Name: 3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 배우세요 인간 세포를 이용한 3D 염증성 잇몸 조직 모델 구축 방법을. HaCaT 각질형성세포, 잇몸 섬유아세포, THP-1 대식세포를 공배양하여 상피와 진피층을 재현하고, 상처 치유와 조직 재생 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작품 지원 부분에서 일본 사회에 의해 과학 진흥 (JSP) 선진적인 과학 연구 (26861689 및 17 K 11813) 한다. 저자 나 다니엘 그린 씨 교정 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

이 프로토콜은 인간의 gingival 조직 등가물, gingival 상처 모델 및 치은 염 모델을 만들 하도록 설계 되었습니다. 인간의 피부 상피 keratinocytes (HaCaT) 교수 노 버트 E. Fusenig 독일 Krebsforschungszentrum (하이 델 베르크, 독일)7의에서 친절 하 게 제공 되었다. 인간의 gingival 섬유 아 세포 (HGFs)8이전 게시 된 프로토콜 따라 gingival 조직에서 분리 했다. 미리 동의 얻어와 연구 윤리 위원회는 일본 치과 대학 학교 생활 치과의 도쿄에서 설정한 지침에 따라 승인 (승인 번호: NDU-T2012-35). 1-3 단계 프로토콜 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
1. 3D 인체 조직 등가물 Gingiva (GTE) (그림 1A)의 준비
<ol><li>10% 혼합 콜라겐 타입-A의 젤 집중 MEM-알파와 10% 재건 버퍼 (2.2 g NaHCO3 및 4.47 g HEPES 100 ml 0.05 N NaOH) pipetting으로 15 mL 무 균 튜브에. 사용 될 때까지 얼음에 혼합된 콜라겐 솔루션을 유지.</li>
	<li>24 잘 문화 삽입 (기 공 크기 3.0 µ m) 24-잘 접시에 놓습니다.</li>
	<li>
0.25% trypsin EDTA 용액을 사용 하 여 문화 표면에서 HGFs를 제거 합니다. 10 ml 문화 매체 A의 세포를 중단 (MEM-알파 + 20 %FBS + 1 %GlutaMAX). Bürker-터크 셀 카운터로 셀을 계산.
	<ol>
<li>셀 (1-5 x105 셀/mL), 원하는 수량을 추출 후 4 분 190 x g에서 원심.</li>
		<li>혼합된 콜라겐 솔루션에 셀을 일시 중단 합니다. 다음 단계까지 얼음에 혼합물을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 거품을 생산 하지 않고 문화 삽입으로 셀 콜라겐 혼합 (0.5-2.5 x 105 셀/잘) 0.5 mL를 추가 합니다. 젤에 혼합물을 응고를 37 ° C에서 5% CO2 습도 분위기에서 10-30 분을 위한 혼합물을 품 어. 참고:의 문화 삽입 되지 않도록 불평등 콜라겐 젤을 중심으로 콜라겐 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>잘 삽입으로 0.5 mL으로 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다. 24 h에 대 한 문화 접시를 품 어 또는 37 ° c.에 5% CO2 습도 분위기에서 하룻밤</li>
	<li>0.25% trypsin EDTA 용액을 사용 하 여 문화 표면에서 HaCaT 세포를 제거 합니다. 10 ml 매체 B의 셀을 일시 중단 (DMEM + 10 %FBS + 1 %GlutaMAX) 셀을 카운트. 추출 셀 (1-5 x5 셀/10ml) 피 펫, 190 x g.에서 4 분에 대 한 원심 분리기의 필요한 수량 중단 중간 b 세포</li>
	<li>열망 하 여 HGF 콜라겐 혼합물을 포함 하는 문화 삽입에서 매체를 제거 합니다. HGF 콜라겐 혼합 상단 HaCaT 세포 현 탁 액 (0.5-2.5 x 105 셀/잘) 0.5 mL를 추가 합니다. 24 시간 또는 하룻밤에 대 한 문화를 품 어. 참고:이 시간이 시점에서 문화에 매체 잘 해야 중간 A 문화 삽입에 중간 중간 B. 해야 하는 동안</li>
	<li>KSR 매체 (공동 문화 매체)와 문화 매체를 대체 (메모리 알파 + 15% 녹아웃 혈 청 교체 + 1 %GlutaMAX) + 5 %FBS. 잘 하 고 문화 삽입으로 0.5 mL 문화에 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다. 24-48 h에 대 한 문화를 품 어.</li>
	<li>KSR 매체 + 1% 문화 매체를 대체 FBS. 잘 문화에 1 mL 및 문화 삽입으로 0.5 mL를 추가 합니다. 24 시간 또는 하룻밤에 대 한 문화를 품 어.</li>
	<li>문화에서 문화 매체 0.7-1 잘 바꿉니다 mL KSR 매체. (문화 표면 공기에 노출 한다) 문화 삽입에서 매체를 완전히 제거 합니다. 1-2 주에 대 한 문화를 품 어. 일주일에 2 번 잘 문화에서 매체를 변경 합니다. 참고: (상위 레이어 구성 keratinocytes) 문화 표면 위의 중간 수준 상승을 못하게 합니다. 항상 문화 표면 건조 유지.</li>
</ol>2. 부상된 GTE (그림 1B)의 준비
<ol><li>1-3 m m 직경 조직 주먹을 준비 합니다. 20 분 동안 121 ° C에 압력솥으로 소독.</li>
	<li>밀어 조직 주먹 수직 GTE 300 µ m 깊이 대 한 그리고 상처를 시뮬레이션 하기 위해 조직에 구멍을 펀치.</li>
	<li>이 단계에서 부상된 GTE를 사용 하 여 상처 치유 및 조직 재생을 조사. 또는, GTE 조직학 분석을 수행 하기 위해 10% 포 르 말린 중립 버퍼 솔루션을 사용 하 여 수정 합니다.</li>
</ol>3. 염증 GTE (iGTE) (그림 1B)의 준비
<ol><li>이전 보고서9에 따르면 THP-1 세포 배양.</li>
	<li>10% 혼합 콜라겐 타입-A의 젤 집중 RPMI 1640, 10% 재건 버퍼 (2.2 g NaHCO3 및 4.47 g HEPES 100 ml 0.05 N NaOH)과 10 ng/mL PMA. 사용까지 얼음에 혼합된 콜라겐 솔루션을 유지.</li>
	<li>수 1-2 x 106 THP-1 세포와 190 x g.에서 4 분 동안 원심 분리기 혼합된 콜라겐 솔루션의 1 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 다음 단계까지 얼음에 혼합물을 유지.</li>
	<li>GTE의 부상된 지역으로 10-30 µ L THP-1-콜라겐 혼합물을 추가 합니다. 0.7-1 문화 매체를 대체 PMA의 10 ng/mL를 포함 하는 mL KSR 매체.</li>
	<li>5% CO2 72 h에 대 한 37 ° C에서 습도 분위기에서 혼합물을 품 어.</li>
	<li>치은 염 이나 치 주 질환 조사에 대 한 모델을 사용 하 여 (예를 들어 추가 잠재적인 항 염증 제 약 cytokine 릴리스10에 그것의 효과 볼 수 iGTE). 또는, 72 h PMA 처리를 생략 2 µ g/mL LPS의 문화에 추가 하 고 조직 5% CO2 48 h11,1237 ° C에서 습도 분위기에서 품 어.</li>
</ol>4. 고정 및 전체 마운트 Immunostaining GTE와 iGTE의 문화
<ol><li>
문화는 고정
	<ol>
<li>24-잘 접시에서 문화 매체를 제거 합니다. 워시 버퍼 인산 염 (PBS)와 2 회 조직.</li>
		<li>문화를 잘 10% 포 르 말린 중립 버퍼 솔루션 삽입 하 고 1 mL의 1 mL를 추가 합니다. 하룻밤 냉장고에서 4 ° C에 24-잘 접시를 남겨 주세요.</li>
		<li>다음 날 10% 포 르 말린 중립 버퍼 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>전체 산 immunostaining에 대 한 고정 후 PBS로 3-4 회 조직을 씻어.</li>
		<li>되며 오신 (H & E) 얼룩 및 일반 immunostaining, 탈수, 파라핀 포함, 및 단면 진행. 참고: 전체 산 immunostaining에 대 한이 단계를 생략할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전체 마운트 immunostaining 참고:이 프로토콜 참조 13에서에서 수정 되었습니다.<ol>
<li>3 조직 세척 PBS 0.5-1에서에서 x % 트리톤, 10-30 분 각 시간.</li>
		<li>블로킹 버퍼에서 30 분 동안 두 번 조직을 품 어 (PBS 1% 트라이 톤 + 10 %BSA), 실내 온도에.</li>
		<li>블로킹 버퍼, 5-10 분 때마다 조직 2 ×를 씻어.</li>
		<li>삽입에 필요한 희석/농도에서 1 차적인 항 체 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다. 얇은 플라스틱 집착 영화를 사용 하 여 조직에 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 삽입 하.</li>
		<li>4 ° c.에 1 ~ 2 일에 대 한 조직을 품 어</li>
		<li>씻어 조직 3 번, PBS에서 30 분 1% 트라이 톤 + 10 %BSA. 씻어 PBS에서 5 분, 3 번 다시 1% 트라이 톤.</li>
		<li>블로킹 버퍼에 이차 항 체의 50 µ L를 추가 (PBS 1% 트라이 톤 + 10 %BSA) 및 각 삽입을 Hoechst 33342 솔루션 (NucBlue 라이브 셀 얼룩)의 5 µ L. 얇은 플라스틱 집착 영화를 사용 하 여 조직에 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 삽입 하.</li>
		<li>4 ° c.에 1 ~ 2 일 동안 품 어 젖은 종이 타월에 24-잘 접시를 포장 하 고 보육 전반에 걸쳐 사용을 비닐 팩에 넣어.</li>
		<li>PBS 1% 트라이 톤에서 10 분 조직 3 번 씻어</li>
		<li>날카로운 바늘을 사용 하 여 얻을 조직 문화 삽입의 막 잘라. 장소는 슬라이드에 막입니다. 참고: 조직 막에 있어야 한다.</li>
		<li>형광 마운트 매체의 2-3 방울을 추가 합니다. 커버 글라스와 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 조직 분석까지 커버.</li>
		<li>Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 조직 보기</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
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</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

이 프로토콜 gingival 조직 등가물 및 이전 보고서8,,2122에 의해 설명 된 피하 지방 조직 등가물을 만드는 방법을 기반으로 합니다. 이 간단 하 고 쉬운 방법 이지만, 일부 단계 특별 한 주의가 필요 합니다. 예를 들어 콜라겐 혼합 솔루션에서 젤 형성을 피하기 위해 사용 될 때까지 얼음에 유지 되어야 한다. 문화 삽입으로 콜라겐 혼합물을 추가할 때 솔루션 편견된 젤 ( 그림 3B처럼) 형성을 피하기 위해 삽입의 센터에서 주사 확인 하십시오. GTE에 구멍을 펀칭 기술을 걸립니다. 조직 주먹 가끔 조직 너무 젖은 경우는 조직을 선택할 수 없습니다. 조직 생 검 시스템 또는 집게의 쌍 유용할 것; 그러나, 부상된 위치 크기 많이 변경 됩니다. 그것은 또한 날카로운 바늘과 주사기를 사용 하 여 구멍을 펀칭...

치 주 질환 성인에서 치아 손실의 주요 원인입니다. 치은 염 및 치 주 염 가장 일반적인 치 주 질병이 있습니다. 둘 다 gingiva에 biofilm 중재 급성 또는 만성 염증 성 변화를 제시. 치은 염 치 주 염이 만성 염증으로 일반적으로 선물 하는 반면 급성 염증, 특징 이다. 조직학 수준에 세균성 구성 요소는 대 식 세포, 림프 톨, 플라스마 세포, 돛대 세포1,2등 면역 세포의 활성화를 트리거합니다. 이러한 면역 세포 특히 대 식 세포, 지방 세포 (gingival 상피 세포, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 및 osteoblasts 포함)와 상호 작용 결과로 치 주 조직3,4에 염증 성 병 변. 치 주 질환의 실험 모델 동물, 쥐, 등의 다양 한 종류에서 설립 되어 햄스터, 토끼, 흰 족제비, 개, 그리고 대주교. 그러나, 동물 모델의 physiopathology는 인간의 세포 및 분자 메커니즘을 분석 하 고 치 주 질환5의 새로운 의약품을 평가 하기가 어렵습니다 다릅니다. 치 주 박테리아와 단층 인간 구강 상피 세포의 공동 경작은 치 주 감염6의 메커니즘을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 구강 세포의 단층 문화 부족 그대로 조직;의 3 차원 (3D) 셀룰러 아키텍처 따라서, 그들은 체 외에 상황을 모방 수 없습니다.
여기, 3D 염증 인간의 조직 등가물 gingiva (iGTE)의 생체 외에서치 주 질환을 대표 설정 됩니다. 치 주 질환의이 3D 모델 단층 세포 배양 및 동물 모델 사이의 중간 위치를 차지 하고있다. 세 가지 유형의 HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts 및 THP-1 세포를 포함 하 여 인간 셀 공동 콜라겐 젤에 재배 있으며 iGTE 구축 염증 초기자에 의해 자극. IGTE는 밀접 하 게 세포 분화, 세포 세포 상호 작용 및 gingiva에 대 식 세포 활성화의 비보에 조건을 시뮬레이션합니다. 이 모델은 마약 검사 및 치 주 질환, 새로운 약리학 접근을 테스트 뿐만 아니라 상처 치유, 염증, 및 조직 재생에 세포질이 고 분자 메커니즘 분석을 위한 많은 가능한 응용.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 유형 I-A</td><td>Nitta Gelatin Inc</td><td></td><td>GTE</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11900073</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>세포 배양 삽입물 (24-웰 플레이트 용)의 진피 제조용, 기공 크기 3.0 &mu; 엠</td><td>코닝, Inc.</td><td>353096</td><td>조직 배양용</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>31600034 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>녹아웃 혈청 교체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>조직 펀처</td><td>Shibata 시스템 서비스 co., LTD</td><td>SP-703</td><td>용 GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td>의 펀칭 홀 <td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)</td> 면역 염색용<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>핵 형</td></tr><tr><td>광 마운트 배지</td><td>Dako</td><td></td> 라벨링용 <td>면역 염색</td></tr> <tr><td>후 시료 장착용Anti-Cytokeratin 8+18 항체 [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>상피 식별용</td></tr><tr><td>스캐닝 전자 현미경</td><td>Hitachi, Ltd.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>시료의 표면 지형 및 조성 관찰용</td></tr>: <tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 LSM</td><td>700; 공급자:Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.</td><td>LSM 700</td><td>샘플의 면역 형광 염색 관찰</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 19 항체</td><td>abcam</td><td>ab52625</td><td>상피</td></tr><tr><td>Anti-vimentin 항체</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>섬유 아세포 및 활성 대식 세포 식별</td></tr> 용 <tr><td>Anti-TE-7 항체</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>진피의 섬유 아세포</td></tr><tr><td>식별 Anti-CD68 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>대식 세포 식별용</td></tr><tr><td>Human CD14 Antibody</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>대식세포 식별용</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>면역형광 염색용</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>면역형광 염색용</td></tr><tr><td>EVOS FL 세포 이미징 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>시료의 면역형광 염색</td></tr><tr><td>THP-1 세포</td> 관찰 <td>Riken BRC 세포 은행</td><td>RCB1189</td><td>iGTE</td></tr><tr><td>PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td> 제작용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>THP-1 세포 분화용</td></tr></tbody></table>

3 차원 선 동적인 인간 조직 gingiva 등가물

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

치 주 질환 (치은 염 등 치 주 염)는 성인에서 치아 손실의 주요 원인. Gingiva에 염증 치 주 질환의 근본적인 physiopathology입니다. 치 주 질환의 현재 실험 모델 동물의 다양 한 종류에 설립 되었습니다. 그러나, 동물 모델의 physiopathology는 인간의 세포 및 분자 메커니즘을 분석 하 고 치 주 질환에 대 한 새로운 의약품을 평가 하기가 어렵습니다 다릅니다. 여기, 우리 인간의 염증 성 조직 등가물 gingiva (iGTE) 체 외에서의 재구성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 우리는 먼저 인간의 gingival 섬유 아 세포 (HGF) 등 3 차원 조건 하에서 인간의 피부 상피 keratinocytes (HaCaT), 인간 세포의 두 종류를 이용 하 여 gingiva (GTE)의 인간의 조직에 해당 빌드. 우리는 GTE에 구멍을 펀치 조직 주먹을 사용 하 여 상처 모델을 만듭니다. 다음, 인간의 THP 1 monocytes 콜라겐 젤과 혼합는 GTE에 구멍에 주입 됩니다. 10 ng/mL phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 72 h에 대 한 adimistration에 의해 THP-1 셀 GTE (iGTE)에서 양식 염증 foci 하 대 식 세포로 분화 (IGTE 또한 일 수 있다 stumilated lipopolysaccharides (LPS)의 2 µ g/mL와 염증을 시작 하 48 h에 대 한 ). IGTE 3 차원 구조와 인간 세포를 사용 하 여 염증 gingiva의 첫 번째 시험관에 모델입니다. IGTE 치 주 질환에 주요 학적 변화 (immunocytes activition, fibryoblasts, 상피 세포, monocytes 그리고 대 식 세포 중에서 세포 상호 작용)을 반영 한다. 치 주 질환에 대 한 상처 치유 공부를 다양 한 도구, 조직 재생, 염증, 세포 세포 상호 작용, 및 화면 잠재적인 약으로 GTE, 부상된 GTE, 및 iGTE을 사용할 수 있습니다.

HaCaT 세포 단계 대조 현미경 관찰 (그림 2A)에서 전형적인 keratinocyte 형태 표시. 전자 현미경 (SEM) 이미지 스캐너 HaCaT 세포 표면 많은 microvilli에 의해 덮여 있었다 보였다. HaCaT 세포 사이의 세포 연결 막 프로세스 (그림 2B)에 의해 중재 했다. HaCaT 세포 gingival 상피 마커 K8/1814, HaCaT 세포 적합 gingiva 재건 (그림 2C) 나타내는 표현.
그림 3A GTE의 성공적인 예를 보여 줍니다 그리고 <strong class="xfig"...

프로토콜의 목적은 염증 인간의 gingiva 모델 시험관을 구축 하는 것입니다. 이 조직 모델 공동 세 가지 유형의 인간 세포, HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts 및 THP 1 대 식 세포, 3 차원 조건 하에서 양성. 치은 염 및 치 주 염 등 치 주 질환을 조사 하는 것이 모델을 적용할 수 있습니다.

3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

이 실험의 전반적인 목표는 세 가지 유형의 인간 세포를 in vitro를 사용하여 3D 염증성 치은 조직 모델을 재구성하는 것입니다. 이 방법은 상처 치유, 조직 재생, 염증을 연구하고 치주 질환에 대한 잠재적 약물을 스크리닝하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3차원 구조를 가진 인간 세포를 사용하여 염증성 치은의 체외 모델을 구축하는 최초의 방법이라는 것입니다.15ml 멸균 튜브에 콜라겐 I-A형, 10% 농축 MEM-알파 및 10% 재건 완충액을 추가합니다. 그런 다음 콜라겐 혼합물을 다음 사용까지 얼음에 그대로 두십시오. 다음으로, 3마이크로미터 공극 크기의 24웰 배양 인서트를 24웰 배양 플레이트에 배치합니다.그런 다음 25% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 배양 플라스크에서 HGF를 분리합니다. 다음으로, 분리된 세포를 10ml의 배양 배지에 현탁시킵니다. 그런 다음 Burker-Turk 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다.원하는 세포 수를 분리한 후 4분 동안 190배 g으로 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 콜라겐 용액으로 세포 펠릿을 현탁시키고 튜브를 얼음 위에 두십시오. 다음으로, 기포를 생성하지 않고 배양 삽입물에 5ml의 세포-콜라겐 혼합물을 추가합니다.그런 다음 세포-콜라겐 혼합물과 함께 배양 삽입물을 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 10-30분 동안 배양합니다. 배양 후 1ml의 배양 배지를 웰에 넣고 5ml의 배지를 인서트에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 배양 플레이트를 5% 이산화탄소로 하루 동안 배양합니다.다음으로, 트립신-EDTA 용액 25%를 사용하여 배양 플레이트에서 HaCaT 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 10ml의 배지 B를 세포에 추가합니다. 그런 다음 셀 번호를 계산합니다.원하는 세포 수를 분리한 후 4분 동안 190배 g으로 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후 세포 펠릿을 배지 B에 용해시키고 배양 삽입물에서 배지를 흡인합니다. 그런 다음 HGF-콜라겐 혼합물 위에 5ml의 HaCaT 세포 현탁액을 추가합니다.배양 삽입물을 인큐베이터에 하루 동안 그대로 두십시오. 다음날, 배양 배지를 교체하십시오. 5%의 소 태아 혈청이 보충된 1ml의 공동 배양 KSR 배지를 배양 웰에 추가하고 배양 삽입물에 5ml를 추가합니다.그런 다음 배양 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 배양 배지를 1% 소 태아 혈청이 보충된 공동 배양 KSR 배지로 교체합니다. 24시간 후에 배양 삽입물과 배양 모두에서 전체 배양 배지를 제거합니다.그런 다음 배양 웰에만 신선한 7-1 밀리리터의 KSR 배지를 첨가하고 2 주 동안 배양을 계속합니다. 매주 두 번씩 문화 우물의 매체를 바꾸는 것을 잊지 마십시오. 직경 1-3mm의 티슈 펀처를 준비하고 섭씨 121도의 오토클레이브에서 20분 동안 펀처를 살균합니다.멸균 후 조직 펀처를 GTE에 수직으로 약 30마이크로미터 깊이로 밀어 조직에 상처를 만듭니다. 다음으로, PMA 1밀리리터당 10나노그램, 10% 재구성 완충액 및 10% 농축 RPMI 배지를 콜라겐 유형 I-A 겔과 혼합합니다. 그런 다음 콜라겐 혼합물을 다음 사용까지 얼음에 그대로 두십시오.다음으로, THP-1 세포를 190배 g에서 4분 동안 원심분리한다. 원심분리 후, 콜라겐 용액 1ml에 세포 펠릿을 현탁시키고 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 10-30 마이크로 리터의 THP-1 세포-콜라겐 혼합물을 GTE의 상처 부위에 첨가하십시오.다음으로, 배양 배지를 PMA 1밀리리터당 10나노그램을 함유하는 7 내지 1밀리리터 KSR 배지로 교체합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 72시간 동안 배양합니다. 재구성된 GTE를 특성화하기 위해 H 및 E 염색 및 주사 전자 현미경이 수행됩니다.이미지는 GTE가 여러 층의 상피와 얇은 판 propria를 가진 치은과 같은 조직 구조를 나타내는 것을 보여줍니다. 이미지는 또한 재구성된 GTE의 HGF 세포가 콜라겐 섬유로 둘러싸인 섬유아세포의 뚜렷한 형태학적 특성을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 그런 다음 진피 및 상피 마커의 발현을 연구하기 위해 면역형광 염색을 수행합니다.이는 GTE와 iGTE가 실제 염증성 인간 치은의 분자적 특징을 가지고 있는지 검증하기 위한 것입니다. 이미지는 비멘틴과 TE-7이 GTE의 얇은 판에 강하게 존재한다는 것을 보여줍니다. K19는 치주염에서 접합 상피에 대한 특이적 마커로, GTE 상피에서 약하게 발현되지만 IGTE 상피에서는 충분히 강합니다.마지막으로, iGTE에서 염증성 병소를 생성하기 위해 PMA 처리된 THP-1 단핵구를 조직의 상처 부위에 주입합니다. PMA 처리 후 72시간이 지나면 THP-1 세포가 대식세포 유사 세포로 분화됩니다. 전체 마운트 면역염색을 통해 이 세포가 두 가지 중요한 대식세포 마커인 CD14와 비멘틴을 발현하고 염증성 병소를 형성하는 것을 확인했습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 3-4주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 오염을 피하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 숙주-생물막 상호 작용을 통해 염증을 유도하는 방법과 같은 추가 질문에 답하기 위해 LPS를 사용하여 염증 반응을 자극하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 염증, 조직 재생 및 상처 치유 분야의 연구자들이 세포 및 분자 메커니즘을 탐구하고 치주 질환에 대한 잠재적 약물을 스크리닝할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 체외에서 3D 염증성 치은 조직 모델을 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물

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