제공 될 수 있습니다. 수량을 빛 특히 품질은 비판적으로 고용된 광원 LED 조명에 의해 제공 된이 연구에는에 따라 달라 집니다.
그림 1 은 LED 패널을 갖춘 기후 챔버의 예가 나와 있습니다. 그림 1A 는 모든 기후 및 조명 상태를 조정할 수 있습니다 제어판의 화면을 보여 줍니다. 24 시간 이내 20 다른 시간 프레임을 설정할 수 있습니다. 이 예제에서는 16 빛/8 h 어두운 긴 하루 조건 프로그램 되어 있다. 이 챔버는 식물 성장에 4 개의 다른 가벼운 설정 정확 하 게 동일한 환경 조건 하에서 공부 될 수 있다 따로따로 프로그램 될 수 있는 4 개의 레벨을 갖추고 있습니다. 수준 왼쪽 위 기술적으로 가능한 만큼 햇빛을 흉내 낸 스펙트럼 출력 설정, 상단 오른쪽 수준 대표 상승 레드 (660 nm)와 라이트 블루 (440 nm) 하얀 빛 (3k) 감소. 왼쪽된 하위 수준 높은 푸른 빛을 주로 붉은 빛을 낮은 오른쪽 수준 설정 했다. 그림 1B (중간 패널)에 대 한 개요와 해당 확대/축소 기능 (외부 작은 패널)로 서 다른 설정에서 Led를 보여 줍니다. 빛 자질에 차이 눈으로 쉽게 볼 수 있습니다.
Inbuilt 분석기 지속적으로 측정, 모니터링, 고 스펙트럼 출력을 조정 합니다. 그림 2 상단 왼쪽된 수준에서 1.1, 태양 빛을 모방 하기 위해 설정 된 스펙트럼을 보여준다. 표준 형광 전구에 비해 자외선과 파란 빛의 부분 많은 더 높은7이다.
A. thaliana 의 예를 들어 그림 3 식물은 모든 4 개의 조건 10, 13, 17 일, 각각, 묘사는 파 종 후. 모든 식물은 삼각대에 카메라를 장착 하 여 같은 거리에서 촬영 했다. 눈금 막대는 1 cm를 나타냅니다. 10 일 후, 크기 또는 색상 별로 차이 분별 수 있습니다, 하지만 후 17 일 빨간 불빛 아래 빠른 성장을 분명 합니다. 이 시각적 분석 뿐만 아니라 여러 가지 생리 적 분석을 수행 했다.
그림 4 팸 측정의 다른 단계 분석 예: 광합성 능력을 따릅니다. 그림 4A 에서 라이브 비디오의 화면에 표시 됩니다, 초점으로 공장을 데 려에 대 한 설정입니다 측정의 최적의 품질을 보장. 전체 식물에 초점을, 대신 하나 분석을 단일 잎을 선택할 수도 있습니다. 그림 4B 실제 측정을 시작 하기 전에 현재 형광 수확량 dark-adapted 식물의 보여 줍니다. 이 경우 관심 (AOIs)의 5 개의 원형 영역 선정 됐다. 각 아오이 옆에 빨간 상자에 있는 숫자는 직접 테이블의 형태로 저장 될 수 있는 숫자 결과 제공 합니다. 광합성 매개 Fo의 측정을 시작, Fm 설정 해야 합니다. 이렇게 후 피트의 화면 그림 4C에 그려져 있습니다. Note는 지금 버튼 "Fo, Fm" 더 이상 활성화 하지 않습니다. 새로운 측정을 시작, "새로운 기록" 이전 정규화를 지우려면 클릭 해야 합니다. 마지막으로, 그림 4D saturating 빛 펄스 ("토-펄스")를 주고 효과적인 PSII 양자 수율 Y(II)를 보여 줍니다. 모범적인 데이터의 정량화는 그림 5에 표시 됩니다. 200 µ M/c m2/s1 (그림 5A)에 햇빛에서 성장 된 식물은 각각 12, 21, 28 일 파 종, 후 분석 되었다. 우리의 데이터 PSII 수율은 12 일 보다 3 주 동안 성장 식물에서 잎에 상당히 높은 보여줍니다. 28 12 일 사이의 차이점은 아직도 중요 한, 하지만 p-값이 큽니다. 그림 4B, 다른 빛 자질에서 2 주 동안 성장 하는 식물에서 PSII 수익률 비교 되었다. 흥미롭게도, 푸른 빛의 높은 부분을 포함 하는 빛의 밑에 영구 성장을 PSII의 상당히 큰 항복 이끌어 낸다. 풍부한 붉은 빛 아래에서 재배 하는 식물에 대 한 비슷한 효과 관찰 했지만 증가 약간 낮은.
다른 빛 질 효과 stomata 개발14에 표시 했다. 따라서, stomatal 밀도 조사 했다. 그림 6 에서는 색소 추출 후 잎 모양을 보여 줍니다. 단일 표 피 세포는 잘 구분할 수 있습니다, 그리고 stoma 쉽게 계산 하실 수 있습니다. 그림에서 개별 stomata는 별표로 표시 됩니다. 다른 조명 설정에서 식물의 stomatal 조밀도 대 한 자세한 데이터 다른9를찾을 수 있습니다.
육안 검사 (그림 3) 신선한 무게 제공 성장 발전의 좋은 측정을 합니다. 이 예제에서 후 파 종, 8, 10, 그리고 12 일 후 각각, "햇빛"에서 성장 된 식물에서 잎 무게 했다. 이러한 데이터의 통계적 평가 그림 7에서 볼 수 있습니다. 예상 했던 대로, 신선한 무게는 시간이 증가 합니다.
신선한 무게, 외 잎 지역 성장 위한 좋은 측정 이다. 여기, 공장 개발 (그림 8A) 파 종 후 10, 13, 17 일에서 뒤를 이었다. 6 개별 공장 신뢰할 수 있는 통계 자료를 정기적으로 평가 했다. 높은 샘플 크기의 중요성을 보여, 각각, 2 및 6 개의 식물 분석에서 평균 값의 백분율 오차 계산 되었다 (그림 8B). 즉, 평균 값에 대 한 표준 편차 비율 결정 했다. 작은 샘플 크기를 경우 오류 5-10% 보다 더 높은 샘플 크기의 경우는 매우 분명 하다. 평가 되는 식물의 수를 늘림으로써 오류 최소화할 수 있습니다, 훨씬 명확 하 게 데이터를 해석 하 게 하.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig1.jpg"> 그림 1: 다른 빛 질 Led에 의해 제공 됩니다. A) LED 챔버의 컨트롤 패널에서 화면 캡처. 하루 길이 16 h (오른쪽 상단)에 설정 되 고 빛의 강도 200 µmol c m-2의 -1로 설정 됩니다. 빛 품질은 모든 4 개 수준에 다른: 1.1으로 가능한 기술적으로 햇빛에 비슷한 스펙트럼을 나타냅니다, 1.2 나타내는 빨간색과 파란색 파장 (RB) 빛의 높은 백분율, 2.1은 주로 파란색 (B), 2.2 대표 주로 빨간색 설정 빛 (R)입니다. B) 중간 패널; 모든 레벨에 대 한 개요를 보여 줍니다 외부 패널 높은 줌에서 개별 레벨을 보여줍니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig2.jpg"> 그림 2: 시뮬레이션된 햇빛 설정에서 파장 스펙트럼. 1.1 수준 배치 했다 LED 챔버에 inbuilt 분석기에서 화면이 표시 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig3.jpg"> 그림 3: 주 발전 공장. 대표 A. thaliana 10, 13, 17 DAS에서 모든 4 개의 조명 조건에서 식물. 식물은 삼각대에 디지털 반사 카메라와 함께 촬영 했다. 눈금 막대는 모든 이미지에 대 한 1 cm를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig4.jpg"> 그림 4: A. thaliana 식물의 팸 측정의 대표적인 단계에서 스크린샷. A) 이미지 초점을 조정 될 수 있다 "비디오 라이브" 보기에서 화면 캡처. B) 어떤 광 펄스의 응용 프로그램 전에 현재 형광 항복 피트. C) Fo/변조가의 설정 후 현재 형광 항복 피트 D) saturating 빛 펄스를 설정한 후 효과 PSII 양자 수율. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig5.jpg"> 그림 5: 효과 PSII 양자 수율 (YII)의 그래픽 표현. A) 에서 데이터 식물 파 종 후 12, 21, 28 일 및 성장된 미만 200 µ / cm2/s1 시뮬레이션된 태양 빛 아래에서 ("햇빛") 팸 분석 대상이 통계적으로 평가 했다. 5 일 당 5 개의 AOIs의 평균 값은입니다. 1 별표 나타냅니다 p-값이 상당한 차이 &lt; 하루 12, 그리고 두 개의 별표 표시는 p-값이 매우 중요 한 차이에 비해 0.05 &lt; 학생의 t-검정에 따라 0.02. B) 블루 200 µ / cm2 /s1 시뮬레이션된 햇빛 (SL), 아래 풍성 하 게 자란 식물 (B) 또는 빨간색 (R)에서 데이터 빛, 각각 통계적으로 평가 했다. 5 일 당 5 개의 AOIs의 평균 값은입니다. "햇빛"에 비해 상당한 차이 계산
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig6.jpg"> 그림 6: A. thaliana 잎의 abaxial 측에 stomata의 대표 이미지. 잎 위에서 설명한 대로 준비 하 고 시각적으로 DIC 설정 40 X 확대 가벼운 현미경 분석 했다. Stomata 조건 당 최소 4 잎의 가시 영역에 계산 됩니다. 그림이는 현미경 tubus에 연결 된 디지털 카메라와 함께 찍은. ² 당 stomata의 수는 눈금 막대의 도움으로 계산 됩니다. 별 하나의 stoma를 나타냅니다. 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig7.jpg"> 그림 7: A. thaliana 식물에 성장에서 신선한 무게의 그래픽 표현을 시뮬레이션 햇빛/200 µ / cm2/s1. 장미 잎 10, 그리고 12 일 파 종 후 8, 식물에서 절단 했다. 하루 6 식물에서 mg에 평균값 묘사 된다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig8.jpg"> 그림 8: A. thaliana 잎 지역 다른 조명 조건 하에서 성장 된 식물에서의 통계 평가. A) A. thaliana 10, 13, 17 일에 대 한 성장에서 리프 지역 ImageJ와 n 에서 데이터 그래픽 결정 했다 6 = 식물 통계적으로 평가 했다. 각 조건에서 모든 6 개의 근 엽에서 리프 지역 정리 되었고 평균 값을 6으로 나눈. 이 값과 표준 편차를 계산 하 고이 오차 막대에 의해 표시 됩니다. B) 잎 지역 ImageJ와 중 n 에서 데이터 그래픽 결정 했다 = 2 또는 n = 6 식물, 각각, 패널 A. 설명한 대로 통계적으로 분석 되었다 다음 평균 값의 %에서 오류 계산 하 고 그래픽으로 묘사 했다. N 의 분석에서 백분율 오류를 표시 하는 녹색 막대 = 6, n 에서 바 블루 = 2 식물. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리는 식물 성장 행동과 특히 고기를 공부 하 고 재현 가능한 방식에 대 한 프로토콜을 제시. 우리는 변수와 같은 시간 안정적인 조명 조건에서 제공 하는 방법을 보여줍니다. 적절 한 분석은 충분 한 샘플 번호 및 유효한 통계 평가에 따라 달라 집니다.

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

이 시각 및 분자 표현형 분석의 전반적인 목표는 다양한 광 조건과 다양한 유전자형에서 식물 성장을 비교하는 것입니다. 이 방법은 다양한 조명 조건에 대한 적응과 같은 식물 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재현 가능하고 정량화 가능한 결과를 제공한다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Franka Seiler입니다. 시작하려면 적절한 표본 크기를 계산하고 흙이 있는 6 x 7cm 화분의 필요한 수를 준비하고 각각에 하나의 씨앗을 심습니다. 그런 다음 씨앗을 섭씨 4도에서 이틀 동안 버날라이즈합니다.기후 챔버의 상대 습도를 65%로 설정하고 온도를 섭씨 22도 및 16도로 설정하여 하루 16시간, 밤 8시간 주기로 설정합니다. 그런 다음 모든 레벨의 조명을 평방 센티미터당 200마이크로몰 및 초당 강도로 조정합니다. 내장된 분광계를 사용하여 스펙트럼 출력을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다.식물을 기후 챔버에 놓고 잘 발달된 코탈린이 나올 때까지 투명한 윗면으로 덮습니다. 식물을 육안으로 검사하고 일정한 간격으로 성장 데이터를 사진으로 기록합니다. 일관된 이미지를 보장하려면 각 사진에 카메라 삼각대와 축척 막대를 사용하십시오.먼저 식물을 몇 분 동안 어둠 속에 두십시오. 그런 다음 펄스 변조 형광계와 카메라를 공장에서 적절한 거리에 설치합니다. 전체 로제트는 라이브 창에서 볼 수 있어야 합니다.소프트웨어를 시작하고 단위 선택 창에 나타나는 미니 옵션을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 팝업 창에서 파란색을 선택하고 확인을 클릭합니다.라이브 비디오 옵션을 선택하고 대물 렌즈의 조정 링을 돌려 이미지의 초점을 맞추고 식물의 특정 영역을 선택합니다. 라이브 창을 종료하려면 오른쪽 상단 모서리에 있는 종료 상자를 클릭합니다. 기본 설정을 사용하여 관심 영역 또는 AOI를 정의합니다.AOI에 포함된 픽셀의 평균 FT 값이 있는 원과 빨간색 상자가 화면 중앙에 자동으로 나타납니다. 직접 정의하기 전에 이 AOI를 삭제해야 합니다. 그런 다음 오른쪽 탭에서 기본 설정을 수락합니다.그런 다음 AOI 탭에서 추가를 클릭하고 잎 영역 내에 원을 배치합니다. 이 과정을 잎당 5번 반복하여 식물당 여러 잎을 선택합니다. 최대 PS 2 양자 수율이 있는 해당 상자를 선택하여 FV/FM 이미지를 선택합니다.F0, FM 버튼을 눌러 형광 주먹 분석을 통해 광합성 매개변수를 측정하기 위해 포화 광선 플래시를 적용합니다. 보고서 탭에서 결과를 찾습니다. 관련 상자를 모두 선택하고 적절한 분석 소프트웨어로 내보냅니다.본 연구에서는 식물의 생장 및 정맥 유형의 관찰 및 분석에서 안정적인 광량과 품질을 제공하기 위해 LED 조명을 사용하였다. 식물의 데이터는 봉제 후 12일, 21일, 28일에 수집되었습니다. 이 그림에는 5개의 식물과 5개의 양자 수율 값에 영향을 미치는 PS 2의 평균이 나와 있습니다.시뮬레이션된 햇빛, 풍부한 청색 또는 적색광 아래에서 자란 식물의 데이터를 통계적으로 평가했습니다. 이 그림은 하루 5개의 식물과 5개의 양자 수율 값에 영향을 미치는 PS 2의 평균을 보여줍니다. 청색광과 적색광 아래에서 자란 식물의 평균값은 시뮬레이션된 햇빛 아래에서 자란 식물보다 훨씬 높았습니다.일단 설치되면 LED 조명은 형광등에 비해 많은 에너지를 절약하여 안정적이거나 다양한 조명 조건을 제공할 수 있습니다. 실험하는 동안 매일 식물을 섭취하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 식물 연구 분야의 연구자들이 정의된 파장을 가진 다양한 빛 조건에서 성장 거동을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.이 비디오를 시청한 후에는 식물을 성장시키는 방법을 잘 이해하고 식물의 시각 및 분자 대정맥 유형과 관련하여 정량적으로 분석해야 합니다.

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생물학

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