Name: 화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 배우세요 Schmidtea mediterranea 평형동물의 인두를 선택적으로 제거하는 화학 절단법을 통해 재생 생물학에서 줄기세포가 장기 손실을 인식하고 재생을 시작하는 메커니즘을 연구하는 방법을 알아보세요.

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우리는 감사 알 산체스 알 바로, 초기 최적화 및이 기술 개발을 지원 하 고 싶습니다. 캐롤 린 애 들러의 실험실에 일 코넬 대학 시작 기금에 의해 지원 됩니다.

1입니다. 준비
<ol><li>
Planaria 물 준비 17<ol>
<li>1 X Montjuïc 소금 솔루션에서 planarians을 유지 관리 합니다. 준비 planarian 물, 개별 재고 솔루션 1 M CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl과 초순에 5 M NaCl을 확인 합니다. 필터-0.2 µ m 병 맨 filterfor 장기 저장과 소독. 참고: (25 ° C에서 18.2 m ω의 저항)와 초순 이온을 제거 된 물만을 사용 하 여 준비 계곡이 소금.</li>
		<li>5 X 소금 솔루션의 1 리터 재고를 준비 하려면 1 M CaCl2, 1m MgSO4, MgCl2, KCl과 900 mL 초순에 5 M NaCl 솔루션의 1.6 mL 0.5 mL의 0.5 mL의 5 mL의 5 mL을 결합 합니다. 이 솔루션에 NaHCO3 0.504 g를 추가 하 고 섞어 저 어. 염 산 7.0에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>두이 일 농도 대용량 유리병 등 무 균 용기에 초순에 X 1 재고 솔루션 배 희석 ( 재료의 표참조). 이 1 배 솔루션을 사용 하 여 성별이 없는 planarians를 유지 하기 위한. 참고: 계곡이 소금 솔루션, 사용 하 여 로컬로 구입한 봄 물 또는 상용 수족관 소금 포함 된 초순 농도 of0.5 g/L18( 재료의 표참조)를 혼합.</li>
		<li>정적 문화19에 세균 감염을 방지 하기 위해 항생제를 포함 하는 물에서 planarians을 유지 관리 합니다. 50 mg/mL 초순에 gentamicin 황산의 재고 솔루션을 준비 하 고 필터를 소독. 동물 유지는 컨테이너, gentamicin 황산 50 µ g/mL (1:1000 희석)의 최종 농도에 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
간 붙여넣기의 준비
	<ol>
<li>Planarians 유기의 다이어트에 성공할 풀을 먹이 쇠고기 간, 구매 신선한 간 고 24 h. 프로세스 제거 부드럽게 벗 여 간 캡슐화 막 캡슐. 간 ~ 1 cm 조각으로 잘라 하 고 블레이드를 사용 하 여 다쳤어요을 모든 간 정 맥과 동맥을 삭제.</li>
		<li>Macerate 간 조각 음식 밀 또는 푸드 프로세서를 사용 하 고 와이어 메쉬 음식 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 과자 봉지에 결합 하 고 주사기 또는 35 mm 페 트리 접시로 분배. 수 유, 전에 기포 제거를 부드럽게 원심.</li>
		<li>간 1 년 및 이전에 사용 하 여 해 동-80 ° C에서의 aliquots를 저장 합니다. 녹고, 후 다시 한 번, 어떤 남은 간 동결 또는 24 h까지 4 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동물의 유지 보수
	<ol>
<li>Planarians는 성장 하 고 먹이 기의 주파수에 따라 다양 한 크기로 축소 됩니다. 피드 planarians 모든 다른 주 (14 일에 한 번). 장기적인 대량 문화에 대 한 ( 재료의 표참조) 다양 한 크기의 플라스틱 용기를 사용 합니다.</li>
		<li>동물 먹이 상자에 간 한 완두콩 크기의 방울을 배치 하는 금속 주걱 또는 플라스틱 전송 피펫으로 사용 합니다. 동물 상자를 청소 하기 전에 1-2 헤 제거 나머지 음식 먹을 수 있습니다.</li>
		<li>먹이 하지 않을 경우 벌레 먹이 (직접 수 유 후 한 번 그리고 한 번 2 일 후), 면 주 2 회 또는 주 1 회 청소. 청소, 상자에서 planarians를 유지 하면서 신중 하 게 물을 붓는 의해 플라스틱 비 커에 물을 드레인. 상자 표면 종이 타월로 닦아 다음 상자는 깨끗 한 때까지 모든 면에서 반복.</li>
		<li>물 (약 ¾ 상자 볼륨)를 장착 하 고 50 µ g/mL의 최종 농도에 gentamicin 추가. 어두운 캐비닛에 또는 20 ° C 배양 기에서 동물을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
벌레의 선택
	<ol>
<li>5-7 일 이전 지 루 했다 벌레를 선택 합니다. 참고: 그것은 훨씬 더가 최근 (1-2 일전 절단) 먹이 벌레에서 pharynges 절단 어렵다. 먹이 동물 또한 더에 민감합니다 나트륨 아 지 드.</li>
		<li>벌레는 약 6 m m 길이 선택 합니다. 벌레의 크기를 예측 하려면 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 배양 접시에 그것을 전송. 플랫 6-에서 눈금자 또는 페 트리 접시 아래 5 x 5 mm 방안 놓고 그것을 크롤 링 하는 동안 벌레 길이 측정 합니다. 참고: 길이 6 m m 보다 작은 벌레는 절단 하기 더 어렵다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나트륨 아 지 드의 준비
	<ol>
<li>나트륨 아 지 드 가루 planaria 물에 용 해 하 여 100 m m 솔루션을 준비 합니다. 주의: 나트륨 아 지 드 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다. 나트륨 아 지 드 구로 버리지 마십시오. 다음 사용 하 여, 개별적으로 유해 폐기물 처리에 대 한 수집.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 인 두 절단
<ol><li>장소는 직경 35 mm 페 트리 접시에에서 벌레. 조심 스럽게 플라스틱 전송 피펫으로 사용 하 여 접시에서 모든 planarian 물 제거. 참고: 20 6 mm 웜 최대이 크기의 접시에 편안 하 게 가질 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 아래 접시를 놓고 여러 벌레를 동시에 볼 수 있도록 확대 조정 (예: 10 배 확대). 100mm 나트륨 아 지 드 솔루션에 planarian 물을 바꿉니다. 참고: 35 mm 페 트리 접시, 나트륨 아 지 드의 약 5 mL는 충분 합니다. 솔루션에는 planarians 잠수함 완전히 한다. 필요에 따라 더 큰 접시를 위한 솔루션 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>현미경 및 이동 하는 첫 번째 3-4 분 요리에서 후 렴에서 동물을 모니터링 합니다.</li>
	<li>인 두의 돌출; 현미경을 통해 관찰 인 두 인 두 주머니에서 밀려 나 되며 완전히 확장 (길이 약 1 m m) 그림 1B와 같이. 참고: 그것은 인 두 더 진행 하기 전에 완전히 확장 완료 될 때까지 대기 하는 것이 중요입니다. 인 두는 동물에서 나온다, 일단 전체 확장 약 1 분 걸립니다.</li>
	<li>사용 하 여 플라스틱 전송 피펫으로 접시 주위 동물 물 총. 피펫으로에 동물을 빨 아 하 고 강제로 그들을 풀어 접시에 몇 번. 이 활기찬 pipetting 인 두 완전히 확장, 분리를 발생 합니다.</li>
	<li>그림 1C와 같이 또는 그것의 길이 따라 세로 또는 가로로 미세 집게 ( 재료의 표참조)의 쌍을 사용 하 여 그것의 둘레에 따라 인 두를 파악. 집게에 슬쩍 하는 인 두와 함께 위쪽으로 초승달 모양으로 동물을 들어올립니다. 동물 발생으로 표면 장력 동물 로부터 분리 하 인 두를 발생 합니다. 참고: 강력한 소용돌이 없는 적절 한 작은 동물 (1-3 m m 길이)의 pharynges를 제거 하려면이 메서드를 사용할 수 있습니다. 파고 또는 다른 동물의 신체 부상 하지 마십시오.</li>
	<li>전송 피펫으로 사용 하 여 신선한 planaria 물을 포함 하는 새로운 요리를 절단된 동물을 이동 합니다.</li>
	<li>일단, 절단된 동물 planaria 물, 완전히 교환 물 세 번에 철저 하 게 린스. Gentamicin의 50µg/mL와 planaria 물을 포함 하는 새로운 접시에 전송. 참고: 이러한 세 가지 세척 하는 동안 완전 한 버퍼 교환 나트륨 아 지 드의 제거를 위해 필수적입니다.</li>
	<li>다음 날, 신선한 planaria 물 gentamicin의 50 µ g/mL를 포함 하는 접시에 물을 바꿉니다. 그 후 모든 다른 일을 반복 합니다.</li>
</ol>3입니다. 절단 후 인 두 제거의 평가
<ol><li>그림 2A와 같이 어두운 장소는 인 두의 성공적인 제거 후 등장 했다 여부 결정 (10-20 배 확대)와 현미경 동물을 검사 합니다.</li>
	<li>또는, 수정 하 고 표 백제 피어슨 연구진이 설명 하는 프로토콜에 따라 동물 20. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 streptavidin 붙일 활용에 하룻밤 담가 동물 (1 mg/mL 희석 1: 500 X 0.3%를 포함 하는 인산 염 Buffered 염 분 1에 트리톤 X). 80% glycerol/20% 1 X 인산 Buffered 염 분 및 형광 stereomicroscope (그림 2B) 아래 이미지에에서 슬라이드에 동물을 탑재 합니다. 참고: 이 원고에 있는 모든 이미지는 1.0 X 목적으로 형광 stereomicroscope에 체포 했다.</li>
</ol>4. 먹이 행동을 측정 하 여 인 두 중생의 평가
<ol><li>
간의 준비
	<ol>
<li>Microcentrifuge 또는 원뿔 튜브로 간 붙여넣기의 필요한 수량을 전송 합니다. 짧게 공기 방울을 제거 하려면 회전. 간, 양을 견적 하 고 그 볼륨의 1/5와 빨간 식용 색소의 총 볼륨의 2 %planaria 물 추가. 예를 들어 1000 µ L 간 붙여넣기를 planaria 물 200 µ L 24 µ L의 식용 색소를 추가 합니다.</li>
		<li>Using 플라스틱 유 봉, 피 펫 팁 또는 금속 주걱, 식용 색소는 간 붙여넣기에 고르게 분포 되어 때까지 철저 하 게 혼합. 다시 짧게 스핀. 간 붙여넣기 24 h 4 ° C에서 저장 하거나 장기 저장을 위한-80 ° C에서 aliquots에 동결 될 수 있습니다.</li>
		<li>최대 25 동물 테스트, 접시 (약 1 µ L 당 동물 간 붙여넣기의) 당 간 붙여넣기의 25 µ L를 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동물 먹이
	<ol>
<li>화학 절단 후 7 일 새로운 배양 접시에 동물을 전송. 10-15 동물 테스트를 사용 하 여 35mm 접시; 15 동물 60 mm 페 트리 접시에 시험 되어야 한다. 어둠 속에서, 그대로, 약 1 시간 전에 수 유에 대 한 동물을 유지.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여, 좁은 엔드의 ½ cm 대략 트리밍에 의해 P200 피 펫 팁의 너비를 늘립니다. 피펫으로 25 µ L의 접시에 빨간 간 붙여넣기. 참고: 트리밍 끝 pipetting 점성 간 붙여넣기 쉽게 만든다. 간 표면에 떠 있는 않도록 분배 하는 동안 접시의 바닥에 팁을 터치 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 먹을 동물을 수 있습니다.</li>
		<li>흰색 바탕에 동물을 배치 하거나 10-20 배 확대 현미경 아래에서 그들을 검토 하 여 먹은 동물의 수를 점수.</li>
		<li>수 유, 후 간 접시에서 제거 하 고 청소 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 나트륨 아 지 드를 사용 하 여 인 두의 선택적 절제 하는 방법을 설명 합니다. Planarians에 다른 대상된 제거 연구 대뇌21 또는 약리 치료 dopaminergic 신경22ablate을 제거 하려면 수정된 수술을 사용 했습니다. 기존 방법에 비해 화학 절단의 중요 한 장점 중 하나입니다 그것은 수술을 요구 하지 않습니다. Planarian 시체의 나머지 부분에 비해 인 두의 경직 된 구조는 훨씬 부드러운 바디는 동물에서의 완전 한 제거를 촉진 한다. 또한, 인 두 인 두과 소장, 생성 하는 큰 수술 도구에 의해 유도 된 하나 보다 더 재현 상처 작은 접합 (식도)30 동물에서 분리 합니다. 그것의 물리적 특성 및 동물의 나머지 부분에 작은 해 부 연계를 바탕으로, 인 두 제거 따라서 다른 수술 사지 보다 더 균질 상처 생성 합니다.
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재생 재생 용량 전신 재생 특정 무척 추 동물에서에서 척추1에서 더 제한 된 능력에 이르기까지 동물의 왕국에 걸쳐 발생 하는 현상입니다. 교체 기능 조직의 복잡 한 과정이 고 종종 여러 종류의 세포 동시 복원을 수반 한다. 예를 들어 도롱뇽 다리, osteoblasts, chondrocytes, 신경, 근육, 그리고 될 필요가 상피 세포를 다시 생성 하려면2를 대체 합니다. 이 새로 생성 된 셀 형식 또한 새로운 다리 기능을 촉진 하기 위하여 제대로 구성 해야 합니다. 이러한 복잡 한 프로세스를 이해 기법을 재생 특정 세포 유형 및 기관으로의 통합에 초점을 해야 합니다.
재생 반응의 연구를 단순화 하기 위해 고용 전략 중 하나입니다 대상된 제거 중 특정 종류의 세포 또는 조직의 더 큰 컬렉션. 예를 들어 zebrafish, 표현의 특정 셀에 nitroreductase 그들의 파괴 후에 metronidazole3,4의 응용 프로그램을 리드. 초파리 애벌레에서 조직의 특정 발기인에서 프로-apoptotic 유전자 표현 imaginal 디스크5,6의 특정 지역 ablate 선택적으로 수 있습니다. 모두 이러한 전략의 손상을 신속 하지만 제어, 그리고 분자 및 세포 재생에 대 한 책임 메커니즘을 해 부에 사용 되었습니다.
이 원고에서 우리는 선택적으로 ablate planarian Schmidtea 서인 두 라는 전체 장기 하는 방법을 설명 합니다. Planarians는 그들의 다 작의 재생 능력에 대 한 알려진 중생의 클래식 모델도 분 조각 전체 동물 7,8을 regrow 수 있습니다. 그들은 줄기 세포를 만능 세포와 혈통 제한 창시자9,,1011의 구성의 큰, 이질적인 인구가 있다. 이 세포는 증식 하 고 인 두, 신경, 소화 및 배설 시스템, 그리고 근육과 상피 세포9,,1012를 포함 하 여 모든 누락 된 조직을 대체 하 차별화 합니다. 우리가 알고 있지만 이러한 줄기 세포 재생을 시작, 우리가 완전히 이러한 모든 다른 세포 유형 대체 몰아 분자 메커니즘을 이해 하지 않습니다. 정확한 줄기 세포 응답을 이끌어내는 정의 부상 방법이 복잡 한 과정의 윤곽을 그리 다 수 있습니다.
인 두, 수 유에 필요한 대형 원통형 튜브 이며, 신경, 근육, 분 비 상피 세포13,29를 포함 합니다. 일반적으로 동물의 복 부 측에 주머니에 숨겨져, 동물의 단일 신체 식품의 존재를 감지 시 열기를 통해 확장 합니다. 선택적으로 인 두를 절단, 하 우리 라는 화학 나트륨 아 지 드, 선 충 C.14,,1516에 일반적으로 사용된 마 취에서에서 planarians를 담근 다. Planarians에 그것의 사용 처음 애 들러 외에 의해 보고 되었다., 2014 년12. 나트륨 아 지 드에 노출의 몇 분 안에 planarians 돌출 그들의 pharynges, 그리고 부드러운 동요와 인 두 동물에서 분리. 우리는 인 두의이 완전 하 고 선택적 손실 "화학 절단"로 참조 하십시오. 1 주일 후 절단, 완전 한 기능 인 두 복원된12입니다. 인 두 먹이 기를 위해 필요 하기 때문에, 기능 재생 먹이 행동을 모니터링 하 여 측정할 수 있습니다. 아래, 우리는 화학 절단 및 인 두의 재생 및 복원의 먹이 행동을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>염화칼슘 이수화물 (CaCl2)</td><td>피셔 케미컬</td><td>C79-3</td><td>Montju&iuml; c 염 용액</td></tr><tr><td>: 황산 마그네슘, 무수 (MgSO 4)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju &iuml; c 염 용액</td></tr><tr><td>염화 마그네슘 육수 화물 (MgCl2)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&iuml; c 염 용액</td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td> <td>Acros Organics / VWR</td><td>196770010</td><td>Montju &iuml; c 염 용액</td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td> <td>Acros Organics / VWR</td><td>207790050</td><td>Montju &iuml; c 염 용액</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨 (NaHCO3)</td> <td>Acros Organics / VWR</td><td>123360010</td><td>Montju &iuml; c 소금 용액</td></tr><tr><td>Nalgene 오토클레이브 가능 폴리 프로필렌 공중 합체 lowboy with spigot</td><td>ThermoFisher Scientific / VWR</td><td>2324-0015</td><td>플라나리아 물</td></tr><tr><td>저장 인스턴트 오션 바다 소금</td><td>스펙트럼 브랜드</td><td>아마존</td><td>플라나리아 물</td></tr><tr><td>겐타마이신 황산염</td><td>쌍둥이 자리 바이오 제품</td><td>400-100P</td><td>플라나리아 물</td></tr><tr><td>면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71970</td><td>다진 간&nbsp;</td></tr><tr><td>일회용 페이스트리 백-16", 12</td>팩 <td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>간 부분 표본</td></tr><tr><td>5mL 주사기</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>간 부분 표본</td></tr><tr><td>페트리 접시-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 용기(다양한 크기)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Housing 정적 배양의 플라나리아</td></tr> 아<tr><td>지드</td><td>나트륨 시그마</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>글로브 사이언티픽</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>펜치 - Dumont 핀셋, 스타일 5</td><td>전자 현미경 과학&nbsp;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr>, <tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 접합체</td><td>, ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr>, <tr><td>글리세롤</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

화학 절단 및 planarian schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians는 flatworms는 중생에서 매우 효율적인. 그들은 빚이 수 많은 부상의 모든 종류에 신속 하 게 응답할 수 있는 줄기 세포. 이 동물에 일반적인 부상 모델 조직, 여러 장기를 손상의 다량을 제거 합니다. 극복 하기 위해이 광범위 한 조직 손상, 여기 planarian Schmidtea 지중해에서 단일 기관, 인 두를 선택적으로 제거 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 시 토 크롬 산화 효소 억제제 나트륨 아 지 드를 포함 하는 솔루션에 몸을 담글 동물에 의해 이것을 달성. 나트륨 아 지 드에 짧은 노출 우리가 "화학 절단" 이라고 부르는 동물에서 인 두의 돌출을 하면 화학 절단 전체 인 두를 제거 하 고 작은 상처 인 두 소장에 연결을 생성 합니다. 광범위 한 rinsing 후 모든 절단된 동물 약 1 주일에서 완전 한 기능 인 두를 다시 생성 합니다. 줄기 세포는 시체의 나머지 부분에서 새로운 인 두의 재생 드라이브. 여기, 우리는 자세한 제공 화학 절단에 대 한 프로토콜 및 성공적인 절단 및 중생을 평가 하기 위해 조직학 및 행동 방법을 설명.

나트륨 아 지 드에 노출 동물 스트레칭 하 고 몸부림을 일으키는 planarians의 정상적인 운동 성 방해. 이러한 움직임은 동물의 복 부 측에서 등장 하는 인 두 고 나트륨 아 지 드 솔루션에서 약 6 분, 후 인 두의 흰색 팁을 볼 수 있다 (그림 1B-왼쪽된 패널). 몇 분 후, 동물 적극적으로 계약 하 고 완전히 몸 밖으로 강제로 그것을 추진 하 여 인 두를 확장. (그림 1B-중간 패널). 약 아 지 드 노출 후 11 분, 동물 및 인 두 긴장. 이 단계에서 인 두의 특성 종 형태는 명확 하 게 보이는 (그림 1B-오른쪽 패널). 쉽게 절단에 대 한 긴장을 인 두에 대 한 기다려야 중요 하다.
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Schmidtea 서 planarian 줄기 세포 및 조직 재생을 공부에 대 한 우수한 모델입니다. 이 게시는 선택적으로 한 기관, 인 두, 화학 나트륨 아 지 드를 동물을 노출 하 여 제거 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 또한 인 두 재생을 모니터링 하기 위한 방법을 설명 합니다.

화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

이 절단 절차의 전반적인 목표는 다른 장기를 손상시키지 않고 플라나리아에서 인두를 선택적이고 완전히 제거하는 것입니다. 이 방법은 재생 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 줄기세포가 누락된 장기를 인식하고 재생을 시작하는 방법 등입니다.이 기술의 가장 큰 장점은 매우 정확하고 그 과정에서 다른 장기가 손상되지 않는다는 것입니다. 제가 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올린 것은 아지드화나트륨으로 플라나리아를 마취시킬 때였습니다. 나는 아지드화나트륨에 노출되면 인두가 튀어나오는 것을 알아차렸다.절단 수술을 위해서는 동물의 적절한 선택과 동물의 움직임과 형태에 대한 신중한 관찰이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Divya Shiroor입니다. 절차를 시작하기 전에 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 5-7일 전에 깨끗한 페트리 접시에 먹인 벌레를 선택합니다.페트리 접시 아래에 평평한 자를 놓고 각 플라나리아가 접시를 가로질러 기어 다닐 때 길이가 최소 6mm인지 확인합니다. 그런 다음 선택한 지렁이 최대 20개를 35mm 페트리 접시에 옮기고 전사 피펫을 사용하여 접시에서 플라나리아 물을 모두 제거합니다. 접시를 실체 현미경 아래에 놓고 여러 동물을 볼 수 있도록 배율을 조정합니다.갓 준비한 100밀리몰의 아지드화나트륨 용액 5ml를 접시에 넣습니다. 인두의 돌출을 관찰하기 위해 3-4 분 동안 접시를 움직이지 않고 동물을 모니터링하십시오. 접시에 담긴 동물의 절반 이상이 인두를 완전히 확장하면 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 접시 주위의 벌레를 흡인하고 강제로 몇 번 분배합니다.인두가 완전히 확장된 경우 이 격렬한 피펫팅으로 인해 인두가 분리됩니다. 또는 한 쌍의 가는 집게를 사용하여 인두를 잡고 플라나리아를 반월판 쪽으로 위로 들어 올립니다. 동물이 자랄 때 표면 장력으로 인해 인두가 분리됩니다.인두를 움직이는 동안 동물이 우발적으로 다치지 않도록 주의해야 한다. 플라나리아는 몸체가 매우 부드럽고 특히 아지드화나트륨에 있을 때 쉽게 손상됩니다. 이송 피펫을 사용하여 약 15마리의 절단된 동물을 신선한 플라나리아 물이 담긴 새 접시에 넣고 신선한 플라나리아 물로 벌레를 세 번 헹굽니다.아지드화나트륨을 완전히 씻어내십시오. 화학 물질의 흔적조차도 동물을 용해시킬 수 있습니다. 그런 다음 섭씨 20도에서 7일 동안 벌레를 배양합니다.절단 다음 날, 벌레를 다시 현미경 아래에 놓고 벌레의 등쪽에 검은 점이 보이는지 확인합니다. 기생충에게 먹이를 주려면 적당량의 간 페이스트를 미세 원심분리기 튜브에 옮기고 튜브를 잠시 원심분리하여 기포를 제거합니다. 페이스트 펠릿의 부피를 추정한 후, 플라나리아 물을 부피의 1/5에 첨가합니다.튜브의 총 부피에 따라 2%의 빨간색 식용 색소를 추가합니다. 염료가 페이스트 전체에 고르게 분포될 때까지 식품 샘플을 철저히 혼합하고 튜브를 다시 간단히 원심분리합니다. 절단된 동물을 새 페트리 접시에 옮겨 넣고 약 1시간 동안 어두운 곳에 두십시오.배양이 끝나면 P200 피펫 팁 끝에서 약 1/2cm 떨어진 곳을 자르고 수정된 팁을 사용하여 25마이크로리터의 붉은 간 페이스트를 접시에 옮깁니다. 동물들이 30분 동안 먹이를 주도록 합니다. 그런 다음 흰색 배경에 벌레를 배치하여 빨간색으로 나타나는 동물의 수에 점수를 매깁니다.아지드화나트륨 용액에서 약 6분 후 인두의 흰색 끝을 볼 수 있습니다. 몇 분 후, 동물들은 적극적으로 수축하여 인두를 몸 밖으로 강제로 배출한다. 약 11분 동안 아지드화물에 노출된 후, 동물들은 긴장을 풀고 인두의 특징적인 종 모양이 명확하게 보이게 됩니다.이제 절단할 준비가 되었습니다. 색소가 없는 이 큰 조직 덩어리를 제거하면 절단된 동물의 등쪽에 검은 반점이 나타납니다. 인두 재생을 보다 정확하게 모니터링하기 위해 동물을 형광 접합 스트렙타비딘으로 하룻밤 동안 염색할 수 있습니다.식용 색소와 간 페이스트를 결합하면 먹는 동물과 먹지 않는 동물을 구별할 수 있습니다. 그런 다음 기능적 인두를 가진 동물의 비율을 평가하기 위해 적색 동물의 수를 정량화할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 20분 또는 30분 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때, 절단이 언제 시작되어야 하는지 정확히 파악하기 위해 플라나리아의 움직임을 주의 깊게 관찰하는 것을 잊지 마십시오. 선택적 절단은 줄기세포가 재생을 달성하기 위해 적절한 계통 결정을 시작하는 방법과 같은 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오는 아지드화나트륨을 사용하여 인두를 선택적으로 제거하는 방법에 대한 좋은 이해를 제공합니다.아지드화나트륨으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있습니다. 항상 장갑을 끼고 다루고, 폐기물을 적절하게 버리고, 실험 후에는 작업 공간을 청소하는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

살아있는 동물 이내에 줄기 세포 차별을 공부에 대한 매력적인 모델은 planarian의 flatworm입니다. 재생 쉽게 기본적인 실험실에서 수행하는 간단한 절단 실험에서 공부하고 약리 및 유전...

약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> Dugesia</em

planaria 사이에 정의하고 일관성있는 크기의 조직을 접목을위한 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 또한 이식에 사용되는 고정 기법이 살아있는 동물의 부분 조사를위한 리드 방패와 함께, 적응하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다.

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

여기에서는 자포동물(cnidarian anthozoan) 모델인 Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis에서 재생을 유도하고 모니터링하는 방법을 보여줍니다.  형태학적 병기 결정 시스템을 사용하여 재생을 절단하고 분류하는 방법을 보여주며, 이 시스템을 사용하여 폴립 구조 재생에서 자가포식에 대한 요구 사항을 밝힙니다.

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도 Nematostella의 vectensis

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초파리 혈액 세포 또는 혈구는 거주 부위와 순환 사이를 순환합니다.  유충에서 상주(고착성) 혈구는 유도성 미세환경인 Hematopoietic Pockets에 국한되는 반면, 순환하는 혈구는 혈림프에서 자유롭게 움직입니다. 이 프로토콜의 목표는 행동적으로 다르지만 상호 변화하는 이 두 가지 혈구 집단의 표준화된 분리 및 정량화입니다.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

배우세요 Schmidtea mediterranea 평형동물의 인두를 선택적으로 제거하는 화학 절단법을 통해 재생 생물학에서 줄기세포가 장기 손실을 인식하고 재생을 시작하는 메커니즘을 연구하는 방법을 알아보세요.

화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

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