Name: 인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 학습하세요 치경골 막에서 중간엽 줄기세포를 분리하고 비타민 D로 골유도 분화를 유도하는 방법을. 이 기술은 치과 재생의학 연구에 활용됩니다.

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연구 프로토콜은 임상 연구의 장 궁 기념 병원 (IRB99-1828B, 100-3019 C, 99-3814B, 102-1619 C, 101-4728B, 및 103-4223 C)에 대 한 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 이 연구는 장 궁 기념 병원 (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142, 및 NMRPG3C0151)에 의해 지원 되었다. 이 원고는 월 러 스 학술 편집 편집 했습니다.

연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 장 궁 기념 병원에 의해 승인 되었다. 모든 참가자는 서 면된 동의 제공합니다.
1. 조직 준비
<ol><li>치과 수술 (그림 1) 중 환자에서 periosteal 조직 수확. 플랩 반사 로컬 마 취, 후31periosteal 구분 기호 사용 하 여 치조 뼈에서과 직물의 조각을 가져가 라.</li>
	<li>수확 후 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 페니실린의 300 U/mL와 스의 300 mg/mL에서에서 약 5 m m × 2 mm의 periosteal 조직 조각을 저장 합니다. 24 시간 이내 실험실에 전송 조직.</li>
	<li>잘 다진 고 37 ° C에서 인큐베이터에서 배양 통로 0 매체 (페니실린의 300 U/mL와 스, α-MEM, 및 5% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS] 300 mg/mL로 구성)에서 샘플을 유지 때까지 scalpels와 치경 periosteal 조직 파편을 말하다 습도 공기 (5% 이산화탄소)입니다. 인큐베이터에서 습도 유지 하기 위해 물통을 준비 합니다.</li>
	<li>3 일 후에 그리고 그 후에 주 당 두번 매체를 변경 합니다.</li>
	<li>셀 subconfluence (80%)에 도달, 3 분 인큐베이터 (37 ° C)에서 0.25 %trypsin 200 µ L 부착 셀 놓고 매체의 4.5 mL을 사용 하 여 반응을 종료.</li>
	<li>신선한 통행 1 매체에서 다시 셀 접시 (α-MEM, 10 %FBS, 페니실린, 100 단위/mL와 스의 100 μ g/mL). 플레이트는 5 × 103 셀 (로 hemocytometer 계산)입니다.</li>
	<li>셀 80% 합류31달성 후 각 후속 통로 수행 합니다. 참고: 처음에, 매체는 붉은 오렌지 있을 것입니다. 약 3 일 후, 중간 색상 노란 그늘을 변경 해야 합니다. 셀의 두 배로 대략 30-40 h, 7 일 3-5 세대에 대 한 필요.</li>
	<li>문화 α-MEM에 고립 된 Pdc 보충 10 %FBS, 페니실린, 100 U/mL 및 100 mg/mL의 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 스.</li>
	<li>세포 성장을 매일 관찰 하 고 두 번 주당 성장 매체를 대체. 제 3-5 세대 세포를 사용 하 여 모든 추가 실험에 대 한.</li>
</ol>2. Cytometry
<ol><li>트립 신 소화를 통해 수확 1 × 106 셀:<ol>
<li>0.25 %trypsin 200 µ L를 추가 합니다. 3 분 후 FBS를 포함 하는 문화 매체의 4.5 mL 사용 하 여 트립 신의 반응을 종결 하 고 원심 분리 (1500 rpm, 5 분, 22 ° C)를 통해 수집.</li>
		<li>3 번 1 x DPBS를 사용 하 여 셀 펠 릿을 세척. 200 µ L 1 x permeabilization 버퍼에 셀 resuspend hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교류 cytometry (형광 활성화 된 세포 분류)32통해 Pdc의 표현 표현된 표면 마커를 검사 합니다. CD19에 대하여 단일 클론 항 체 (MAb)를 사용 하 여 (fluorescein isothiocyanate (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (알렉스), 및 HLA-DR (FITC)32.<ol>
<li>30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 문화와 샘플에 항 체를 추가 합니다.</li>
		<li>1 x DPBS 셀 세 번 씻어.</li>
		<li>2% 포름알데히드를 사용 하 여 셀을 수정 하 고 교류 cytometry 분석32진행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 세포 부착 및 Osteogenic와 생존, Adipogenic, 및 Chondrogenic 차별화
로 셀에 차별화를 유도 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보 특정 차별화 미디어 6-잘 접시에 모든 3 개의 구절에서 periosteal 세포를 배양 하 여.
<ol><li>Osteogenic 차별화 6-잘 문화 접시에 잘 당 5000 세포의 밀도에서 α-MEM에 셀 문화.<ol>
<li>80%의 합류에, α-MEM, 5%를 포함 하는 미디어에 셀 문화 FBS, β-glycerophosphate (10 mM), 10−7 M dexamethasone (0.1 m m), 그리고 의약품의 5 mL (100 uM). Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.</li>
		<li>두 번 주당 미디어를 변경 합니다.</li>
		<li>4 주 후, 문화33석 회화 예금의 존재를 구별 하는 von Kossa 분석 결과 사용 하 여 셀을 얼룩이 여 osteogenic 혈통으로 차별화 하는 세포의 잠재력을 평가 합니다.<ol>
<li>10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 5% 실버 질 산을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 자외선 (UV)에서 취급 합니다.</li>
			<li>추가 5% 나24 4 시간, 3 분 각 반응에 대 한 허용. 마지막으로 증류수로 두 번 셀 세척. 참고: Von Kossa 얼룩은 강 수 반응은 이온과 인산 염이; 산 성 물질의 존재에 반응 이 얼룩 기법 칼슘에 특정 하지 않습니다. 이 연구에서 때 조사 셀 실버 질산염 솔루션, 칼슘으로 치료 했다-는 강한 자외선에 의해 감소 된다-실버, 메탈 릭 실버로 표시 된에 의해 대체 되었다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adipogenic 차별화, α-MEM을 포함 하는 6-잘 문화 접시에 잘 당 5000 세포의 밀도에 세포 문화.<ol>
<li>80%의 합류에, α-MEM, 5 %FBS, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (100mg/mL), 1% 페니실린을 포함 하는 미디어에 셀 문화 10−6 M dexamethasone (1mm), 인슐린 (5 mg/mL), 및 indomethacin (60 mM).</li>
		<li>Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.</li>
		<li>사용 6-9 주 후, 기름 빨간 O 셀 얼룩 및 지질 방울, 그로 인하여 adipogenic 차별화33의 존재 확인을 강조:<ol>
<li>10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 얼룩 0.5% 셀 오일 10 분 동안 실 온에서 붉은 O 고 다음 씻어 3 시간 3 분 동안 60% 소 프로 파 놀과 셀 때마다; 마지막으로, 증류수와 셀 세척. 참고: 기름 빨간 O 중성 지질, 얼룩에 사용 되는 lysochrome (지 용 성) 디 아조 염료는 주로 triacylglycerol, 단백과 콜레스테롤 에스테 르. 염료도 지질 방울은 빨강 셀에 지질 작은 물방울에 녹 인 다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chondrocyte 차별화, 각각 6-잘 문화 접시에 문화 세포 포함 5000 셀 잘.<ol>
<li>차별화 중간 포함 α-MEM, 5 %FBS, 10−7 M dexamethasone (0.1 m m), 나트륨 pyruvate (100 µ g/mL), 인슐린-처리가-셀 렌-A (1 × ITS), 변형 성장 인자-β (10 ng/mL), 및 의약품 (100 µ M)의 5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.</li>
		<li>4-5 주 후 Alcian 블루 얼룩 있다 또는 일부 유형의 chondrocyte 차별화33의 존재를 결정 하는 세포의 연골에서 mucopolysaccharides와 같은 산 성 류를 강조 하기 위해 사용 합니다.<ol>
<li>10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 3% 아세트산을 추가 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다. 그 후, 증류수로 세 번 씻어 30 분 동안 incubated 1 %Alcian 블루 8GX를 추가 하 고 증류수로 씻어. 마지막으로, 3% 초 산 및 3 분, 세척을 추가 하 고 완료를 증류수로 씻어. 참고: 특히 블루가이 염료에 의해 얼룩에 블루 그린 셀 부분의 후 얼룩이 지 고 "alcianophilic" 라고</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 골에 25 Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3)의 효과
<ol><li>6 그룹와 다양 한 문화 미디어 6-잘 접시에 문화 P5 Pdc에 P3 분할:</li>
	<li>음수 그룹 (α-MEM 및 5 %FBS);</li>
	<li>비타민 C 그룹 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C);</li>
	<li>그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).</li>
	<li>각 잘에서 인큐베이터 (37 ° C)에 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 변경 매체 매주 두 번.</li>
</ol>5. 리버스 전사/정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응
<ol><li>상업적인 시 약을 사용 하 여 얼음에 총 RNA 격리 osteoblast 차별화의 7d, 후 ( 재료의 표참조):<ol>
<li>각 잘을 절연 시 약의 1 mL를 추가 합니다. Bromochloropropane의 200 µ L을 추가 하 고 계층화 된 RNA를 생성 하기 위해 10 분 동안 떠나 다음 4 ° c.에 15 분 동안 10000 rpm에서 원심</li>
		<li>원심, 후 표면에 뜨는 포함 RNA의 500 µ L를 2-프로 판 올의 500 µ L를 추가 합니다. 얼음에 RNA 침전 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다.</li>
		<li>절차 후 후 RNA는 튜브의 하단에 4 ° C에서 15 분 동안 12000 rpm에서 원심. 그 후, 세척에 대 한 75% 알콜의 1 mL를 사용 하 여는 상쾌한을 제거 하 고 4 ° C에 8 분 7500 rpm에서 원심</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 진공 집중 장치를 사용 하 여 액체의 바닥에서 RNA를 생산. 물으로 복구.</li>
	</ol>
</li>
	<li>리버스는 RNA 녹음 (1 μ g) 조류 myeloblastosis 바이러스 역전사를 사용 하 여. 마지막으로 4 ° c.에 유지 하기 전에 60 분 그리고 85 ° C 5 분, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 50 ° c 10 분 동안 25 ° C에 실행 되도록 설정</li>
	<li>첫 번째 가닥 보완 DNA (cDNA) 음성 합성. 정량 PCR (정량) 5를 사용 하 여 수행 μ 1:10 희석 cDNA. 양적 RT-PCR (qRT-PCR) 실시 ALP, BSP, OCN, CBFA1, 및 콜라겐-1에 대 한 프라이 머를 사용 하 여. 참고: 신호에 의해 DNA 오염을 방지 하려면 각 뇌관의 정방향 및 역방향 시퀀스 별개 exons에 설계 되었습니다.</li>
	<li>상업적인 PCR 마스터를 사용 하 여 정량 Pcr을 수행 믹스 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라. 2 분 뒤에 10 분 동안 95 ° C 그리고 다음 40 주기 각각 15 95 ° C에서 50 ° C에서 열 cycler 설정 s 60 위한 60 ° C 이어서 s. 참고: SYBR 프로토콜 또한 필요 15 95 ° C에 실행 되는 용융 곡선 단계, s 60 위한 60 ° C s, 그리고 95 ° C 15에 대 한 s.</li>
	<li>ALP, BSP, CBFA1, 사이클 임계값 값을 정상화 콜라겐-1, 그리고 내부 관리 유전자 GAPDH의 OCN. 34
</li>
	<li>뇌관 쌍은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.</li>
</ol>6. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동
<ol><li>앞에서 설명한 기법35, p-nitrophenol; p-nitrophenyl 인산 염 변환을 사용 하 여 셀의 ALP 효소 활동 평가 p-nitrophenyl 인산은 노란색으로 405 nm 파장에서 결정 된 ALP에 의해 dephosphorylated 때 인산 가수분해 효소 기질. 전체 표준화 p-nitrophenol 형성 Bradford 분석 실험에 의해 결정 되는 총 단백질에 따라.</li>
	<li>컨트롤의 ALP 활동 비교 (α-MEM, 5 %FBS), 비타민 C (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), 그리고 비타민 C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C +1,25-(OH)2D3) 그룹의 문화 1, 2, 3, 그리고 4 주 후.</li>
	<li>얼음에서 단백질 추출 절차를 수행:<ol>
<li>6 잘 플레이트에서 세포를 긁어와 세포의 용 해 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다. 그 후, 세포를 파괴 하 고 단백질을 무료로 30 분 얼음에 셀을 놓습니다.</li>
		<li>30 분 후 15 분 동안 4 ° C에서 13000 rpm에서 원심. 원심, 후 저장에 대 한 상쾌한 추출 하 고 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

최근에 개발한 치료 양식 적임, 즉 조직 MSCs, 수 반하는 공학에 수많은 장점이 있습니다. 여러 조직 종류에 있는 MSCs 기능 mesodermal 조직 세포37 의 다양 한 차별화 수 있는 multipotent 셀과 다른 셀 osteoblasts 등 있습니다.
과 조상 세포에 대 한 틈새 시장으로 하며 뼈에 대 한 풍부한 맥 관 구조 공급으로38을 포위 한다. 34 조사 샘플의 우리의 연구에서 20는 성공적으로 58.8%의 성공적인 분리 속도와 MSC 식민지 나왔고. MSCs는과에서 파생 된 그들의 확산 및 osteogenic 분화 능력에 따라이 연구에서 선정 됐다. Periosteal 세포의 확산 속도22골 수 기질 세포 그것 보다 훨씬 높았다. 과의 osteogenic 능력에 관한 Ousual24 과 ...

비록 최근 몇 년 동안에서 수많은 관련 기술 개발 되었습니다, 뼈 재건 남아 여러 제약 조건에 의해 제한 하 고 필요한 재구성의 정도 종종 가능한 추정. 하드 조직 확대는 유리한 장기 성공률 뿐만 아니라 심 미와 기능 목표를 달성 해야 합니다. 이러한 절차에 대 한 일반적으로 사용 되는 방법에는 자생과 allogenic 뼈 접목, xenografting, 및 alloplastic 뼈 접목 포함 됩니다. 뼈 이식의 다양 한 종류 중에서 자생 뼈 이식 가장 효과적으로 간주 됩니다. 그러나, 기증자 사이트 사망률, 손상된 vascularity, 그리고 제한 된 조직 여부1 자생 뼈 접목에 대 한 주요 단점이 있다. 또한, allogenic 뼈 이식 술과 xenografts 되었습니다 관련 질병 전송 된. 현재, 합성 뼈 이식 이러한 문제를 해결 하기 위해 널리 사용 됩니다. 그러나, osteogenic 잠재력의 그들의 부족, 임상 결과 널리 다양 했습니다. 셀 룰 로스 등 재료는 볼륨 변동, 감염, 및 힘의 부족에 연관 된다.
사용 하 여 조직 공학 뼈 확대는 상당한 관심을 생성 했다. 이 기술에서는, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 처음 사용 osteoblast 분화를 촉진 하는 다음 뼈 복구를 달성 하기 위해 뼈 손실의 사이트에 이식 됩니다. 이 절차는 현재 셀에 적용 됩니다. 제한 된 양의 조직 추출 하 여 뼈 재건을 달성은 간단 하 고 덜 침략 다른 방법에 비해입니다.
세포 기반 치료 치과 재생 목적을 위한 도구로 MSCs의 잠재적인 역할은 다양 한 연구 그룹 중 신흥 관심입니다. MSCs는 다음과 같은 유형의 조직에서 분화 될 수 있다 연구 확인: 골 수, 지방, 활 액 막, pericyte, 배수 뼈, 인간의 탯 및 치과 조직2,3. MSCs의 일반적인 소스는 골 수, 지방 조직, 그리고 치과 조직을 포함합니다. 지방 조직과 골 수에서 파생 된 MSCs와 비교는 치과 줄기 세포의 장점은 쉬운 접근성 및 더 적은 사망률 수확 후입니다. 배아 줄기 세포와 비교해, MSCs 치과 조직에서 파생 된 nonimmunogenic 나타나고 복잡 한 윤리적 문제3와 연결 되지 않습니다.
2006 년에, 세포 치료에 대 한 국제 사회 MSCs를 식별 하는 다음과 같은 표준을 사용 하 여 권장: 첫째, MSCs 수 있어야 합니다 플라스틱 연결. 둘째, MSCs CD105, CD73, CD90 표면 항 원에 대 한 긍정적이 고 부정적인 monocytes, 대 식 세포, B 세포는 조 혈 항 CD45와 CD344에 대 한 표식에 대 한 있어야 합니다. 최종 조건으로 MSCs는 다음 세 가지 유형의 차별화 생체 외에서 의 표준 조건 하에서 세포로 분화 할 수 있어야 합니다: osteoblasts, adipocytes, 및 chondrocytes4. 날짜 하려면, 6 종류 인간의 치과 줄기 세포의 고립 된 고 특징 되었습니다. 첫 번째 유형은 인간의 펄프 조직 으로부터 격리 되었고 출생 후 치과 펄프의 줄기 세포5되 나. 그 후, 치과 MSCs의 3 개의 추가적인 종류 고립 되었고 특징: 피부 박피 낙 엽이6,7치 주 인 대, 그리고 꼭대기 시8에서 줄기 세포. 더 최근에, 치과 여 포에서 파생 된9, gingival 조직 파생10, 치과 봉 줄기 cells(DBSCs)11, periapical 낭종 MSCs (hPCy-MSCs)12 도 확인 되었습니다.
세계적은 MSCs13정의 하는 첫번째 이었다. MSCs는 높은 확산 잠재력을 전시 하 고 이식 되 전에 분화를 조작할 수 있습니다 재생 절차10에 대 한 이상적인 후보자 다는 것을 건의 하.
비록 대부분의 연구는 줄기 세포의 원천으로 골 수를 사용 하 고과 파생 된 세포 (PDCs)도 있다14최근에 사용한. 과 골 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 따라서,이 기술을 사용 하 여 치경과 수술 중 추가 절 개에 대 한 필요성을 제거 하 고 환자의 postsurgical 사망률을 줄이기 위해. 과 결합 조직 하는 긴 뼈의 외부 안 대기를 형성 하 고 두 가지 계층으로 구성 됩니다: 외부 섬유 층 섬유 아 세포, 교원 질 및 탄력 있는 섬유15와 직접 접촉에서 내부 셀 풍부한 레이어의 레이어 구성 와 함께 뼈 표면. 레이어의 레이어에 포함 되어 있는 혼합된 셀 인구, 주로 섬유 아 세포16, osteoblasts17,18, pericytes 및 MSCs19,,2021로 식별 하는 중요 한 부분 모집단. 대부분의 연구는 Pdc는 비교를 하지 않을 경우 골 수 유래 줄기 세포 (bMSCs)에서 우수한 뼈 치유와 재생22,,2324을 보고 있다. 과 쉽게 접근할 수 이며 탁월한 재생 효과 전시. 그러나, 몇 가지 연구는과25,,2627에 집중 했다.
뼈 수리에 관한 현재 임상 실습 지원 건설 기계 내에서 증폭 periosteal 조상 세포의 이식 포함 됩니다. 최근 연구는 줄기 세포 결함이 지역에서 취득 하 고 조상 세포 조직 재생20채용에 집중 했다. 치과 의사는 또한 치 주 치료 및 치아에 치 주 뼈 재생의 미래 응용 프로그램을 예상합니다. 기증자 사이트에 대해서는 쉽게 일반 치과 의사에 의해 수확 될 수 있습니다. 이과 일상적인 구강 수술 하는 동안 액세스할 수 있습니다으로 골 수 기질 세포에 대 한 호의적으로 비교 합니다. 따라서,이 연구의 목적은 이다 형태학, 첨부 파일, 생존, 그리고 인간의 줄기 세포의 확산을 평가 하 고 수확 하는 Pdc에 대 한 프로토콜을 설정 하.
비타민 D 대사 산물에는 vivo에서 뼈 미네랄 동적 평형에 영향을. 한 연구 보고는 24R,25-(OH)2D3 활성 형태의 비타민 D 인간의 MSCs (hMSCs)28의 osteoblastic 감 별 법을 위해 필수적 이다. 뼈 항상성 및 수리는 1,25-(OH)의2D3 (calcitriol)은 생물학적으로 가장 적극적이 고 뼈 건강의 규칙에 관련 된 비타민 D3 대사 산물의 네트워크에 의해 규제 됩니다. 비타민 D3 석 회화29필수적 이다. 한 연구 2-d-오래 곤 흰 쥐를 사용 하 여, 쥐에서 embryoid 몸 비타민 C와 비타민 D 보충제 효과적으로 ESC 파생 osteoblasts30의 차별화 추진 표시. 다른 생물의 활동 중 1,25-(OH)2D3 osteoblasts, 모니터링할 수 있는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 효소 활동이 나 OCN 유전자에는 증가에 따라에 hMSCs의 생체 외에서 분화를 자극 식입니다.
몇 연구 뼈 조직 공학에 특정 초점 인간의 Pdc에 결합된 치료 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 복용량 응답 관계를 감지 했습니다. 따라서,이 연구에서 우리는 1,25-(OH)2D3 의 단일 또는 복합 치료에 대 한 최적의 농도 비타민 C 인간의 Pdc의 osteogenic 분화 유도 대 한 검사. 이 프로토콜의 목표는 치과 치경과에서 고립 세포 인구 세포와 MSC 표현 형이이 세포를 문화 (생체 외에서) 확장 하 고 원하는 조직을 형성 하기 위하여 분화 수 여부를 들어 있는지 확인 하는 . 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다. 연구의 두 번째 부분은 Pdc의 osteogenic 활동에 비타민 C와 10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M 1,25-(OH)2D3 의 효과 평가합니다. 이 연구의 주 목적은 ALP 활동과 ALP, 같은 프로 osteogenic 유전자에 의해 Pdc의 osteoblastic 감 별 법 동안 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 기능을 평가 하는 콜라겐 1, OCN, BSP, 및 CBFA1. 또한,이 연구는 이러한 결과에 따라 인간의 Pdc에 대 한 최적의 osteoinductive 조건을 결정 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>35-mm 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>6&nbsp; 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소</td><td>ABI</td><td>Hs01029144_m1</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 활성 비색 분석 키트</td><td>BioVision</td><td>K412-500</td><td></td></tr><tr><td>조류 골수모세포증 바이러스 역전사효소</td><td>Roche</td><td>10109118001</td><td></td></tr><tr><td>CD146</td><td>BD</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560994</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD</td><td>560942</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>BD</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>561088</td><td></td></tr><tr><td>CD73</td><td>BD</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>561974</td><td></td></tr><tr><td>세포 banker1</td><td>ZEAOAQ</td><td>11888</td><td></td></tr><tr><td>코어 결합 인자 알파-1</td><td>ABI</td><td>Hs00231692_m1</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ABI</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 562008 <tr><td>인도메타신</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>sigma</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>인슐린&ndash; 트랜스퍼린&ndash; selenium-A</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)</td><td>Life</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Life</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification</td><td>HyClone</td><td>SH30265.02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>STRO-1</td><td>BioLegend</td><td>340103</td><td></td></tr><tr><td>SYBER Green PCR 마스터 믹스</td><td>AppliedBiosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Master Mix</td><td>Life</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>변형 성장 인자-&베타;</td><td>시그마</td><td>T7039&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트리졸 시약(RNA 분리용)</td><td>Life</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>collagen-1</td><td>Invitrogen</td><td>forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>앞으로 뇌관 5 ' - GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3 반전 뇌관 5 ' - GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3 '</td><td></td></tr> <tr><td>BSP</td><td>Invitrogen</td><td>앞으로 뇌관 5 ' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3 반전 뇌관 5 ' -GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'</td><td></td></tr> <tr><td>상업적인 ALP 뇌관</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>상업적인 CBFA1 뇌관</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 치경과 파생 셀 osteogenic 활동에 비타민 d의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 다양 한 조직에에서 존재 하 고 osteoblasts를 포함 한 여러 세포 유형으로 분화 될 수 있다. MSCs의 치과 소스, 가운데는 레이어의 레이어에서 MSCs를 포함 하도록 확인 되었습니다는 쉽게 접근할 수 있는 조직입니다. 그러나,이 소스는 하지 아직 광범위 하 게 연구 되었습니다.
비타민 D3 와 1,25-(OH)2D3 생체 외에서 MSCs의 차별화를 실현 osteoblasts 자극 입증 되었습니다. 또한, 비타민 C는 콜라겐 형성과 뼈 세포의 성장을 촉진 한다. 그러나, 아무 연구는 MSCs에 비타민 D3 와 비타민 C의 효과 조사 아직 있다.
여기, 우리 인간의 치경과에서 MSCs를 분리 하는 방법을 제시 1,25-(OH)2D3 이 세포에 osteoinductive 효과 발휘 수 가설을 검사 하 고. 우리는 또한 인간의 치경과에서 MSCs의 존재를 조사 하 고 줄기 세포 접착 및 확산 평가. 평가 하기 위해 비타민 C (컨트롤)로 서의 능력 및 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M)의 다양 한 농도 변경 키에 mRNA 생체 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)의 고립 된 MSCs mRNA 표현 뼈 sialoprotein (BSP), 코어 바인딩 요소 알파-1 (CBFA1), 콜라겐-1, 및 osteocalcin (OCN) 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용 하 여 측정 됩니다.

모든 양적 분석 실험에 대 한 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 됩니다. 모든 통계 분석은 학생의 t를 사용 하 여 수행 되었다-테스트. 총, 34 샘플 48.1의 평균 참가자 나이 가져온 ± 12.3 y. 11 이러한 샘플의 남성 환자와 여성 환자에서 23에서 입수 했다. 20-8 샘플 앞쪽 영역;에서 6 어 금 니 지역에서 가져온 26는 maxilla는 mandible에서 8에서 얻은 했다. 치과 절차와 문화 사이의 평균 기간 0.5 ± 0.1 h 이었다. 34 조사 샘플의 20는 성공적으로 58.8%의 성공적인 분리 속도와 MSC 식민지 나왔고. 매개 변수 사이 상당한 차이가 관찰 되었다는 성공적으로 및 실패 격리 된 Pdc (나이 의미: 48.8 ± 13.0 47.1 ± 11.5 y, 성 대: 4 남자 [28.6%], 위치 대 7 남자 [35%]: 13 [92.9%], 대 [75%] 어 금 니 지역에서 15 및 15에서 11 [78.6...

선물이 파생 된 세포 (PDCs) 비타민 C (비타민 C) 및 1, 25-dihydroxy 비타민 D [1,25-(OH)2D3]에 의해 유도 된의 mRNA 식 biomarkers를 조사 하는 프로토콜. 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다.

인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

이 연구의 전반적인 목표는 치조골막에서 채취한 배양된 중간엽 줄기세포에 대한 비타민 D의 골유도 효과를 조사하는 것입니다. 중간엽 줄기 세포의 사용은 지난 10년 동안 치과 분야에서 큰 발전이었습니다. 그들은 치아 조직의 많은 부분에서 성공적으로 분리되고 배양되었습니다.그러나 목표는 폐포 골막에서 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하고 비타민 D 화합물의 골유도 전위를 조사하는 것입니다. 일반적으로 말해서, 이 문제를 처음 접하는 개인은 폐포 골막에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 뼈 형성에 대한 새로운 아이디어 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 실험실 직원이 절차를 시연할 사람은 Miss Hsin-Wen Chi가 될 것입니다. 그녀는 제 연구실의 연구 조교입니다. 먼저 골막 분리기를 사용하여 치과 수술 중 환자로부터 골막 조직을 채취합니다. 약 2 x 5mm 크기의 조각을 모으십시오.조직 조각을 항생제와 함께 DPBS에 보관하십시오. 실험실에서 메스를 사용하여 채취 후 24시간 이내에 폐포 골막 조직 조각을 철저히 다집니다. 다음으로, 적절한 배양 배지에서 35mm 페트리 접시에 조직을 배양합니다.이산화탄소 가스가 5%인 섭씨 37도의 가습 인큐베이터를 사용하십시오. 3일 후, 수집된 골막 조직을 버리고 배지를 변경합니다. 세포가 약 80%까지 증식하면 트립신을 첨가하여 배양된 세포를 분리합니다.그리고 3분 동안 배양을 배양합니다. 그런 다음 0.8ml의 매체를 추가하여 분리를 종료합니다. 모으고 세는 후에, 5, 판 당 1개의 밀리리터에 있는 000의 세포를 배부하십시오.이 단계에서 도금된 셀을 1번 통로로 표시합니다. 이 세포를 배양하고 80% 합류점으로 증식한 후 다시 분리합니다. 통로 1이 있는 매체는 처음에는 주황색/빨간색입니다.3일 후 매체가 주황색으로 변하기 시작하면 변경합니다. 통로 1 세포가 80% 합류점에 도달하면 제로 세대에서 1 세대를 준비하는 데 사용 된 것과 동일한 절차를 반복하여 2 세대에서 5 세대 세포를 만듭니다. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.4주 후, 현미경으로 세포의 형태를 관찰하여 세포가 골형성 계통으로 분화할 수 있는 가능성을 평가합니다. von kossa assay를 사용하여 세포를 줄기 세포에 주입합니다. 이 분석법은 귀하의 배양에서 석회화된 침전물의 존재를 구별합니다.PBS로 세포를 씻고 10 % 포르말린 1 밀리리터로 30 분 동안 고정합니다. 그 후, 포르말린을 제거한 다음 세포를 씻고 5 % 질산은으로 처리하십시오. 세포를 1시간 동안 자외선에 노출시킵니다.다음으로, 질산은을 제거하고 2ml의 5% 황산나트륨으로 세포를 3분씩 4회 처리합니다. 치료 사이에 용액을 교체하십시오. 마지막으로 증류수를 사용하여 세포를 두 번 씻습니다.34개의 골막 조직 샘플 중 20개에서 골수 유래 줄기세포 콜로니를 성공적으로 산출했습니다. 기증자와 관련된 어떤 요인도 배양 성공에 큰 영향을 미치는 것으로 밝혀지지 않았다. 처음에 PDC는 원형 세포와 방추형 세포가 혼합된 군체와 구형 클러스터를 형성했습니다.첫 번째 통과 후, 세포는 방추체 모양을 가진 균질하게 섬유아세포와 같았습니다. 골형성 분화가 끝날 때, 폰 코사(von kossa) 분석법은 칼슘 침전물 및 골형성 분화의 존재 가능성을 나타냈습니다. 이러한 결과는 골막세포 집단 중에서 전구 세포가 골형성 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 강력하게 나타냅니다.골형성 전구세포는 또한 Calcitriol로 처리하고 RTPCR을 사용하여 세포의 조기 골형성 분화를 위한 강력한 지표인 알칼리성 인산가수분해효소의 발현 수준을 평가하기 위해 검사했습니다. 비타민 C와 비타민 D의 활성 대사 산물인 칼시트리올의 치료는 모두 알칼리성 인산가수분해효소 발현을 증가시켰습니다. 또한, 콜라겐 원 mRNA 수치 발현은 동일한 치료에 대한 반응으로 증가했다.뼈 sialoprotein mRNA의 발현은 더 높은 농도의 Calcitriol로 처리된 세포에서 증가하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나, CBFA 1 및 ostocalcium mRNA 발현은 치료에 반응하지 않았다. 이 비디오를 시청한 후 청중은 인간 폐포 골막의 광물화 및 배양 프로토콜에 대해 잘 이해해야 합니다.일단 숙달되면, 이 과정을 제대로 수행한다면 4-5주 안에 끝낼 수 있다. 이 실험을 시도할 때 세포 오염을 방지하기 위해 신중하고 멸균된 기술을 사용하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells(쥐 턱뼈 골수 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 기법)

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개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

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