인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

이 연구의 전반적인 목표는 치조골막에서 채취한 배양된 중간엽 줄기세포에 대한 비타민 D의 골유도 효과를 조사하는 것입니다. 중간엽 줄기 세포의 사용은 지난 10년 동안 치과 분야에서 큰 발전이었습니다. 그들은 치아 조직의 많은 부분에서 성공적으로 분리되고 배양되었습니다.

그러나 목표는 폐포 골막에서 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하고 비타민 D 화합물의 골유도 전위를 조사하는 것입니다. 일반적으로 말해서, 이 문제를 처음 접하는 개인은 폐포 골막에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 뼈 형성에 대한 새로운 아이디어 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 실험실 직원이 절차를 시연할 사람은 Miss Hsin-Wen Chi가 될 것입니다.

제 연구실의 연구 조교입니다. 먼저 골막 분리기를 사용하여 치과 수술 중 환자로부터 골막 조직을 채취합니다. 약 2 x 5mm 크기의 조각을 모으십시오.

조직 조각을 항생제와 함께 DPBS에 보관하십시오. 실험실에서 메스를 사용하여 채취 후 24시간 이내에 폐포 골막 조직 조각을 철저히 다집니다. 다음으로, 적절한 배양 배지에서 35mm 페트리 접시에 조직을 배양합니다.

이산화탄소 가스가 5%인 섭씨 37도의 가습 인큐베이터를 사용하십시오. 3일 후, 수집된 골막 조직을 버리고 배지를 변경합니다. 세포가 약 80%까지 증식하면 트립신을 첨가하여 배양된 세포를 분리합니다.

그리고 3분 동안 배양을 배양합니다. 그런 다음 0.8ml의 매체를 추가하여 분리를 종료합니다. 모으고 세는 후에, 5, 판 당 1개의 밀리리터에 있는 000의 세포를 배부하십시오.

이 단계에서 도금된 셀을 1번 통로로 표시합니다. 이 세포를 배양하고 80% 합류점으로 증식한 후 다시 분리합니다. 통로 1이 있는 매체는 처음에는 주황색/빨간색입니다.

3일 후 매체가 주황색으로 변하기 시작하면 변경합니다. 통로 1 세포가 80% 합류점에 도달하면 제로 세대에서 1 세대를 준비하는 데 사용 된 것과 동일한 절차를 반복하여 2 세대에서 5 세대 세포를 만듭니다. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.

4주 후, 현미경으로 세포의 형태를 관찰하여 세포가 골형성 계통으로 분화할 수 있는 가능성을 평가합니다. von kossa assay를 사용하여 세포를 줄기 세포에 주입합니다. 이 분석법은 귀하의 배양에서 석회화된 침전물의 존재를 구별합니다.

PBS로 세포를 씻고 10 % 포르말린 1 밀리리터로 30 분 동안 고정합니다. 그 후, 포르말린을 제거한 다음 세포를 씻고 5 % 질산은으로 처리하십시오. 세포를 1시간 동안 자외선에 노출시킵니다.

다음으로, 질산은을 제거하고 2ml의 5% 황산나트륨으로 세포를 3분씩 4회 처리합니다. 치료 사이에 용액을 교체하십시오. 마지막으로 증류수를 사용하여 세포를 두 번 씻습니다.

34개의 골막 조직 샘플 중 20개에서 골수 유래 줄기세포 콜로니를 성공적으로 산출했습니다. 기증자와 관련된 어떤 요인도 배양 성공에 큰 영향을 미치는 것으로 밝혀지지 않았다. 처음에 PDC는 원형 세포와 방추형 세포가 혼합된 군체와 구형 클러스터를 형성했습니다.

첫 번째 통과 후, 세포는 방추체 모양을 가진 균질하게 섬유아세포와 같았습니다. 골형성 분화가 끝날 때, 폰 코사(von kossa) 분석법은 칼슘 침전물 및 골형성 분화의 존재 가능성을 나타냈습니다. 이러한 결과는 골막세포 집단 중에서 전구 세포가 골형성 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 강력하게 나타냅니다.

골형성 전구세포는 또한 Calcitriol로 처리하고 RTPCR을 사용하여 세포의 조기 골형성 분화를 위한 강력한 지표인 알칼리성 인산가수분해효소의 발현 수준을 평가하기 위해 검사했습니다. 비타민 C와 비타민 D의 활성 대사 산물인 칼시트리올의 치료는 모두 알칼리성 인산가수분해효소 발현을 증가시켰습니다. 또한, 콜라겐 원 mRNA 수치 발현은 동일한 치료에 대한 반응으로 증가했다.

뼈 sialoprotein mRNA의 발현은 더 높은 농도의 Calcitriol로 처리된 세포에서 증가하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나, CBFA 1 및 ostocalcium mRNA 발현은 치료에 반응하지 않았다. 이 비디오를 시청한 후 청중은 인간 폐포 골막의 광물화 및 배양 프로토콜에 대해 잘 이해해야 합니다.

일단 숙달되면, 이 과정을 제대로 수행한다면 4-5주 안에 끝낼 수 있다. 이 실험을 시도할 때 세포 오염을 방지하기 위해 신중하고 멸균된 기술을 사용하는 것이 중요합니다.