조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

이 프로토콜의 전반적인 목표는 조직학적 분석을 통해 침습성 아스페르길루스증이 있는 마우스의 폐 진균 부담을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 곰팡이 발병 기전 분야에서 보호 및 해로운 숙주 반응 메커니즘과 주요 곰팡이 독성 요인에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 조직학적 샘플을 사용하여 폐 진균 DNA의 정량적 PCR 적용과 유사한 결과로 진균 부담을 얻을 수 있다는 것입니다.

이 방법은 침습성 아스페르길루스증에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 숙주 조직 내에서 병원체를 차별적으로 염색할 수 있는 다른 질병 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 DNA 정량적 방법보다 변동성이 적은 폐 진균 부담을 정량화하는 대체 방법을 생각하기 시작했을 때 처음 떠올랐습니다. 감염 및 채취 절차를 시연하는 것은 연구 기술자인 Angar Tsoggeral이 맡을 것입니다.

감염 24시간 전, 각 동물의 측면 우측 하단 사분면에 복강내에서 45도 각도로 전달된 멸균 식염수에 0.5mg의 항 마우스 Ly-6G 항체를 투여한 각 실험용 7-10주 생쥐의 호중구를 고갈시키고 마우스를 케이지로 되돌립니다. 다음 날 아침, 0.5mm 유리 구슬 1.5g을 A.fumigatus conidia 배양 플레이트에 붓고 구슬이 곰팡이로 코팅될 때까지 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 기울입니다. 분생포자 코팅된 비드 혼합물을 15ml 원뿔형 튜브에 모으고 5ml의 DPBS에 비드를 현탁시킵니다.

구슬을 소용돌이쳐 곰팡이에서 분리하고 혈구계에서 상층액을 50배 희석하여 분생포자를 계산합니다. 분생포자를 DPBS 농도 10의 8번째 분생분자로 1배로 희석하고 마우스당 50마이크로리터의 분생자 용액을 개별 마이크로피펫에 로드합니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후, 첫 번째 마취된 마우스를 누운 자세로 비스듬한 보드에 놓고 위쪽 앞니는 고무 밴드로, 아래쪽 앞니는 금속 와이어로 부드럽게 고정합니다.

그런 다음 작은 집게를 사용하여 혀를 조심스럽게 완전히 펴고 50마이크로리터의 분생포자 용액을 혀 바닥에 전달합니다. 혀를 완전히 펴고 20초 동안 또는 서스펜션이 완전히 흡인될 때까지 빠른 호흡과 흡인의 뚜렷한 딸깍 소리에 귀를 기울입니다. 그런 다음 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 마우스를 케이지로 부드럽게 되돌리고 다음 동물을 감염시킵니다.

모든 쥐가 감염되면 동물의 하위 집합에 항진균제를 주입하고 감염 후 24시간 동안 모든 동물에서 호중구 고갈을 반복합니다. 곰팡이를 투여한 지 3일 후, 흡수 패드로 덮인 폼 보드에 첫 번째 마우스를 누운 자세로 놓습니다. 발가락 꼬집기로 쥐를 안락사시키고 70% 에탄올로 머리카락을 소독합니다.

팔다리를 고정한 후 가위를 사용하여 흉곽 위쪽을 조심스럽게 열고 흉곽을 잘라내어 폐와 심장을 노출시킵니다. 다른 혈관을 절단하거나 장기에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 심장에서 내려오는 하대정맥을 절개하고, 25게이지 바늘이 장착된 5ml 주사기를 45도 각도로 잡고 5ml의 차가운 DPBS를 심장의 우심실로 천천히 관류합니다. 같은 방법으로 10%포르말린 5ml를 관류한 후 기관을 조심스럽게 노출시키고 기관에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 주변 지방 패드를 분리합니다.

집게로 노출된 기관을 들어 올리고 25게이지 바늘을 사용하여 상부 기관에 구멍을 뚫습니다. 구멍을 통해 캐뉼라를 폐 쪽으로 조심스럽게 삽입하고 기관 주위에 수술 실을 느슨하게 묶어 캐뉼라를 고정합니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 캐뉼라를 통해 1밀리리터의 10% 포르말린 완충액으로 폐를 팽창시키고 빠르지만 조심스럽게 캐뉼라를 제거합니다.

수술 실을 조여 기관을 밀봉하고 실을 부드럽게 당겨 결합 조직을 분리하여 폐와 기관을 적출할 수 있습니다. 15ml의 10% 포르말린 완충액이 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 조직을 넣고 실의 한쪽 끝이 튜브 바깥쪽에 있도록 합니다. 그런 다음 캡을 밀봉하고 튜브를 뒤집어 샘플과 정착액을 최소 24시간 동안 완전히 담그십시오.

수확된 조직을 이미지화하려면 먼저 적절한 이미징 정량화 프로그램을 열고 광학 현미경을 사용하여 10X 대물렌즈 아래에서 각 Gomori의 변형된 메탄아민 실버 또는 GMS 염색 슬라이드의 최소 4개의 뚜렷한 필드를 얻습니다. 이미지가 폐 내의 감염된 기도를 대표하고 유사한 조직 밀도를 나타내는지 확인합니다. 이미지에 축척 막대를 추가하려면 편집 메뉴에서 보정 마크 추가/편집을 선택하고 선 두께, 색상 및 축척 막대 크기를 선택합니다.

스케일 바가 배치될 이미지를 클릭한 다음 편집 메뉴를 열고 Merge and Merge Calibration Marks를 선택하여 각 이미지에 스케일 바를 추가하고 이미지를 적절한 실험 그룹 폴더에 저장합니다. 각 동물의 곰팡이 부담을 계산하려면 적절한 이미지 처리 프로그램을 열고 이미지의 첫 번째 폴더를 엽니다. 이미지 메뉴에서 유형 및 RGB 스택을 선택하여 이미지를 변환합니다.

오른쪽 화살표 키를 사용하여 세 이미지 중 두 번째 이미지를 선택하고 Control-Shift-T를 눌러 임계값 메뉴 설정 조정자를 엽니다. 원본 tiff 또는 jpg 이미지를 참조로 찾고 이미지 보기 프로그램으로 이미지를 엽니다. 임계값을 선택할 때 선택한 영역이 곰팡이 균사를 대표하고 샘플 간의 일관성을 보장할 수 있도록 원본 이미지를 볼 수 있는 것이 중요합니다.

상단 슬라이더를 왼쪽 끝까지 이동하고 선택한 빨간색 영역이 현미경 이미지를 나타낼 때까지 하단 슬라이더를 조정합니다. Set and OK(확인)를 클릭하고 Analyze(분석) 및 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역), Area fraction(면적 분수), Limit to threshold(임계값 제한), Display label(레이블 표시)을 선택하고 하단 설정은 기본값으로 둡니다. OK(확인)를 클릭하고 Analyze and Measure(분석 및 측정)를 선택합니다.

결과가 나타나야 합니다. 그런 다음 그래프 작성 및 통계 분석을 위해 데이터를 데이터 분석 프로그램으로 내보내고 각 폐 샘플에 대한 4개 이상의 면적 백분율의 평균을 입력합니다. 이 대표적인 생존율 그래프에서 알 수 있듯이, 감염 후 항진균제로 치료받은 침습성 아스페르길루스증을 앓고 있는 호산구 결핍 마우스는 야생형 동물에 비해 생존율이 높았습니다.

침습성 아스페르길루스증이 있는 호중구 감소성 야생형 및 호산구 결핍 마우스에서 추출한 대표적인 GMS 염색은 항진균 처리 마우스에서 항진균 처리 유무에 관계없이 야생형 동물에서 왕복 반응되지 않는 항진균 처리된 녹아웃 마우스에서 거의 완전한 진균 제거를 보여줍니다. 또한, 방금 시연된 바와 같이 정량적 PCR 및 수동 광학 현미경 GMS 정량화는 모두 항진균제 처리가 야생형 마우스와 호산구 결핍 마우스 사이에서 가장 큰 곰팡이 부담 감소를 초래한다는 것을 확인합니다. 그러나 처리되지 않은 마우스에서는 GMS 정량화만이 이 실험에서 호산구 결핍 마우스의 현저한 감소를 확인했습니다.

전체 폐 GMS 염색 절편의 평균 면적을 4X 배율로 계산할 때, 통계적 유의성은 적지만 4개의 대표 10X 필드로 얻은 결과와 차이가 유사합니다. 유사한 생존율, 진균 부담 및 진균 제거 결과는 동일한 항진균제로 처리된 감마-델타 T 세포 결핍 마우스에서도 관찰됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 조직학적 단면의 사진을 찍을 때와 비교 가능한 결과를 얻기 위해 임계값을 조정할 때 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 표적 염색과 배경 염색 사이에 명확한 차이가 있는 샘플의 조직학적 분석을 포함하는 다른 방법을 수행하여 폐 및 기타 조직의 질병 병리학과 관련된 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 비자발적 흡인으로 쥐를 진균 분생포자에 감염시키는 방법과 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 폐 조직 절편에서 진균 성장을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. Aspergillus fumigatus 및 Gomori의 변형 된 메탄아민 실버 염색으로 작업하는 것은 위험 할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비를 착용하고 통풍이 잘되는 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.