Name: 조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 학습하세요 조직학 분석을 통해 침습성 아스페르길루스증 마우스의 폐 곰팡이 부담을 정량화하는 방법을. Gomori 은색 염색법을 활용하여 기존 샘플로 qPCR과 유사한 결과를 얻으면서 실험 동물 수를 줄일 수 있습니다.

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이 연구로는 인디애나 대학 학교의 의학 연구 향상 그랜트와 NIH NIAID 1R03AI122127-01에 의해 부분에서 지원 되었다. N.A.는 Immunologists의 미국 협회에서 경력 면역학 친교에 의해이 기간 동안 부분적으로 지원 되었다.

모든 동물 절차 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 주립 대학, 인디애나 대학의과 대학의 호스트 캠퍼스 승인 했다-테 르 오 트.
1. A. fumigatus Conidia 감염에 대 한 준비
<ol><li>환기가 증기 두건에서 작업 하는 동안 900 µ L 셀 문화 학년 물 (CCGW) A. fumigatus 293 재고 솔루션의 125 µ L를 추가 합니다. 다음에 맥 아 피 펫을 통해 추출 천 (MEA) 배지 inoculating 루프와 균등 하 게 확산을 솔루션 전송.</li>
	<li>적어도 14 일 동안과 더 이상 28 일 24 ° C에서 어둠 속에서 곰 팡이 접시를 저장.</li>
	<li>유리 비즈를 사용 하 여 앞에서 설명한9conidia 수확.</li>
	<li>접시에 유리 구슬 0.5 m m의 1.5 g를 부 어 부드럽게 그것을 기울이기 앞뒤로 구슬 conidia를 추출 하기 위해 코팅은. 15 mL 원뿔 튜브에 구슬/conidia 혼합물을 수집 합니다. Dulbecco 5 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 소용돌이에 일시 중단 합니다.</li>
	<li>Conidia는 hemocytometer를 사용 하 여 하는 DPBS에 상쾌한의 50 배 희석에서을 계산 합니다. 그림 1 에 표시 된 지역에서 conidia의 수를 계산 하 고 방정식 1 를 사용 하 여 농도 계산 하. #Conidia × 희석 요인 10 ×4= Conidia/mL (식 1) 참고: 추가 4 x 4 사각형 모서리가 영역 수 계산, 방정식 1에 #Conidia로 사용 하는이 분야의 의미와.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig1.jpg"> 그림 1: Hemocytometer 대표 지역 conidia 계산에 사용 (상자, 화살표).
<ol start="6"><li>당 무 균 식 염 수 (DPBS) 원하는 농도, 5 x 106 conidia/50 µ L. 준비 50 µ L conidia 솔루션의 감염에 대 한 108 conidia/mL x 1.0를 가진 conidia 현 탁 액을 희석 ' n + 2' 계정 pipetting에 감염 되는 쥐 오류가 발생 했습니다. 참고: 표준 균 수확 및 준비/여과 또는 사용된10수 있습니다. 유리 구슬 메서드는 가장 사용 conidia 샘플 최소한의 작은/녹는 hyphal 항을 열망에 대 한 가져온.</li>
</ol>2. 면역 억제 및 감염 Murine 모델의
<ol><li>7-10-주-오래 된 마우스를 사용 합니다. 참고: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA, BALB/c 배경), 그리고 γ T 세포 결핍 (TCRδ-/-, B6 배경) 쥐가이 연구를 위해 사용 되었다. 각 실험, 나이 및 성별 일치 (남성과 여성 모두) 마우스 각 그룹에 대해 사용 되었다.</li>
	<li>호 중구 통해 복 (IP) 주입 측면 하단 오른쪽 사분면에 45 °에 메 마른 염 분에 0.1 mL (0.5 mg) 안티-mouse-Ly-6 G 항 체의 고갈 (실험 일정 그림 2참조).</li>
	<li>24 시간 후, 106A. fumigatus conidia 50에 x 5.0 포부 쥐 감염 µ L 살 균 염 분 앞11에서 설명한 (단계 2.4-2.10 참조). 동물의 하위 집합 등이 연구에 사용 하는 DPBS에 5 mg/kg caspofungin diacetate antifungal 에이전트와 함께 주사 감염, 다음 (매일, 그림 2참조).</li>
	<li>99.9 %isoflurane 수의학 마 취 기계를 사용 하 여 함께 마우스를 anesthetize.<ol>
<li>대변과 소변을 잡으려고 유도 챔버의 바닥에 종이 타월을 놓습니다.</li>
		<li>마우스에 유도 챔버, 뚜껑, 보안 고 2 분 및 30에 대 한 5 %isoflurane는 기화 기를 설정 s. 참고: 수 의사 연 고 마 취 총 시간은 5 분 미만 이기 때문에 사용 되지 않습니다.</li>
		<li>30에 대 한 최대 설정의 절반은 기화를 줄일 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>확인 호흡, 운동의 부족 및 발가락 꼬집어 자극에 응답의 부족 둔화 마우스 제대로 관찰 하 여 마 취.</li>
	<li>유도 약 실 및 경사 보드에 장소에서 마우스를 제거 합니다. 보드에 대 한 그것의 뒤를 가진 마우스를 놓습니다. 그것의 위 앞 니는 고무 밴드와 부드럽게 절제 된 더 낮은 앞 니 부드럽게 금속 와이어와 절제 된 확인 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 작은 집게와 혀의 기지에서 conidia/PBS 서 스 펜 션의 피 펫 50 µ L 전체 확장에서 혀를 개최.</li>
	<li>전체 확장; 혀를 잡으십시오 빠른 호흡과 열망의 독특한 클릭 소음을 들어봅니다. 20 동안 s 또는 서 스 펜 션은 완벽 하 게 발음 하는 때까지.</li>
	<li>경사 보드에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 관찰에 대 한 감 금 소에 배치.</li>
	<li>포부, 다음 마우스 야 회복 1 분 모니터 내 의식 마우스까지 완벽 하 게 의식 하 고 감 금 소의 주위에 걸을 수 있습니다. 동물 21 ° C에서 지 내게 하 고 폐는가 걷이 될 때까지 두 번 매일 모니터링 해야 합니다.</li>
	<li>호 중구 (단계 2.2) 24 h 후 감염 (그림 2)의 소모를 반복 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig2.jpg"> 그림 2: 실험 일정. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다.
3. 수확 및 조직학 분석을 위한 마우스 폐의 보존
<ol><li>깊이 anesthetize 390 mg/ml pentobarbital 나트륨 솔루션 IP의 0.1 ml의 치명적인 복용량을 가진 동물.</li>
	<li>핀셋으로 자발적인 호흡의 부족 및 사지 자극 반응의 부재를 관찰 하 여 안락사를 확인 합니다. 안락사, 일단 70% 에탄올 소독과 시체를 스프레이.</li>
	<li>흡수 성 패드로 덮여 폼 보드에 시체를 놓습니다. 참고: 시체 두어야 한다 그것의 뒤에 폼 보드에 모든 4 개의 사지를 고정 하는 핀.</li>
	<li>주의와 위를 사용 하 여 상단의 가슴 구멍을 엽니다. 폐 및 심 혼을 노출 하려면 흉 곽을 떨어져 잘라. 관류 수 있도록 열 등 한 베 나 정 맥을 잘라. 혈관을 절단 하 고 장기를 puncturing 하지 마십시오.</li>
	<li>천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 5 mL와 함께 perfuse. 10% 포 르 말린의 5 mL와 관류를 반복 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 기도 하 고 주변 지방 패드를 분리. 주의 사용 하 고 기도 puncturing 피하십시오. 초과 결합 조직 완전히 진행 하기 전에 기도 시각화 하기 위해 제거를 확인 합니다. 일단 기도 노출 장소 그것을 상승 기도 아래 집게.</li>
	<li>25 G 바늘을 사용 하 여 위쪽 기도에 작은 구멍 고추. 참고: 구멍 해야 될 배치 전체 정 기도에 맞는. 주의 사용 하 여 기관지 파열 방지.</li>
	<li>정 및 폐 쪽으로 구멍을 통해 삽입 합니다. 기관지 주위에 느슨하게 묶인 수술 실로 정을 보안 합니다. 참고: 기관지 파열 하는 경우는 정 가능한 기도에서 기도 과거 삽입할 수 있습니다.</li>
	<li>주사기를 사용 하는 정 맥을 통해 10% 포 르 말린 버퍼의 1 mL와 함께 폐 부 풀 려. 폐의 인플레이션 볼 수 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 카 테 터를 조정 하 고 반복. 폐가 팽창 되 면 신속 하 게 주의 정 맥을 제거 하 고 안전 하 게 봉쇄 기도 스레드 조입니다. 참고: 기관지 파열 폐 팽창 될 수 없는 경우에, 폐 수확 여전히 수 있습니다 하지만이 적절 한 고정 되지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>부드럽게 기관지 및 폐에서에서 제거 가슴 신중 하 게 스레드를 잡아 당겨 부드럽게 하는 동안 집게와 기도의 결합 조직을 뽑아야 합니다. 10% 포 르 말린 버퍼의 15 mL 50 mL 원뿔 튜브에 폐와 기관지를 놓습니다. 스레드 튜브 외부의 한쪽 끝을 배치 하 고 뚜껑을 봉인. 완전히 정착 액에 샘플 잠수함 튜브 반전.</li>
	<li>적어도 24 시간 또는 추가 처리 때까지 실 온에서 샘플을 저장 합니다. 주의: 포 르 말린은 유해. 고글, 얼굴 마스크 등 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 샘플을 처리할 때 화학 후드 작동 합니다.</li>
</ol>4. 수확 및 DNA 곰 팡이 부담에 대 한 마우스의 폐의 보존
<ol><li>별도 마우스에 위에서 설명한 단계 3.1-3.5를 수행 합니다.</li>
	<li>천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 10 mL와 함께 perfuse.</li>
	<li>가 위 폐를 소비 세와 레이블이 1.5 mL 튜브에.</li>
	<li>추가 처리까지-80 ° C에서 폐를 저장 합니다.</li>
	<li>(포함 및 단면)에 설명 된 대로, 제조업체의 프로토콜 ( 재료의 표참조)에 따라 표준 기법을 사용 합니다.</li>
</ol>5. 현미경 및 이미징
<ol><li>이미징 정량화 프로그램 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>가벼운 현미경을 사용 하 여, 슬라이드 (10 X 목표) 스테인드 GMS의 4 가지 분야를 얻을. 이미지 비슷한 조직 밀도와 폐 내의 감염 된 항공의 대표 인지 확인 합니다. 참고: 밀도 및 hyphal foci의 유통 제어 및 실험 그룹 사이 현저 하 게 다른 경우, 추가 필드 촬영 될 수 있습니다, 또는 전체 폐 섹션의 GMS 지역 몇 군데 있습니다 (4 X 목표). 원하는 경우 hematoxylin와 오신, 스테인드 직렬 폐 섹션에 (동등한 조직 형태 식별) 폐의 같은 영역에의 이미지를 얻을.</li>
	<li>필요한 경우 이미지에 눈금 막대를 추가 하 고 측정할 수에 이미지를 저장. 선택, 편집 &gt; 추가/편집 교정 표시 &gt; 메뉴: 선 두께, 색상 및 스케일 바 크기 선택 &gt; 눈금 막대 배치 하는 대 한 이미지를 클릭 하십시오. 메뉴를 닫고 선택, 편집 &gt; 병합 &gt; 교정 표시 병합 &gt; 파일 이름으로 저장 선택 &gt; 파일의 이름을 지정 하 고 클릭 저장.</li>
</ol>6. 곰 팡이 부담 (그림 3)를 계산 하는 이미지 처리 프로그램을 사용 하
<ol><li>이미지 처리 프로그램을 엽니다. 파일을 선택 &gt; 계량 샘플 폴더 &gt; 이미지 (그림 3A). 이미지 선택 &gt; 형식 &gt; 변환 "RGB 스택" (그림 3B).</li>
	<li>3 주어진된 이미지 (그림 3B)의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. "컨트롤 + 교체 + T"를 명 중을 "임계값" 메뉴 설정 조절기 (그림 3C). 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 이미지 보기 프로그램 (그림 3C)와 열.</li>
	<li>왼쪽에 있는 모든 방법을 위쪽 슬라이더를 당겨와 (red)에 선택 영역 (일반적으로 이르기까지 130-160에서 슬라이더 (그림 3C)의 오른쪽에 표시 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정.</li>
	<li>일단 선택, 눌러 "설정" &gt; "확인" (그림 3D). "분석"을 선택 &gt; "측정 설정" &gt; "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 &gt; "확인" (그림 3D).</li>
	<li>공백 또는 배경 얼룩의 중요 한 영역 선택 영역이 나 다각형 도구로 적절 한 조직에 의해 제외 될 수 있습니다.</li>
	<li>마지막으로, "분석"을 선택 &gt; "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 탭 표시, "결과" 표시 됩니다) (그림 3E). 그래프를 위한 데이터 분석 프로그램을 데이터를 전송 및 통계 분석.</li>
	<li>각 폐 샘플에 대 한 4 개의 영역 비율의 평균을 입력 합니다. 5-8 샘플 그룹 간의 중요 한 차이 검출 하기 위하여 일반적으로 충분 하다. 두 실험 그룹을 비교 하는 경우 수행 하는 짝이 없는 학생의 t-의미를 확인 하려면 테스트.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig3.jpg"> 그림 3: GMS 조직학의 각 단계에 대 한 대표 스크린샷 필드 정량화. (A) 파일 선택 &gt; 계량 샘플 폴더 &gt; 선택 이미지. (B)을 선택 이미지 &gt; 형식 &gt; "RGB 스택" 변환. 3 주어진된 이미지의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. (C) 히트 "컨트롤 + 교체 + T" "임계값" 메뉴 설정 조절기를가지고. 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 사진 뷰어 프로그램으로 열기. 모든 방법은 왼쪽과 (red)에 선택 영역 (일반적으로에서 이르기까지 130-160으로 슬라이더의 오른쪽에 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정 가기 슬라이더를 당겨. (D) 선택 된 언론 "설정" &gt; "확인". "분석"을 선택 &gt; "측정 설정" &gt; "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 &gt; "확인". (E) "마지막으로 선택 분석" &gt; "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 있는 탭 "결과" 레이블이 표시 됩니다). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
7. DNA 곰 팡이 부담
<ol><li>-80 ° C에서 폐를 제거 하 고 적어도 4 h lyophilize (하룻밤 최적입니다) 또는 동결 건조 시스템에 의해 완전히 건조 될 때까지.</li>
	<li>폐를 건조 하는 동안 DNA 추출 버퍼 (0.1 m M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0 및 0.5 %SDS)를 준비.</li>
	<li>미리 따뜻하게 60 ° C 물 욕조에 준비 된 DNA 추출 버퍼를 놓습니다. 또한, 페 놀 장소: 클로 프롬: isoamyl 알콜 50 mL 원뿔 튜브에서 (25:24:1) 분리에 대 한 허용.</li>
	<li>유리 구슬의 0.2 mL 2 mL 스크류 캡 튜브에 동결 건조 된 폐를 놓습니다. 그것은 정밀한 분말을 형성 될 때까지 15-30에 대 한 건조 폐 조직 갈기 구슬 때리는 사용 하 여.</li>
	<li>각 튜브와 소용돌이를 0.8 mL 따뜻한 DNA 추출 버퍼를 잘 추가 합니다. 추가 15 분 동안 잠복기 전에 각 튜브 65 ° C 비드 목욕 그리고 소용돌이에서 15 분을 품 어. 잠복기, 후 소용돌이 그리고 원심 분리기 튜브 25000 x g 10 분에 합니다.</li>
	<li>각 샘플에 대 한 1.5 mL 튜브의 3 세트를 분류 하 고 튜브의 1 세트에는 상쾌한의 상위 계층을 전송. 수성 상위 레이어 밖으로 pipetting 동안 주의 사용 하 여 중간 계층을 방해 하지 않도록.</li>
	<li>페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘 혼합. 다음 상위 레이어 밖으로 튜브의 두 번째 세트에 pipetting 전에 15 분에 대 한 25000 x g에서 원심.</li>
	<li>클로 프롬: isoamyl 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘, 튜브의 3 세트에 10 분 신중 하 게 상위 레이어 밖으로 피 펫에 대 한 25000 x g에서 원심.</li>
	<li>추가 500 µ L 소 프로 파 놀의 50 µ L NaoAc (pH 5.2), 잘, 그리고 샘플 10 분 동안 실내 온도에 알을 품을 수 있도록. 다음 30 분 동안 25000 x g에서 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>25000 x g. Decant 에탄올에서 얼음 찬 70% 에탄올과 5 분 원심 분리기의 750 µ L로 DNA 펠 릿을 세척 하 고 40 분 동안 증기 두건에 튜브에 공기를 펠 릿 건조 허용.</li>
	<li>건조 알 약 테 버퍼의 300 µ L에서 resuspend. 참고: DNA 정량까지-20 ° C에서 저장 수 있습니다.</li>
	<li>DNA는 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량 및 정량 분석에 대 한 각 DNA 샘플의 µ 0.2 µ g/L의 100 µ L를 준비.</li>
	<li>3 중 1 µ g의 DNA 샘플, 곰 팡이 18S rDNA 입문서와 함께 앞에서 설명한 표준 정량 수행 하 고 수정 된 프로브 끄는 프로브 세트 (5'-/ 56-팸/AGC CAG CGG/선/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ')12,13.</li>
	<li>A. fumigatus genomic DNA에서 표준 곡선을 준비 하 고 각 페이지에 곰 팡이 DNA의 농도 계산 평균 기자를 사용 하 여 샘플 염색 Ct 값.</li>
	<li>플롯은 pg / µ g 균 DNA의 뜻의 표준 오류와 함께. 수행 하는 학생의 t-테스트 의미를 결정 하는 분석. 참고:으로 덜 독성 대안을 여기서 페 놀-클로 프롬 DNA 추출, 열 기반 DNA 추출 키트를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이 문서의 목적은 이미지 분석 및 정량화에 대 한 GMS 스테인드 폐 조직학 단면도 이용 하 여 IA와 쥐에 폐 버섯 모양 부담의 결심을 위한 방법을 소개 했다. 이 연구, 치료에에서 β-글 루 칸-합성-대상으로 항진균 약물 caspofungin14 개선 하지 않은 생존 또는 IA8neutropenic 야생-타입 마우스에 곰 팡이 부담. 그러나, 호 산 구는 γ T 세포의 부재, 생존 및 곰 팡이 부담 개선. 우리의 연구 결과 또한 널리 이용 균 DNA 정량 방법6에 비해 GMS 곰 팡이 부담 하 여 비교 결과 얻을 수 있습니다 설명 했다.
GMS 곰 팡이 부담 정량화를 활용 하 여 여러 가지 혜택을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 프로세스 따라서 잠재적으로 상당한 차이 확인 하는 데 필요한 실험의 수를 줄이고 기존 조직학 샘플 활용 수 있습니다. 둘째, 본이 연구에서는 적은 동물 GMS 곰 팡이 부담 정량화 (그림 6, 그림 7) 곰 팡이 DNA의 정량에 비해 상당한 차이 달성 하기 위해 필요 했다. 셋째, 정량 하 여 다른 격리에 곰 팡이 부담 비교 ribosomal DNA 복사 번호15에 격리 종속 차이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 반면, GMS 정량화는 영향을 받지 복사본 수로 곰 팡이 부담 폐 곰 팡이 성장의 상대적 수준에 의해 결정 됩니다. 따라서, 곰 팡이 부담에 대 한 GMS 정량화를 사용 하 여 척 추가 있는 동물의 사용 줄이고 rDNA 복사 번호의 사전 결정을 필요 하지 않습니다. 마지막으로, 곰 팡이 형태를 수정 하는 것 외에도 caspofungin 치료 곰 팡이 조각화, 증가 하 고 따라서 인위적으로 증가 시킬 수 있습니다 폐 homogenates12,16에서에서 콜로 니 형성 단위의 절연 측정 때 곰 팡이 부담 ,17. 따라서, 곰 팡이 부담 GMS 정량화 다른 일반적으로 사용 되는 방법으로 몇 가지 제한 내재를 방지합니다.
그러나, GMS 정량화 그리고/또한이 연구의 한계는 중요 한 것. 첫째, 저자 각 실험 그룹의 폐에 걸쳐 hyphal 성장의 유사한 분포를 가정 하 고 따라서 4 대표 10에서에서 정량화 객관적인 필드 x으로 사용 대표적인 측정 전체 폐에 곰 팡이 부담에 대 한 (그림 6B)입니다. 그 어떤 경우에 상대 분포, 크기 및 밀도 hyphal foci의 충분히 다 곰 팡이 부담 정량 메서드에서이 메서드 및 해당 다른 표시는 가능 하다. 그러나, 우리의 추가 결과 4 X 객관적인 필드를 사용 하 여 전체 폐 섹션 정량화를 비슷한, 그룹 (그림 6 c) 간의 통계적으로 유의 한 차이 이기는 하지만 덜 보였다. 이 부 량의 표준 오차는이 전략, 목표 및 차선 분야에서 증가 배경 4 감소 hyphal 해상도 때문에 가능성이 증가 되었다. 따라서, 더 높은 확대에 적은 분야의 대표적인 부 량이 좋습니다. 둘째, 단일, 중앙 섹션은 각 샘플에 사용 됩니다. 그것은 가능한, 곰 팡이 분리에 따라 또는 쥐 종자 사용, 일부 연구 hyphal 성장의 고르지 못한 배급에 발생할 수 있습니다. 그 경우에 각 파라핀 블록에 걸쳐 추가 섹션 더 대표 부담을 정량 한다. 셋째, 실험에는 상당한 생산 (즉, 측정 알레르기 bronchopulmonary aspergillosis (ABPA)18 또는 낭 성 섬유 증 (CF)18에 곰 팡이 성장 기도), mucins의와 GMS 반응성 유도 다 당 류-풍부한 mucins19 일반적인 GMS + 결과 하 고 따라서 높은 균 부담에 찬성 하 여 몇 가지 샘플을 기울일 수 있습니다. IA의 neutropenic 모델을만이 연구에 사용 되었다, 다른 면역 능력 또는 진압 모델의 사용 덜 비교 결과에 결과 수 가능 하다. 이러한 경고에도 불구 하 고 GMS 정량화 곰 팡이 부담을 결정 하는 유사한 기술 하며 추가 연구에 지속적인된 사용 유틸리티 일관성, 신뢰성, 그리고 비용 효과적으로이 방법의 유효성을 검사 추가 수 있습니다.

IA 면역 진압 치료 또는 만성 감염1,2선 천 적 또는 후 천 적인 면역 결핍과 취약 개인에 개발할 수 있는 기회 감염 이다. 1 차 감염 자주 폐, 간, 신장, 심장, Aspergillus fumigatus 의 일부 인스턴스 배포에서 발생 하 고 뇌를 심각한 질병 그리고 높은 함께 균의 광범위 한 조직 내 습의 결과로 발생할 수 있습니다. 사망률1,2의 속도. 또한, 기존 pharmacotherapies의 효능 제한, 그리고 환경3항진균-저항 하는 긴장의 출현에 의해 더 약화 될 수 있습니다. 그것은 그러므로 침략 버섯 모양 질병의 악화 또는 개발을 촉진 하는 곰 팡이 독성 및 병 리의 메커니즘을 이해 하는 것이 중요입니다.
그들은 곰 팡이 독성 유전자의 역할을 평가 하 고 설립과 A. fumigatus vivo에서4,5의 성장에 대 한 면역 이펙터를 호스트 하는 연구자 수 murine 모델 기계적 아이오와 연구에 대 한 중요 한 유지. 따라서, 여러 전략 효과적으로 계량 하거나 비교 실험 동물6,7의 그룹에 게 선 부담 고안 되었습니다. 이러한 전략 문화 기반, 생화학, immunoassay, 또는 정량 방법, 각각 고유한 장점과 단점을 포함 한다. 또한, 이러한 메서드의 각 면역 effector 기능, 유전자 표정 분석 및 비교 histopathology7의 평가 대 한 희생 뿐 아니라 동물의 부분 집합의 헌신을 포함. 따라서, 포괄적인 IA 연구는 종종 상당한 비용 연구 동물의 많은 수를 필요로합니다. 동물의 조직 여러 분석을 이용 하 여 실험 시간, 동물 비용, 및 윤리적인 고려 사항 감소 효과적인 전략은 따라서 매우 귀중 한7.
이 보고서에서 GMS IA와 쥐의 실험적인 그룹 간의 상대 곰 팡이의 비교를 위해 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화를 설명 하는 방법 소개. 곰 팡이 문화에서 감염, 조직 수확 및 처리, 이미지 수집 및 데이터 분석, 각 단계는 자세히 설명 되어 있습니다. 곰 팡이 부담 GMS 정량화 하 여 얻은 정량 IA의 neutropenic 모델에서 그리고 IA8caspofungin 처리 야생-타입 또는 eosinophil 불충분 한 쥐에 비교 되었다. 결과 GMS 정량화와 곰 팡이 DNA의 정량 유사성을 보여. 이것은 GMS 정량화 상대 균 부담 IA와 쥐의 비교의 보조 또는 대체 방법으로 조직학 분석에 종사 하는 연구원에 게 유용 하 고 궁극적으로 비용 및 연구에 있는 동물의 사용을 줄일 수 있습니다. 복잡 한, 기계 연구입니다.

<table><tbody><tr><td>Aspergillus fumigatus 293 재고 솔루션</td><td>곰팡이 유전학 재고 센터</td><td>FGSC #A1100</td><td></td></tr><tr><td>HyPure 세포 배양 등급 물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>말트 추출물</td><td>MP Biomedicals</td><td>2155315</td><td>백색 분말</td></tr><tr><td>BD&nbsp; BBL Acidicase 탈수 배양 매체 : 펩톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>L11843</td><td></td></tr><tr><td>포도당 (D-포도당) 무수 (과립 분말 / 인증 ACS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 한천, 분말 / 플레이크, Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>자동 건조 캐비닛</td><td>Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co., LTD</td><td>HSFC160FD</td><td></td></tr><tr><td>1300 시리즈 Class II, Type A2 생물 안전 캐비닛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>0.5mm 유리 구슬</td><td>BioSpec 제품</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher Scientific</td><td># 0267110</td><td></td></tr><tr><td>Leica 모델 DME 현미경</td><td>Leica</td><td>13595XXX</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's 인산염 버퍼 식염</td>수 <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td># 05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; 주사기 바늘, 게이지 27, L 1/2 in.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192384</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse-Ly-6G 항체</td><td>BioXCell</td><td>BP0075-1</td><td>클론 1A8</td></tr><tr><td>Caspofungin diacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>1169567762</td><td></td></tr><tr><td>Non-Rebreathing Table Top 수의학 마취 기계</td><td>Supera Anesthesia Innovations</td><td>M3000</td><td></td></tr><tr><td>Pureline 산소 농축기</td><td>Supera Anesthesia Innovations</td><td>OC8000</td><td></td></tr><tr><td>슬랜트 보드 구속</td><td>인디애나 주립 대학 시설 관리</td><td>맞춤 제작</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; PIPETMAN Classic 200 ml Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>일반용 넓은 팁 펜치</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 표준 해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 범용 곡선 펜치</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올-200 증명</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 흡수식 언더패드</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-63</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; 주사기 바늘, 게이지 25, L 1 in.</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z192406</td><td></td></tr><tr><td>All-Plastic Norm-Ject 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-30</td><td></td></tr><tr><td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9742754</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 용액, 중성 완충, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon 내장 카세트 II 튜브 팩</td><td>Fisher Scientific</td><td>B1000729</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest&nbsp; Histoplast 파라핀 왁스</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>일회용 베이스 몰드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Jung Histocut 820 Microtome</td><td>Labequip.com</td><td>31930</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Precision Scientific</td><td>66630-23</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>116875H</td><td></td></tr><tr><td>은 얼룩 ( 수정된 GMS) 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT100A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린 FCF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC410530250</td><td></td></tr><tr><td>프로스트 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Superslip 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-89</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 프로비스 AX70 현미경</td><td>올림푸스</td><td>올림푸스 AX70</td><td></td></tr><tr><td>U-PHOTO 범용 포토 시스템</td><td>올림푸스</td><td>OLYMPUS-U-PHOTO</td><td></td></tr><tr><td>U-MCB-2 멀티 컨트롤 박스</td><td>올림푸스</td><td>OLYMPUS-U-MCB-2</td><td></td></tr><tr><td>U-PS 전원 공급 장치</td><td>올림푸스</td><td>OLYMPUS-U-PS</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 1리터 벤치탑 동결 건조 시스템</td><td>LABCONCO</td><td>7740020</td><td></td></tr><tr><td>맥시마 C&nbsp; 플러스&nbsp; 진공 펌프</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-257-80</td><td>변위- 6.1 cfm</td></tr><tr><td>1-부탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-4</td><td></td></tr><tr><td>AMRESCO&nbsp; 페놀-클로르포름-오소아밀 100ML&nbsp; DFS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9573988</td><td></td></tr><tr><td>스크류 캡이 있는 독립형 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-24</td><td>BioSpec 제품</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM 지르코니아 비드</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0451999</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (백색 결정 또는 결정성 분말/ 분자생물학)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>염산, ACS 플러스 인증</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산, 디소듐 염 이수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨 (SDS), 백색 분말, 전기영동</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름/이소아밀 알코올 24:1</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>Biotek Epoch 마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>11-120-570</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; ABsolute Blue qPCR 믹스</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB4137A</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 프로브, 5&prime;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&prime;</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>감지 증폭 프라이머, 5&prime;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&prime;</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>안티센스 증폭 프라이머, 5&prime;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&prime;</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>응용 바이오시스템&무역; 마이크로앰프&트레이드; 광학 8-튜브 스트립, 0.2mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>43-165-67</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; 돔형 및 평면 PCR 캡 스트립</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0386</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR 시스템, 110 볼트</td><td>Agilent</td><td>401443</td><td>Stratagene은 현재 Agilent</td></tr><tr><td>BALB/c 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 (B6) 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Eosinophil-deficient (&Delta; dblGATA, BALB/c 배경) 생쥐</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005653</td><td></td></tr><tr><td>&gamma; &델타; T 세포 결핍 (TCR&delta;-/-, B6 background) 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002120</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>N</td><td>/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Spot Advanced Software</td><td>Spot Imaging</td><td>SPOT53A</td><td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td></tr> <tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>해당</td> <td>없음https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>Fisherbrand 흡수성 언더패드</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>단계 4.5</td><td></td><td></td><td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td></tr></tbody></table>

조직학 정량화 폐 실험 aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

폐 균 부담의 정량화는 면역 보호 및 폐 곰 팡이 감염의 마우스 모델에서 곰 팡이 독성의 상대적 수준의 결정에 대 한 중요 합니다. 여러 메서드는 곰 팡이 부담을 평가 하는 데 사용 됩니다, 하지만 곰 팡이 DNA의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 이전 문화 기반 방법에 비해 여러 가지 장점 가진 기술로 떠오르고 있다. 현재, 폐 병 리, 백혈구 신규 모집, 곰 팡이 부담, 및 침략 aspergillosis (IA)와 쥐에 유전자 발현의 포괄적인 평가 실험의 뜻깊은 수 및 제어 동물의 사용을 필요로합니다. 여기 폐 조직학 동물의 감소 된 수를 사용 하 여 곰 팡이 부담을 결정 하기 위해 얼룩의 정량화는 자세히 시험 되었다. 폐 섹션 Gomori의 수정된 methanamine 실버 (GMS) 얼룩 곰 팡이 구조를 규명 얼룩이 있었다. 이미지는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 폐 각의 4 개의 개별 분야에서 GMS 스테인드 섹션에서 촬영 됐다. 각 이미지 내의 영역을 스테인드 GMS는 이미지 분석 프로그램을 사용 하 여 계량 했다 그리고이 정량화에서 스테인드 영역의 평균 백분율은 각 샘플에 대 한 결정 했다. 이 전략을 사용 하 여, 전시 eosinophil 불충분 한 쥐 감소 곰 팡이 부담 및 caspofungin 치료, 질병 동안 아이오와 야생-타입 마우스 caspofungin와 함께 개선 되지 않았다. 마찬가지로, 마우스 γ T 세포 부족에 곰 팡이 부담 했다 또한 향상 caspofungin, 정량 및 GMS 정량화로 측정 된. 따라서 GMS 정량화 상대 폐 균 부담 궁극적으로 침략 aspergillosis의 포괄적인 연구에 필요한 실험 동물의 수량을 줄일 수 있는 결정을 위한 방법으로 도입 되었습니다.

그림 4 는 야생 타입의 생존의 그래프를 포함 또는 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 caspofungin 치료. 결과 표시 eosinophil 불충분 한 쥐는 증가 생존 야생-타입 마우스에 비해 전시 (50% 사망률 100% 사망, 대 각각). 그림 5 는 neutropenic에서 얼룩이 지기 대표 GMS 야생-타입 및 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 취급 또는 caspofungin와 치료. Caspofungin 치료 결과 eosinophil 불충분 한, 하지만 아니 야생-타입 마우스 (오른쪽 패널)에 상대 균 클리어런스, 받지 못한 두 그룹이 caspofungin 비슷한 (왼쪽된 패널). 그림 6 caspofungin 치료에 곰 팡이 부담 비교를 보여줍니다 치료 야생-타입 또는 eosinophil 결핍 마우스를 제어, 균 DNA (그림 6A) 및 대표 GMS의 두 정량 Pcr를 사용 하 여 4 (10 X 목표)의 정량화 (필드 그림 6B)입니다. 두 기술에서 생성 된 결과 caspofungin 치료 결과에 가장 중요 한 곰 팡이 부담 야생-타입 및 eosinophil 불충분 한 쥐 (그림 6A) 사이 감소 보여. 그러나, 치료 쥐만 GMS 정량화 호 산 구는 (그림 6B) 부족 한 쥐에 있는 상당한 감소 결과. 전체 폐 GMS 스테인드 섹션의 의미 영역 계산 때 (4 X 목표), 차이 했다 4 대표 10 필드가, 얻은 결과 유사 하지만 덜 통계적 의미 (그림 6 c). 그림 7 보여줍니다 생존, 대표 GMS 얼룩 (4 10 X 필드)의 이미지와 곰 팡이 부담 정량화 두 방법으로 γ T 세포 결핍 (TCRδKO) 마우스를 제어에 비해 caspofungin로 치료 했다, 쥐를 치료. Caspofungin 치료 향상 된 생존 (그림 7A) 및 TCRδKO 마우스에 곰 팡이 부담 (그림 7B-D). 그림 6의 결과 마찬가지로, 버섯 모양 부담의 결과 GMS 정량화 (그림 ℃) 정량 (그림 7B) 및 대표에 의해 측정 했다 비교.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> 그림 4: caspofungin와 치료 후 아이오와 eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA) 쥐에 있는 생존을 증가 했다. 15-30 쥐/그룹입니다. 3-6 실험의 요약입니다. p &lt; 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> 그림 5: 야생-타입, eosinophil 결핍, 및 caspofungin 처리 또는 컨트롤에서 GMS 스테인드 폐 섹션의 대표 이미지 치료 아이오와에 있는 쥐 3-4 쥐/그룹의 대표적인입니다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> 그림 6: 야생-타입에 곰 팡이 부담, eosinophil 불충분 한 쥐 취급 하는 IA 또는 제어 치료 caspofungin. (A) 곰 팡이 DNA의 정량. 15-30 쥐/그룹, 3-6 실험의 요약. (B) GMS의 정량화 조직학 단면도, GMS 4 필드 (10 x 목표)에서 얼룩의 평균 %. (C) GMS 정량화, 전체 폐 섹션 (4 X 목표)의 평균 % B와 C 5 쥐/그룹의 요약입니다. p &lt; 0.05입니다. p &lt; 0.001입니다. p &lt; 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 보고 된 데이터를 사용 하 여 생성 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> 그림 7: caspofungin 치료 후 γ T 세포 불충분 한 쥐에 있는 IA의 심각도 감소. (A)의 생존 (B) 곰 팡이 DNA의 정량. (C) GMS 조직학의 정량화. (D) IA, 치료 또는 치료와 함께 caspofungin와 γ T 세포에서 GMS 스테인드 섹션의 대표 이미지. A와 B는 7-10 쥐/그룹 두 실험의 요약. C와 D 4 쥐/그룹의 요약입니다. p &lt; 0.05입니다. p &lt; 0.01입니다. p &lt; 0.001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 조직학적 분석을 통해 침습성 아스페르길루스증이 있는 마우스의 폐 진균 부담을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 곰팡이 발병 기전 분야에서 보호 및 해로운 숙주 반응 메커니즘과 주요 곰팡이 독성 요인에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 조직학적 샘플을 사용하여 폐 진균 DNA의 정량적 PCR 적용과 유사한 결과로 진균 부담을 얻을 수 있다는 것입니다.이 방법은 침습성 아스페르길루스증에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 숙주 조직 내에서 병원체를 차별적으로 염색할 수 있는 다른 질병 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 DNA 정량적 방법보다 변동성이 적은 폐 진균 부담을 정량화하는 대체 방법을 생각하기 시작했을 때 처음 떠올랐습니다. 감염 및 채취 절차를 시연하는 것은 연구 기술자인 Angar Tsoggeral이 맡을 것입니다.감염 24시간 전, 각 동물의 측면 우측 하단 사분면에 복강내에서 45도 각도로 전달된 멸균 식염수에 0.5mg의 항 마우스 Ly-6G 항체를 투여한 각 실험용 7-10주 생쥐의 호중구를 고갈시키고 마우스를 케이지로 되돌립니다. 다음 날 아침, 0.5mm 유리 구슬 1.5g을 A.fumigatus conidia 배양 플레이트에 붓고 구슬이 곰팡이로 코팅될 때까지 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 기울입니다. 분생포자 코팅된 비드 혼합물을 15ml 원뿔형 튜브에 모으고 5ml의 DPBS에 비드를 현탁시킵니다.구슬을 소용돌이쳐 곰팡이에서 분리하고 혈구계에서 상층액을 50배 희석하여 분생포자를 계산합니다. 분생포자를 DPBS 농도 10의 8번째 분생분자로 1배로 희석하고 마우스당 50마이크로리터의 분생자 용액을 개별 마이크로피펫에 로드합니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후, 첫 번째 마취된 마우스를 누운 자세로 비스듬한 보드에 놓고 위쪽 앞니는 고무 밴드로, 아래쪽 앞니는 금속 와이어로 부드럽게 고정합니다.그런 다음 작은 집게를 사용하여 혀를 조심스럽게 완전히 펴고 50마이크로리터의 분생포자 용액을 혀 바닥에 전달합니다. 혀를 완전히 펴고 20초 동안 또는 서스펜션이 완전히 흡인될 때까지 빠른 호흡과 흡인의 뚜렷한 딸깍 소리에 귀를 기울입니다. 그런 다음 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 마우스를 케이지로 부드럽게 되돌리고 다음 동물을 감염시킵니다.모든 쥐가 감염되면 동물의 하위 집합에 항진균제를 주입하고 감염 후 24시간 동안 모든 동물에서 호중구 고갈을 반복합니다. 곰팡이를 투여한 지 3일 후, 흡수 패드로 덮인 폼 보드에 첫 번째 마우스를 누운 자세로 놓습니다. 발가락 꼬집기로 쥐를 안락사시키고 70% 에탄올로 머리카락을 소독합니다.팔다리를 고정한 후 가위를 사용하여 흉곽 위쪽을 조심스럽게 열고 흉곽을 잘라내어 폐와 심장을 노출시킵니다. 다른 혈관을 절단하거나 장기에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 심장에서 내려오는 하대정맥을 절개하고, 25게이지 바늘이 장착된 5ml 주사기를 45도 각도로 잡고 5ml의 차가운 DPBS를 심장의 우심실로 천천히 관류합니다. 같은 방법으로 10%포르말린 5ml를 관류한 후 기관을 조심스럽게 노출시키고 기관에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 주변 지방 패드를 분리합니다.집게로 노출된 기관을 들어 올리고 25게이지 바늘을 사용하여 상부 기관에 구멍을 뚫습니다. 구멍을 통해 캐뉼라를 폐 쪽으로 조심스럽게 삽입하고 기관 주위에 수술 실을 느슨하게 묶어 캐뉼라를 고정합니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 캐뉼라를 통해 1밀리리터의 10% 포르말린 완충액으로 폐를 팽창시키고 빠르지만 조심스럽게 캐뉼라를 제거합니다.수술 실을 조여 기관을 밀봉하고 실을 부드럽게 당겨 결합 조직을 분리하여 폐와 기관을 적출할 수 있습니다. 15ml의 10% 포르말린 완충액이 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 조직을 넣고 실의 한쪽 끝이 튜브 바깥쪽에 있도록 합니다. 그런 다음 캡을 밀봉하고 튜브를 뒤집어 샘플과 정착액을 최소 24시간 동안 완전히 담그십시오.수확된 조직을 이미지화하려면 먼저 적절한 이미징 정량화 프로그램을 열고 광학 현미경을 사용하여 10X 대물렌즈 아래에서 각 Gomori의 변형된 메탄아민 실버 또는 GMS 염색 슬라이드의 최소 4개의 뚜렷한 필드를 얻습니다. 이미지가 폐 내의 감염된 기도를 대표하고 유사한 조직 밀도를 나타내는지 확인합니다. 이미지에 축척 막대를 추가하려면 편집 메뉴에서 보정 마크 추가/편집을 선택하고 선 두께, 색상 및 축척 막대 크기를 선택합니다.스케일 바가 배치될 이미지를 클릭한 다음 편집 메뉴를 열고 Merge and Merge Calibration Marks를 선택하여 각 이미지에 스케일 바를 추가하고 이미지를 적절한 실험 그룹 폴더에 저장합니다. 각 동물의 곰팡이 부담을 계산하려면 적절한 이미지 처리 프로그램을 열고 이미지의 첫 번째 폴더를 엽니다. 이미지 메뉴에서 유형 및 RGB 스택을 선택하여 이미지를 변환합니다.오른쪽 화살표 키를 사용하여 세 이미지 중 두 번째 이미지를 선택하고 Control-Shift-T를 눌러 임계값 메뉴 설정 조정자를 엽니다. 원본 tiff 또는 jpg 이미지를 참조로 찾고 이미지 보기 프로그램으로 이미지를 엽니다. 임계값을 선택할 때 선택한 영역이 곰팡이 균사를 대표하고 샘플 간의 일관성을 보장할 수 있도록 원본 이미지를 볼 수 있는 것이 중요합니다.상단 슬라이더를 왼쪽 끝까지 이동하고 선택한 빨간색 영역이 현미경 이미지를 나타낼 때까지 하단 슬라이더를 조정합니다. Set and OK(확인)를 클릭하고 Analyze(분석) 및 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역), Area fraction(면적 분수), Limit to threshold(임계값 제한), Display label(레이블 표시)을 선택하고 하단 설정은 기본값으로 둡니다. OK(확인)를 클릭하고 Analyze and Measure(분석 및 측정)를 선택합니다.결과가 나타나야 합니다. 그런 다음 그래프 작성 및 통계 분석을 위해 데이터를 데이터 분석 프로그램으로 내보내고 각 폐 샘플에 대한 4개 이상의 면적 백분율의 평균을 입력합니다. 이 대표적인 생존율 그래프에서 알 수 있듯이, 감염 후 항진균제로 치료받은 침습성 아스페르길루스증을 앓고 있는 호산구 결핍 마우스는 야생형 동물에 비해 생존율이 높았습니다.침습성 아스페르길루스증이 있는 호중구 감소성 야생형 및 호산구 결핍 마우스에서 추출한 대표적인 GMS 염색은 항진균 처리 마우스에서 항진균 처리 유무에 관계없이 야생형 동물에서 왕복 반응되지 않는 항진균 처리된 녹아웃 마우스에서 거의 완전한 진균 제거를 보여줍니다. 또한, 방금 시연된 바와 같이 정량적 PCR 및 수동 광학 현미경 GMS 정량화는 모두 항진균제 처리가 야생형 마우스와 호산구 결핍 마우스 사이에서 가장 큰 곰팡이 부담 감소를 초래한다는 것을 확인합니다. 그러나 처리되지 않은 마우스에서는 GMS 정량화만이 이 실험에서 호산구 결핍 마우스의 현저한 감소를 확인했습니다.전체 폐 GMS 염색 절편의 평균 면적을 4X 배율로 계산할 때, 통계적 유의성은 적지만 4개의 대표 10X 필드로 얻은 결과와 차이가 유사합니다. 유사한 생존율, 진균 부담 및 진균 제거 결과는 동일한 항진균제로 처리된 감마-델타 T 세포 결핍 마우스에서도 관찰됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 조직학적 단면의 사진을 찍을 때와 비교 가능한 결과를 얻기 위해 임계값을 조정할 때 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 표적 염색과 배경 염색 사이에 명확한 차이가 있는 샘플의 조직학적 분석을 포함하는 다른 방법을 수행하여 폐 및 기타 조직의 질병 병리학과 관련된 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 비자발적 흡인으로 쥐를 진균 분생포자에 감염시키는 방법과 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 폐 조직 절편에서 진균 성장을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. Aspergillus fumigatus 및 Gomori의 변형 된 메탄아민 실버 염색으로 작업하는 것은 위험 할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비를 착용하고 통풍이 잘되는 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 그들이 병원균을 phagocytose 또는 호중구 세포 트랩 (그물) 생성하는 동안 감염된 폐의 호중구 granulocytes의 역학의 관​​찰에 대한 2 광자 현미경을 사용하는 방법, 표시합니다.

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

종자 - 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

이 비디오는 제브라피시 유충의 곰팡이 감염을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 곰팡이 포자는 유충 후뇌실에 미세 주입되고 유충은 감염이 발생할 수 있도록 배양됩니다. 감염된 유충은 정의된 간격으로 수확되며, 군집 형성 단위를 열거하여 감염 진행 상황을 평가합니다.

제브라피시 유충의 곰팡이 감염을 정량화하는 기술

이 비디오는 인간 백혈구에 의한 FITC 표지 병원성 진균 포자의 식세포작용을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 식세포작용된 포자는 counterstaining을 통해 세포 부착 포자에서 식별한 후 유세포 분석을 수행합니다.

인간 식세포에 의한 Fungal Spore Phagocytosis의 정량적 유세포 분석 측정

공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

이 프로토콜은 유세포측정법을 사용하여 인간 1차 식세포에 의한 아스퍼질러스 훈증의 식세포증을 정량적으로 측정하고 단순한 유착에서 백혈구로의 식세포증을 구별하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정

이 프로토콜은 제브라피시 애벌레에 있는 Aspergillus 감염 모형을 기술합니다. 아스퍼질러스 포자는 유충의 뒷뇌에 마이크로인주사를 주입하고, 화학적 치료는 면역억제를 유도하는 데 사용된다. 감염 진행은 곰팡이 성장과 면역 반응을 모니터링하기 위해 매일 이미징 설정을 통해 모니터링될 뿐만 아니라 식민지 형성 단위 도금에 의한 살아있는 포자의 열거를 모니터링합니다.

호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

우리는 마우스의 기도에서 아스퍼질러스 퓨미가투스 코니디아 (크기 3 μm)의 분포의 정량적 분석을위한 방법을 설명합니다. 또한 이 방법은 다양한 병리학적 상태 모델에서 기도내의 미세입자 및 나노입자 응집 분포의 분석에 사용될 수 있다.

전체 마운트 광학 클리어 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 현미경 기반 정량 분석

우리는 침수 된 문화와 고체 미디어 모두에서 필라멘트 곰팡이 A. nidulans의 성장 운동학을 캡처, 분석 및 정량화하기 위해 전송 된 빛 현미경 기술을 사용하여 라벨이없는 라이브 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있습니다.

라이브 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스 성장률의 정량적 분석

우리는 형광 현미경을 통한 분석을 위해 폐 기도에서 곰팡이 포자의 자연스러운 위치를 보존하는 곰팡이 발병 모델에 대한 방법을 제시합니다.

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

학습하세요 조직학 분석을 통해 침습성 아스페르길루스증 마우스의 폐 곰팡이 부담을 정량화하는 방법을. Gomori 은색 염색법을 활용하여 기존 샘플로 qPCR과 유사한 결과를 얻으면서 실험 동물 수를 줄일 수 있습니다.

조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

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