Name: 인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 학습하세요 치경골 막에서 중간엽 줄기세포를 분리하고 비타민 D로 골유도 분화를 유도하는 방법을. 이 기술은 치과 재생의학 연구에 활용됩니다.

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연구 프로토콜은 임상 연구의 장 궁 기념 병원 (IRB99-1828B, 100-3019 C, 99-3814B, 102-1619 C, 101-4728B, 및 103-4223 C)에 대 한 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 이 연구는 장 궁 기념 병원 (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142, 및 NMRPG3C0151)에 의해 지원 되었다. 이 원고는 월 러 스 학술 편집 편집 했습니다.

연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 장 궁 기념 병원에 의해 승인 되었다. 모든 참가자는 서 면된 동의 제공합니다.
1. 조직 준비
<ol><li>치과 수술 (그림 1) 중 환자에서 periosteal 조직 수확. 플랩 반사 로컬 마 취, 후31periosteal 구분 기호 사용 하 여 치조 뼈에서과 직물의 조각을 가져가 라.</li>
	<li>수확 후 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 페니실린의 300 U/mL와 스의 300 mg/mL에서에서 약 5 m m × 2 mm의 periosteal 조직 조각을 저장 합니다. 24 시간 이내 실험실에 전송 조직.</li>
	<li>잘 다진 고 37 ° C에서 인큐베이터에서 배양 통로 0 매체 (페니실린의 300 U/mL와 스, α-MEM, 및 5% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS] 300 mg/mL로 구성)에서 샘플을 유지 때까지 scalpels와 치경 periosteal 조직 파편을 말하다 습도 공기 (5% 이산화탄소)입니다. 인큐베이터에서 습도 유지 하기 위해 물통을 준비 합니다.</li>
	<li>3 일 후에 그리고 그 후에 주 당 두번 매체를 변경 합니다.</li>
	<li>셀 subconfluence (80%)에 도달, 3 분 인큐베이터 (37 ° C)에서 0.25 %trypsin 200 µ L 부착 셀 놓고 매체의 4.5 mL을 사용 하 여 반응을 종료.</li>
	<li>신선한 통행 1 매체에서 다시 셀 접시 (α-MEM, 10 %FBS, 페니실린, 100 단위/mL와 스의 100 μ g/mL). 플레이트는 5 × 103 셀 (로 hemocytometer 계산)입니다.</li>
	<li>셀 80% 합류31달성 후 각 후속 통로 수행 합니다. 참고: 처음에, 매체는 붉은 오렌지 있을 것입니다. 약 3 일 후, 중간 색상 노란 그늘을 변경 해야 합니다. 셀의 두 배로 대략 30-40 h, 7 일 3-5 세대에 대 한 필요.</li>
	<li>문화 α-MEM에 고립 된 Pdc 보충 10 %FBS, 페니실린, 100 U/mL 및 100 mg/mL의 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 스.</li>
	<li>세포 성장을 매일 관찰 하 고 두 번 주당 성장 매체를 대체. 제 3-5 세대 세포를 사용 하 여 모든 추가 실험에 대 한.</li>
</ol>2. Cytometry
<ol><li>트립 신 소화를 통해 수확 1 × 106 셀:<ol>
<li>0.25 %trypsin 200 µ L를 추가 합니다. 3 분 후 FBS를 포함 하는 문화 매체의 4.5 mL 사용 하 여 트립 신의 반응을 종결 하 고 원심 분리 (1500 rpm, 5 분, 22 ° C)를 통해 수집.</li>
		<li>3 번 1 x DPBS를 사용 하 여 셀 펠 릿을 세척. 200 µ L 1 x permeabilization 버퍼에 셀 resuspend hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교류 cytometry (형광 활성화 된 세포 분류)32통해 Pdc의 표현 표현된 표면 마커를 검사 합니다. CD19에 대하여 단일 클론 항 체 (MAb)를 사용 하 여 (fluorescein isothiocyanate (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (알렉스), 및 HLA-DR (FITC)32.<ol>
<li>30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 문화와 샘플에 항 체를 추가 합니다.</li>
		<li>1 x DPBS 셀 세 번 씻어.</li>
		<li>2% 포름알데히드를 사용 하 여 셀을 수정 하 고 교류 cytometry 분석32진행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 세포 부착 및 Osteogenic와 생존, Adipogenic, 및 Chondrogenic 차별화
로 셀에 차별화를 유도 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보 특정 차별화 미디어 6-잘 접시에 모든 3 개의 구절에서 periosteal 세포를 배양 하 여.
<ol><li>Osteogenic 차별화 6-잘 문화 접시에 잘 당 5000 세포의 밀도에서 α-MEM에 셀 문화.<ol>
<li>80%의 합류에, α-MEM, 5%를 포함 하는 미디어에 셀 문화 FBS, β-glycerophosphate (10 mM), 10−7 M dexamethasone (0.1 m m), 그리고 의약품의 5 mL (100 uM). Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.</li>
		<li>두 번 주당 미디어를 변경 합니다.</li>
		<li>4 주 후, 문화33석 회화 예금의 존재를 구별 하는 von Kossa 분석 결과 사용 하 여 셀을 얼룩이 여 osteogenic 혈통으로 차별화 하는 세포의 잠재력을 평가 합니다.<ol>
<li>10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 5% 실버 질 산을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 자외선 (UV)에서 취급 합니다.</li>
			<li>추가 5% 나24 4 시간, 3 분 각 반응에 대 한 허용. 마지막으로 증류수로 두 번 셀 세척. 참고: Von Kossa 얼룩은 강 수 반응은 이온과 인산 염이; 산 성 물질의 존재에 반응 이 얼룩 기법 칼슘에 특정 하지 않습니다. 이 연구에서 때 조사 셀 실버 질산염 솔루션, 칼슘으로 치료 했다-는 강한 자외선에 의해 감소 된다-실버, 메탈 릭 실버로 표시 된에 의해 대체 되었다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adipogenic 차별화, α-MEM을 포함 하는 6-잘 문화 접시에 잘 당 5000 세포의 밀도에 세포 문화.<ol>
<li>80%의 합류에, α-MEM, 5 %FBS, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (100mg/mL), 1% 페니실린을 포함 하는 미디어에 셀 문화 10−6 M dexamethasone (1mm), 인슐린 (5 mg/mL), 및 indomethacin (60 mM).</li>
		<li>Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.</li>
		<li>사용 6-9 주 후, 기름 빨간 O 셀 얼룩 및 지질 방울, 그로 인하여 adipogenic 차별화33의 존재 확인을 강조:<ol>
<li>10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 얼룩 0.5% 셀 오일 10 분 동안 실 온에서 붉은 O 고 다음 씻어 3 시간 3 분 동안 60% 소 프로 파 놀과 셀 때마다; 마지막으로, 증류수와 셀 세척. 참고: 기름 빨간 O 중성 지질, 얼룩에 사용 되는 lysochrome (지 용 성) 디 아조 염료는 주로 triacylglycerol, 단백과 콜레스테롤 에스테 르. 염료도 지질 방울은 빨강 셀에 지질 작은 물방울에 녹 인 다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chondrocyte 차별화, 각각 6-잘 문화 접시에 문화 세포 포함 5000 셀 잘.<ol>
<li>차별화 중간 포함 α-MEM, 5 %FBS, 10−7 M dexamethasone (0.1 m m), 나트륨 pyruvate (100 µ g/mL), 인슐린-처리가-셀 렌-A (1 × ITS), 변형 성장 인자-β (10 ng/mL), 및 의약품 (100 µ M)의 5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.</li>
		<li>4-5 주 후 Alcian 블루 얼룩 있다 또는 일부 유형의 chondrocyte 차별화33의 존재를 결정 하는 세포의 연골에서 mucopolysaccharides와 같은 산 성 류를 강조 하기 위해 사용 합니다.<ol>
<li>10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 3% 아세트산을 추가 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다. 그 후, 증류수로 세 번 씻어 30 분 동안 incubated 1 %Alcian 블루 8GX를 추가 하 고 증류수로 씻어. 마지막으로, 3% 초 산 및 3 분, 세척을 추가 하 고 완료를 증류수로 씻어. 참고: 특히 블루가이 염료에 의해 얼룩에 블루 그린 셀 부분의 후 얼룩이 지 고 "alcianophilic" 라고</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 골에 25 Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3)의 효과
<ol><li>6 그룹와 다양 한 문화 미디어 6-잘 접시에 문화 P5 Pdc에 P3 분할:</li>
	<li>음수 그룹 (α-MEM 및 5 %FBS);</li>
	<li>비타민 C 그룹 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C);</li>
	<li>그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).</li>
	<li>각 잘에서 인큐베이터 (37 ° C)에 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 변경 매체 매주 두 번.</li>
</ol>5. 리버스 전사/정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응
<ol><li>상업적인 시 약을 사용 하 여 얼음에 총 RNA 격리 osteoblast 차별화의 7d, 후 ( 재료의 표참조):<ol>
<li>각 잘을 절연 시 약의 1 mL를 추가 합니다. Bromochloropropane의 200 µ L을 추가 하 고 계층화 된 RNA를 생성 하기 위해 10 분 동안 떠나 다음 4 ° c.에 15 분 동안 10000 rpm에서 원심</li>
		<li>원심, 후 표면에 뜨는 포함 RNA의 500 µ L를 2-프로 판 올의 500 µ L를 추가 합니다. 얼음에 RNA 침전 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다.</li>
		<li>절차 후 후 RNA는 튜브의 하단에 4 ° C에서 15 분 동안 12000 rpm에서 원심. 그 후, 세척에 대 한 75% 알콜의 1 mL를 사용 하 여는 상쾌한을 제거 하 고 4 ° C에 8 분 7500 rpm에서 원심</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 진공 집중 장치를 사용 하 여 액체의 바닥에서 RNA를 생산. 물으로 복구.</li>
	</ol>
</li>
	<li>리버스는 RNA 녹음 (1 μ g) 조류 myeloblastosis 바이러스 역전사를 사용 하 여. 마지막으로 4 ° c.에 유지 하기 전에 60 분 그리고 85 ° C 5 분, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 50 ° c 10 분 동안 25 ° C에 실행 되도록 설정</li>
	<li>첫 번째 가닥 보완 DNA (cDNA) 음성 합성. 정량 PCR (정량) 5를 사용 하 여 수행 μ 1:10 희석 cDNA. 양적 RT-PCR (qRT-PCR) 실시 ALP, BSP, OCN, CBFA1, 및 콜라겐-1에 대 한 프라이 머를 사용 하 여. 참고: 신호에 의해 DNA 오염을 방지 하려면 각 뇌관의 정방향 및 역방향 시퀀스 별개 exons에 설계 되었습니다.</li>
	<li>상업적인 PCR 마스터를 사용 하 여 정량 Pcr을 수행 믹스 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라. 2 분 뒤에 10 분 동안 95 ° C 그리고 다음 40 주기 각각 15 95 ° C에서 50 ° C에서 열 cycler 설정 s 60 위한 60 ° C 이어서 s. 참고: SYBR 프로토콜 또한 필요 15 95 ° C에 실행 되는 용융 곡선 단계, s 60 위한 60 ° C s, 그리고 95 ° C 15에 대 한 s.</li>
	<li>ALP, BSP, CBFA1, 사이클 임계값 값을 정상화 콜라겐-1, 그리고 내부 관리 유전자 GAPDH의 OCN. 34
</li>
	<li>뇌관 쌍은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.</li>
</ol>6. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동
<ol><li>앞에서 설명한 기법35, p-nitrophenol; p-nitrophenyl 인산 염 변환을 사용 하 여 셀의 ALP 효소 활동 평가 p-nitrophenyl 인산은 노란색으로 405 nm 파장에서 결정 된 ALP에 의해 dephosphorylated 때 인산 가수분해 효소 기질. 전체 표준화 p-nitrophenol 형성 Bradford 분석 실험에 의해 결정 되는 총 단백질에 따라.</li>
	<li>컨트롤의 ALP 활동 비교 (α-MEM, 5 %FBS), 비타민 C (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), 그리고 비타민 C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C +1,25-(OH)2D3) 그룹의 문화 1, 2, 3, 그리고 4 주 후.</li>
	<li>얼음에서 단백질 추출 절차를 수행:<ol>
<li>6 잘 플레이트에서 세포를 긁어와 세포의 용 해 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다. 그 후, 세포를 파괴 하 고 단백질을 무료로 30 분 얼음에 셀을 놓습니다.</li>
		<li>30 분 후 15 분 동안 4 ° C에서 13000 rpm에서 원심. 원심, 후 저장에 대 한 상쾌한 추출 하 고 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

최근에 개발한 치료 양식 적임, 즉 조직 MSCs, 수 반하는 공학에 수많은 장점이 있습니다. 여러 조직 종류에 있는 MSCs 기능 mesodermal 조직 세포37 의 다양 한 차별화 수 있는 multipotent 셀과 다른 셀 osteoblasts 등 있습니다.
과 조상 세포에 대 한 틈새 시장으로 하며 뼈에 대 한 풍부한 맥 관 구조 공급으로38을 포위 한다. 34 조사 샘플의 우리의 연구에서 20는 성공적으로 58.8%의 성공적인 분리 속도와 MSC 식민지 나왔고. MSCs는과에서 파생 된 그들의 확산 및 osteogenic 분화 능력에 따라이 연구에서 선정 됐다. Periosteal 세포의 확산 속도22골 수 기질 세포 그것 보다 훨씬 높았다. 과의 osteogenic 능력에 관한 Ousual24 과 ...

비록 최근 몇 년 동안에서 수많은 관련 기술 개발 되었습니다, 뼈 재건 남아 여러 제약 조건에 의해 제한 하 고 필요한 재구성의 정도 종종 가능한 추정. 하드 조직 확대는 유리한 장기 성공률 뿐만 아니라 심 미와 기능 목표를 달성 해야 합니다. 이러한 절차에 대 한 일반적으로 사용 되는 방법에는 자생과 allogenic 뼈 접목, xenografting, 및 alloplastic 뼈 접목 포함 됩니다. 뼈 이식의 다양 한 종류 중에서 자생 뼈 이식 가장 효과적으로 간주 됩니다. 그러나, 기증자 사이트 사망률, 손상된 vascularity, 그리고 제한 된 조직 여부1 자생 뼈 접목에 대 한 주요 단점이 있다. 또한, allogenic 뼈 이식 술과 xenografts 되었습니다 관련 질병 전송 된. 현재, 합성 뼈 이식 이러한 문제를 해결 하기 위해 널리 사용 됩니다. 그러나, osteogenic 잠재력의 그들의 부족, 임상 결과 널리 다양 했습니다. 셀 룰 로스 등 재료는 볼륨 변동, 감염, 및 힘의 부족에 연관 된다.
사용 하 여 조직 공학 뼈 확대는 상당한 관심을 생성 했다. 이 기술에서는, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 처음 사용 osteoblast 분화를 촉진 하는 다음 뼈 복구를 달성 하기 위해 뼈 손실의 사이트에 이식 됩니다. 이 절차는 현재 셀에 적용 됩니다. 제한 된 양의 조직 추출 하 여 뼈 재건을 달성은 간단 하 고 덜 침략 다른 방법에 비해입니다.
세포 기반 치료 치과 재생 목적을 위한 도구로 MSCs의 잠재적인 역할은 다양 한 연구 그룹 중 신흥 관심입니다. MSCs는 다음과 같은 유형의 조직에서 분화 될 수 있다 연구 확인: 골 수, 지방, 활 액 막, pericyte, 배수 뼈, 인간의 탯 및 치과 조직2,3. MSCs의 일반적인 소스는 골 수, 지방 조직, 그리고 치과 조직을 포함합니다. 지방 조직과 골 수에서 파생 된 MSCs와 비교는 치과 줄기 세포의 장점은 쉬운 접근성 및 더 적은 사망률 수확 후입니다. 배아 줄기 세포와 비교해, MSCs 치과 조직에서 파생 된 nonimmunogenic 나타나고 복잡 한 윤리적 문제3와 연결 되지 않습니다.
2006 년에, 세포 치료에 대 한 국제 사회 MSCs를 식별 하는 다음과 같은 표준을 사용 하 여 권장: 첫째, MSCs 수 있어야 합니다 플라스틱 연결. 둘째, MSCs CD105, CD73, CD90 표면 항 원에 대 한 긍정적이 고 부정적인 monocytes, 대 식 세포, B 세포는 조 혈 항 CD45와 CD344에 대 한 표식에 대 한 있어야 합니다. 최종 조건으로 MSCs는 다음 세 가지 유형의 차별화 생체 외에서 의 표준 조건 하에서 세포로 분화 할 수 있어야 합니다: osteoblasts, adipocytes, 및 chondrocytes4. 날짜 하려면, 6 종류 인간의 치과 줄기 세포의 고립 된 고 특징 되었습니다. 첫 번째 유형은 인간의 펄프 조직 으로부터 격리 되었고 출생 후 치과 펄프의 줄기 세포5되 나. 그 후, 치과 MSCs의 3 개의 추가적인 종류 고립 되었고 특징: 피부 박피 낙 엽이6,7치 주 인 대, 그리고 꼭대기 시8에서 줄기 세포. 더 최근에, 치과 여 포에서 파생 된9, gingival 조직 파생10, 치과 봉 줄기 cells(DBSCs)11, periapical 낭종 MSCs (hPCy-MSCs)12 도 확인 되었습니다.
세계적은 MSCs13정의 하는 첫번째 이었다. MSCs는 높은 확산 잠재력을 전시 하 고 이식 되 전에 분화를 조작할 수 있습니다 재생 절차10에 대 한 이상적인 후보자 다는 것을 건의 하.
비록 대부분의 연구는 줄기 세포의 원천으로 골 수를 사용 하 고과 파생 된 세포 (PDCs)도 있다14최근에 사용한. 과 골 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 따라서,이 기술을 사용 하 여 치경과 수술 중 추가 절 개에 대 한 필요성을 제거 하 고 환자의 postsurgical 사망률을 줄이기 위해. 과 결합 조직 하는 긴 뼈의 외부 안 대기를 형성 하 고 두 가지 계층으로 구성 됩니다: 외부 섬유 층 섬유 아 세포, 교원 질 및 탄력 있는 섬유15와 직접 접촉에서 내부 셀 풍부한 레이어의 레이어 구성 와 함께 뼈 표면. 레이어의 레이어에 포함 되어 있는 혼합된 셀 인구, 주로 섬유 아 세포16, osteoblasts17,18, pericytes 및 MSCs19,,2021로 식별 하는 중요 한 부분 모집단. 대부분의 연구는 Pdc는 비교를 하지 않을 경우 골 수 유래 줄기 세포 (bMSCs)에서 우수한 뼈 치유와 재생22,,2324을 보고 있다. 과 쉽게 접근할 수 이며 탁월한 재생 효과 전시. 그러나, 몇 가지 연구는과25,,2627에 집중 했다.
뼈 수리에 관한 현재 임상 실습 지원 건설 기계 내에서 증폭 periosteal 조상 세포의 이식 포함 됩니다. 최근 연구는 줄기 세포 결함이 지역에서 취득 하 고 조상 세포 조직 재생20채용에 집중 했다. 치과 의사는 또한 치 주 치료 및 치아에 치 주 뼈 재생의 미래 응용 프로그램을 예상합니다. 기증자 사이트에 대해서는 쉽게 일반 치과 의사에 의해 수확 될 수 있습니다. 이과 일상적인 구강 수술 하는 동안 액세스할 수 있습니다으로 골 수 기질 세포에 대 한 호의적으로 비교 합니다. 따라서,이 연구의 목적은 이다 형태학, 첨부 파일, 생존, 그리고 인간의 줄기 세포의 확산을 평가 하 고 수확 하는 Pdc에 대 한 프로토콜을 설정 하.
비타민 D 대사 산물에는 vivo에서 뼈 미네랄 동적 평형에 영향을. 한 연구 보고는 24R,25-(OH)2D3 활성 형태의 비타민 D 인간의 MSCs (hMSCs)28의 osteoblastic 감 별 법을 위해 필수적 이다. 뼈 항상성 및 수리는 1,25-(OH)의2D3 (calcitriol)은 생물학적으로 가장 적극적이 고 뼈 건강의 규칙에 관련 된 비타민 D3 대사 산물의 네트워크에 의해 규제 됩니다. 비타민 D3 석 회화29필수적 이다. 한 연구 2-d-오래 곤 흰 쥐를 사용 하 여, 쥐에서 embryoid 몸 비타민 C와 비타민 D 보충제 효과적으로 ESC 파생 osteoblasts30의 차별화 추진 표시. 다른 생물의 활동 중 1,25-(OH)2D3 osteoblasts, 모니터링할 수 있는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 효소 활동이 나 OCN 유전자에는 증가에 따라에 hMSCs의 생체 외에서 분화를 자극 식입니다.
몇 연구 뼈 조직 공학에 특정 초점 인간의 Pdc에 결합된 치료 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 복용량 응답 관계를 감지 했습니다. 따라서,이 연구에서 우리는 1,25-(OH)2D3 의 단일 또는 복합 치료에 대 한 최적의 농도 비타민 C 인간의 Pdc의 osteogenic 분화 유도 대 한 검사. 이 프로토콜의 목표는 치과 치경과에서 고립 세포 인구 세포와 MSC 표현 형이이 세포를 문화 (생체 외에서) 확장 하 고 원하는 조직을 형성 하기 위하여 분화 수 여부를 들어 있는지 확인 하는 . 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다. 연구의 두 번째 부분은 Pdc의 osteogenic 활동에 비타민 C와 10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M 1,25-(OH)2D3 의 효과 평가합니다. 이 연구의 주 목적은 ALP 활동과 ALP, 같은 프로 osteogenic 유전자에 의해 Pdc의 osteoblastic 감 별 법 동안 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 기능을 평가 하는 콜라겐 1, OCN, BSP, 및 CBFA1. 또한,이 연구는 이러한 결과에 따라 인간의 Pdc에 대 한 최적의 osteoinductive 조건을 결정 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>35-mm 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>6&nbsp; 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소</td><td>ABI</td><td>Hs01029144_m1</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 활성 비색 분석 키트</td><td>BioVision</td><td>K412-500</td><td></td></tr><tr><td>조류 골수모세포증 바이러스 역전사효소</td><td>Roche</td><td>10109118001</td><td></td></tr><tr><td>CD146</td><td>BD</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560994</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD</td><td>560942</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>BD</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>561088</td><td></td></tr><tr><td>CD73</td><td>BD</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>561974</td><td></td></tr><tr><td>세포 banker1</td><td>ZEAOAQ</td><td>11888</td><td></td></tr><tr><td>코어 결합 인자 알파-1</td><td>ABI</td><td>Hs00231692_m1</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ABI</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 562008 <tr><td>인도메타신</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>sigma</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>인슐린&ndash; 트랜스퍼린&ndash; selenium-A</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)</td><td>Life</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Life</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification</td><td>HyClone</td><td>SH30265.02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>STRO-1</td><td>BioLegend</td><td>340103</td><td></td></tr><tr><td>SYBER Green PCR 마스터 믹스</td><td>AppliedBiosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Master Mix</td><td>Life</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>변형 성장 인자-&베타;</td><td>시그마</td><td>T7039&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트리졸 시약(RNA 분리용)</td><td>Life</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>collagen-1</td><td>Invitrogen</td><td>forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>앞으로 뇌관 5 ' - GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3 반전 뇌관 5 ' - GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3 '</td><td></td></tr> <tr><td>BSP</td><td>Invitrogen</td><td>앞으로 뇌관 5 ' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3 반전 뇌관 5 ' -GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'</td><td></td></tr> <tr><td>상업적인 ALP 뇌관</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>상업적인 CBFA1 뇌관</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 치경과 파생 셀 osteogenic 활동에 비타민 d의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 다양 한 조직에에서 존재 하 고 osteoblasts를 포함 한 여러 세포 유형으로 분화 될 수 있다. MSCs의 치과 소스, 가운데는 레이어의 레이어에서 MSCs를 포함 하도록 확인 되었습니다는 쉽게 접근할 수 있는 조직입니다. 그러나,이 소스는 하지 아직 광범위 하 게 연구 되었습니다.
비타민 D3 와 1,25-(OH)2D3 생체 외에서 MSCs의 차별화를 실현 osteoblasts 자극 입증 되었습니다. 또한, 비타민 C는 콜라겐 형성과 뼈 세포의 성장을 촉진 한다. 그러나, 아무 연구는 MSCs에 비타민 D3 와 비타민 C의 효과 조사 아직 있다.
여기, 우리 인간의 치경과에서 MSCs를 분리 하는 방법을 제시 1,25-(OH)2D3 이 세포에 osteoinductive 효과 발휘 수 가설을 검사 하 고. 우리는 또한 인간의 치경과에서 MSCs의 존재를 조사 하 고 줄기 세포 접착 및 확산 평가. 평가 하기 위해 비타민 C (컨트롤)로 서의 능력 및 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M)의 다양 한 농도 변경 키에 mRNA 생체 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)의 고립 된 MSCs mRNA 표현 뼈 sialoprotein (BSP), 코어 바인딩 요소 알파-1 (CBFA1), 콜라겐-1, 및 osteocalcin (OCN) 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용 하 여 측정 됩니다.

모든 양적 분석 실험에 대 한 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 됩니다. 모든 통계 분석은 학생의 t를 사용 하 여 수행 되었다-테스트. 총, 34 샘플 48.1의 평균 참가자 나이 가져온 ± 12.3 y. 11 이러한 샘플의 남성 환자와 여성 환자에서 23에서 입수 했다. 20-8 샘플 앞쪽 영역;에서 6 어 금 니 지역에서 가져온 26는 maxilla는 mandible에서 8에서 얻은 했다. 치과 절차와 문화 사이의 평균 기간 0.5 ± 0.1 h 이었다. 34 조사 샘플의 20는 성공적으로 58.8%의 성공적인 분리 속도와 MSC 식민지 나왔고. 매개 변수 사이 상당한 차이가 관찰 되었다는 성공적으로 및 실패 격리 된 Pdc (나이 의미: 48.8 ± 13.0 47.1 ± 11.5 y, 성 대: 4 남자 [28.6%], 위치 대 7 남자 [35%]: 13 [92.9%], 대 [75%] 어 금 니 지역에서 15 및 15에서 11 [78.6...

선물이 파생 된 세포 (PDCs) 비타민 C (비타민 C) 및 1, 25-dihydroxy 비타민 D [1,25-(OH)2D3]에 의해 유도 된의 mRNA 식 biomarkers를 조사 하는 프로토콜. 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다.

인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

이 연구의 전반적인 목표는 치조골막에서 채취한 배양된 중간엽 줄기세포에 대한 비타민 D의 골유도 효과를 조사하는 것입니다. 중간엽 줄기 세포의 사용은 지난 10년 동안 치과 분야에서 큰 발전이었습니다. 그들은 치아 조직의 많은 부분에서 성공적으로 분리되고 배양되었습니다.그러나 목표는 폐포 골막에서 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하고 비타민 D 화합물의 골유도 전위를 조사하는 것입니다. 일반적으로 말해서, 이 문제를 처음 접하는 개인은 폐포 골막에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 뼈 형성에 대한 새로운 아이디어 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 실험실 직원이 절차를 시연할 사람은 Miss Hsin-Wen Chi가 될 것입니다. 그녀는 제 연구실의 연구 조교입니다. 먼저 골막 분리기를 사용하여 치과 수술 중 환자로부터 골막 조직을 채취합니다. 약 2 x 5mm 크기의 조각을 모으십시오.조직 조각을 항생제와 함께 DPBS에 보관하십시오. 실험실에서 메스를 사용하여 채취 후 24시간 이내에 폐포 골막 조직 조각을 철저히 다집니다. 다음으로, 적절한 배양 배지에서 35mm 페트리 접시에 조직을 배양합니다.이산화탄소 가스가 5%인 섭씨 37도의 가습 인큐베이터를 사용하십시오. 3일 후, 수집된 골막 조직을 버리고 배지를 변경합니다. 세포가 약 80%까지 증식하면 트립신을 첨가하여 배양된 세포를 분리합니다.그리고 3분 동안 배양을 배양합니다. 그런 다음 0.8ml의 매체를 추가하여 분리를 종료합니다. 모으고 세는 후에, 5, 판 당 1개의 밀리리터에 있는 000의 세포를 배부하십시오.이 단계에서 도금된 셀을 1번 통로로 표시합니다. 이 세포를 배양하고 80% 합류점으로 증식한 후 다시 분리합니다. 통로 1이 있는 매체는 처음에는 주황색/빨간색입니다.3일 후 매체가 주황색으로 변하기 시작하면 변경합니다. 통로 1 세포가 80% 합류점에 도달하면 제로 세대에서 1 세대를 준비하는 데 사용 된 것과 동일한 절차를 반복하여 2 세대에서 5 세대 세포를 만듭니다. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.4주 후, 현미경으로 세포의 형태를 관찰하여 세포가 골형성 계통으로 분화할 수 있는 가능성을 평가합니다. von kossa assay를 사용하여 세포를 줄기 세포에 주입합니다. 이 분석법은 귀하의 배양에서 석회화된 침전물의 존재를 구별합니다.PBS로 세포를 씻고 10 % 포르말린 1 밀리리터로 30 분 동안 고정합니다. 그 후, 포르말린을 제거

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

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개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

학습하세요 치경골 막에서 중간엽 줄기세포를 분리하고 비타민 D로 골유도 분화를 유도하는 방법을. 이 기술은 치과 재생의학 연구에 활용됩니다.

인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

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