Name: Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 Cryptococcus neoformans의 다당류 캡슐을 염색하고 직경을 측정하는 방법을. 인도 잉크와 형광 염색을 활용한 이 기법은 병원성 연구에 필수적인 정확한 시각화와 자동화된 분석을 가능하게 합니다.

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우리 감사 생물학과 분자 생물 과학 (MOBI) 박사 중간 테네시 주립 대학 (MTSU)에이 연구에 대 한 자금 제공. 프로젝트 또한 MTSU 재단에 의해 D.E.N.에 게 수 여 특별 한 프로젝트 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다.

참고: C. neoformans Biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 이며 연구자 작업 적절 한 예방 조치를 취해야 합니다. 상세한 절차 어떻게에 안전 하 게 BSL-2 병원 체와 함께 작업에서 찾을 수 있습니다 중앙 질병 관리국 (CDC)에 웹사이트, 하지만 그것은 C. neoformans 의 접촉으로 오는 모든 사람 제대로 처리에서 훈련 되어야 한다 병원 성 대리인 및 적절 한 개인 보호 장비 (PPE), 일반적으로 라텍스 또는 니트 릴 장갑을 항상 착용 해야 합니다. 또한, 샘플 및 어떤 유출2810% 표 백제 솔루션 사용 하 여 즉시 정리의 aerosolization를 방지 하기 위해 원심 분리기에로 터를 봉인 한다.
1. 캡슐 유도
참고: 모든 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>C. neoformans 효 모 펩 포도 당 (YPD) 국물 (pH 6.5 ± 0.2)에서 문화 그리고 로그 단계 (약 18-36 h) 때까지 떨고와 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>870 x g 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)로 세 번 세척.</li>
	<li>사용 하 여 셀을 계산 하 여 Dulbecco의 최소한의 필수 미디어 (DMEM)에서 2 × 105 셀/2 mL에 resuspend는 hemocytometer (또는 자동화 된 셀 카운터).</li>
	<li>캡슐을 유도를 37 ° C, 5% CO2 18 h에서 품 어. 참고: 미디어에 영양소의 부재와 CO2 의 존재의 조합 C. neoformans 캡슐 성장을 자극.</li>
	<li>후 보육 (위에서) centrifuging 표면에 뜨는 모든 하지만 5-10 µ L을 제거 하 여 세포를 수확. 동시에 각 스트레인 측정에 대 한 해당 취소 유발된 셀 샘플을 수확. 이러한 부정적인 컨트롤을 사용 합니다. 참고: 셀 펠 릿 아주 작은 되며 볼 하기 어려울 수 있습니다. 상쾌한 발음 할 때 주의 해야 합니다.</li>
	<li>인도 잉크 (섹션 2.1) 또는 형광 염료 (섹션 2.2) 얼룩.</li>
</ol>2. 얼룩
<ol><li>
만 인도 잉크 얼룩
	<ol>
<li>인도 잉크와 누 룩 얼룩, 나머지 상쾌한에 펠 릿을 resuspend와 4μL를 추가 (약 절반) 세포 현 탁 액 및 유리 현미경 슬라이드에 인도 잉크의 4μL의. 부드럽게 혼합 하 고 거품을 방지.</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 비-독성 실 란 트 (투명 매니큐어) 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 가장자리를 밀봉 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 염료와 염색
	<ol>
<li>형광 염료와 누 룩 얼룩, 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 50 µ L PBS에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>Calcofluor 화이트 (CFW)의 동등한 양으로 문화를 품 어 (1 µ g/mL) 및 캡슐 mAb 18B7 AlexaFluor488을 활용 ( 재료의 표참조) (AF488) (10 µ g/mL) 37 ° c.에 30 분</li>
		<li>870 x g 후 보육 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 하 고 상쾌한 발음.</li>
		<li>1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 10 µ L PBS에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>유리 현미경 슬라이드에 세포 현 탁 액의 8 µ L 플라스틱</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 비-독성 실 란 트 (투명 매니큐어) 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 가장자리를 밀봉 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인도 잉크와 형광 페인트 얼룩
	<ol>
<li>인도 잉크 형광 페인트의 얼룩의 효능을 직접 비교를 공동 얼룩의 두 종류와 같은 세포 인구 얼룩. 이렇게 하려면 먼저 셀 형광 캡슐와 단계 2.2.1-2.2.3에 의하여 세포 벽 얼룩을 품 어.</li>
		<li>다음, 붙일 스테인드 세포 현 탁 액 및 인도 잉크를 유리 슬라이드에 동일 볼륨 (4 µ L) 플라스틱. 부드럽게 섞는다.</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 비-독성 실 란 (투명 매니큐어)와 가장자리를 밀봉.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 이미지 수집/현미경
<ol><li>
인도 잉크 얼룩이 세포 이미징.
	<ol>
<li>표준 가벼운 현미경 (100 X 배율)를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>이미지 상태 당 50 셀의 최소입니다. 참고: 필드 셀 수가 달라 집니다, 그리고이 허용 됩니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 겹치는 세포 이들은 (수동 및 자동화 된 소프트웨어와 함께)를 측정 하기 어려운 만큼, 최소한 지켜질. 이 실험에 대 한 이미지는 노출 시간 셀의 작은 움직임으로 인 한 흐림 효과 최소화 하면서 이미지 대비를 극대화 하기 위해 최적화 된 16 비트 깊이에 인수 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 염료와 스테인드 세포 이미징
	<ol>
<li>형광 현미경 검사 법에 의해 셀을 이미지를 현미경 이미징 소프트웨어 열고 fluorophores 사용에 대 한 적절 한 여기 및 방출 파장 선택 (CFW와 AF488는 흥분는 405nm 전등과 488 nm, 각각 사용 하 여). 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>이미지 상태 당 50 셀의 최소입니다. 참고: 필드 셀 수가 달라 집니다, 그리고이 허용 됩니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 겹치는 세포 이들은 (수동 및 자동화 된 소프트웨어와 함께)를 측정 하기 어려운 만큼 최소한 지켜질.</li>
		<li>특정된 필드 내에서 각 셀에 대 한 최대 캡슐 직경 얻을 수 있도록 셀의 z-스택 이미지 시리즈를 취득 합니다.<ol>
<li>현미경 제어 소프트웨어에서 "z-스택" 바 "z-스택" 컨트롤 패널을 열고 패널의 왼쪽된 위 모퉁이에서 "첫 번째/마지막" 옵션을 선택을 클릭 합니다.</li>
			<li>초점을 현미경에 정밀한 초점 제어를 사용 하 여 단일 효 모 세포와 모든 현재 시야 내에서 캡슐의 넓은 포인트 이며 클릭 "설정 첫 번째" 수준.</li>
			<li>현재 시야 내에서 셀의 모든 캡슐과 같은 셀의 셀 시체의 포인트로 위에 초점을 정밀한 초점 컨트롤을 사용 하 고 "마지막 설정"을 클릭 합니다.</li>
			<li>그런 다음 현재 위치에 대 한 z-스택 얻으려고 "수집" 탭에서 "실험 시작"을 클릭 합니다. 여러 위치에 프로세스를 반복 하 여 최소 50 셀의 z-스택 이미지 획득. 참고: 이러한 실험 confocal pinhole 설정 되었습니다 1.0 AU와 0.7 µ M를 커버 하는 10-20 조각의 겹치는 z 시리즈는 선택한 위치에 인수 했다. AU = 공기 단위.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음, 각 z 스택 시리즈 변환 최대 강도 예측 (MIP) 적절 한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 참고: MIPs 프로젝트 스택된 이미지29의 모든 면에서 가장 큰 강도. MIPs를 만드는 생산 최대 셀 및 스택 내에 캡처된 3 차원 캡슐 직경에 해당 하는 이미지의 2 차원 표현을 하나 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 세포 이미징
	<ol>
<li>Widefield (40 배 확대) 나 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지 (63 X 또는 100 배 확대). 인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 셀에 대 한 컴퓨터 제어 단계와 기름 침수 목표 widefield 현미경을 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오. 참고: 사용 중인 현미경 해야 제어할 수 CFW 이미징 소프트웨어를 사용 하 여. 340-380 nm 여기 필터를 통해 흥분 하 고 빛을 방출 하는 형광은 400 nm dichroic 거울에서 반영 435-485 nm 배리어 필터를 통해 감지 한다. AF488 형광 465-495 nm 여기 필터를 통해 흥분 수 그리고 방출된 빛 515-555 nm 배리어 필터 505 nm dichroic 거울에서 반사를 통해 검출 될 수 있다.</li>
		<li>각 착 방법에 대 한 조건 당 50 셀의 최소 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 수동 측정 캡슐의
<ol><li>인도 잉크 또는 형광 성 얼룩으로 얼룩이 셀, 수동으로 측정 캡슐 및 셀 직경 셀 측정 소프트웨어를 사용 ( 재료의 표참조). 이렇게 하려면, "파일"로 이동 > "이미지 열기" > "측정"을 커서를 사용 하 여 전체 셀 (전체 직경)의 가장 넓은 지점을 통해 직선을 그립니다.</li>
	<li>다음, 다시 "측정"을 클릭 하 고 세포 체 (세포 체 직경)를 통해 직선을 그립니다. 참고: 측정 셀에 자동으로 저장 됩니다.</li>
	<li>모든 셀 (최소 50/그룹)에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>그들은 측정 됩니다 일단 이미지를 저장 하려면 클릭 "파일" > "다른 이름으로 저장" 하 고 이미지를 적절 하 게 이름을.</li>
	<li>새로 측정된 파일을 선택 하 고 데이터를 스프레드시트 소프트웨어를 내보낼.</li>
	<li>방정식을 사용 하 여 캡슐 평균 직경을 계산: ([총 직경]-[셀 본체 지름]).</li>
</ol>5. 자동화 측정 캡슐의
참고: 성공적인 자동화 된 측정을 위해 16 비트 이미지를 사용 대비 높은 수준 하 고는 제대로 적절 한 이미지 분석 소프트웨어 함께 초점을 맞추고 있다 ( 재료의 표참조). C. neoformans 캡슐 측정에 대 한 이미지 때 그것은 세포 벽과 캡슐 사이 경계에 어두운 반지에 집중 하는 것이 중요. 소프트웨어를를 제대로 셀 및 캡슐을 나타내는 수 있습니다.
<ol><li>반전 및 모든 인도 잉크 묻은 적절 한 이미지 편집 소프트웨어를 사용 하 여 셀 이미지의 복사본을 만듭니다 ( 재료의 표참조). 이렇게 하려면 "파일" > "열기" 인도 잉크 얼룩이 이미지를 연 다음 "제어" + "나"는 이미지를 반전. 클릭 "파일" > "다른 이름으로 저장"을 거꾸로 이미지를 저장.</li>
	<li>원래와 거꾸로 가져올 소프트웨어에 이미지 클릭 "파일" > "가져오기 순서" > "로드 이미지" > "정의 시퀀스 (수동으로)" > "치수 (채널)" > "가져오기" > "적용". 참고: C. neoformans 세포 시체 및 캡슐 확인 될 수 있다 고 '조리법'-는 소프트웨어에 포함 된로-특정 알고리즘을 사용 하 여 마스크.</li>
	<li>거꾸로 이미지에 ' 식민지 분석기 (형광)' 제조 법을 사용 하 여 검색 하 고 셀 바디 마스크 다음 "적용"을 클릭 합니다. 거꾸로 이미지에서 C. neoformans 세포의 경계를 정의 하는 어두운 반지 주변 캡슐 보다 밝게 된다.</li>
	<li>거꾸로 이미지에 ' 식민지 분석기 (형광)' 제조 법을 사용 하 여 그들의 캡슐에서 C. neoformans 세포 시체를 세그먼트 다음 "적용" 클릭 합니다. 이 수의 마스크를 만듭니다. "수 면" 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여이 카운트 마스크를 "셀 몸"를 이름을 바꿉니다. 참고: 여러 이미지 처리 단계 제조 법 구성: 배경 제거, 물체 감지, 개체 분리 및 하위 집합 필터링.</li>
	<li>다음, 원본 이미지에 ' 세포 증식 ' 제조 법을 사용 하 여 캡슐, 마스크를 감지 하 고 "적용"을 클릭 합니다. 이 수의 마스크를 만듭니다. "수 면" 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여이 카운트 마스크를 "캡슐"을 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>서로 인접 한 캡슐을 분할 하는 원본 이미지에 새로운 마스크를 만들기 제조 법, ' 캡슐 파티션 '을 사용 하 여. 이렇게 하려면 제조 법 드롭 다운 메뉴에서 "파티션 캡슐"을 클릭 합니다. 캡슐 파티션 상자에서 캡슐 영역에 대 한 지금은 이름이 바뀐된 수 마스크 "캡슐" (5.5)을 선택 합니다. Crypto 셀 (5.4)에 대 한 지금은 이름이 바뀐된 수 마스크 "바디 셀"을 선택 합니다. 입력된 채널, 및 "분할 캡슐에 대 한 마스크 만들기"원본 "를 선택입니다. 클릭 "적용 참고: 제조 법 셀 및 캡슐 직경, 길고 짧은 축 검출 마스크에서 셀과 캡슐, 및 지역 측정의 센터를 교차의 평균으로 정의 생성 합니다. 이 소프트웨어의 스프레드시트 탭 아래에 있는 출력을 찾아. 모든 이미지 (최소 50 셀/그룹)에 대해이 프로세스를 반복 합니다. 제조 법의 매개 변수 개별 이미지의 최적화를 조정 하거나 여러 개의 이미지의 일괄 검색에 대 한 최적화 된 수 있습니다. 추가 측정 셀 및 캡슐의 형태학의 포괄적인 특성화에 대 한 제조 법으로 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해 선택의 스프레드시트 소프트웨어를 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자, Hoyin 라는 DRVision Aivia 자동된 이미지 분석 소프트웨어를 게시 하는 제품 관리자입니다.

수십 년 동안, 캡슐 mycologists와 임상 C. neoformans cryptococcosis 병원 체에 대 한 주요 독성 요인으로 그것의 역할 때문에 관심된에 대 한 연구의 주요 초점 되었습니다. 에 현미경 검사 법을 사용 하 여 긴장 캡슐 크기 차이 측정 하 고 다른 성장 아래 조건 병원 체 및 다양 한 자극 (즉, 서로 다른 환경 조건에 그것의 응답에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 잠재적인 약물 치료, 등) 여기, 우리 C. neoformans에서 캡슐의 성장을 유도 하는 방법을 설명 했습니다과 비해 2 다른 얼룩 프로토콜을 캡슐. 마지막으로, 우리는 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 인도 잉크 묻은 셀, 수동 측정 방법에 비해 결과 생산의 이미지에서 캡슐 직경의 측정을 자동화 하는 방법을 보였다.
우리의 실험에서 우리는 두 임상 변종, B18, b 52, H99S, 알려진된 캡슐 크기...

매년 마다 분기 백만 사람들에 영향을 미치는 매년 180000 이상의 죽음의 결과로, Cryptococcus neoformans 이며, 세포내 병원 성 효 모 cryptococcosis1,2, 의 원인이 되는 대리인 3. 어려운 히트 하지 않은 항 레트로 바이러스 치료에 대 한 준비가 액세스 그들을 심하게 병4,,56에 감염 되기 쉬운 만드는 가난한 나라에서 HIV 양성 환자는. CDC에서 데이터는 사하라 사막 이남의 아프리카에서C. neoformans 죽이고 결핵 보다 더 많은 사람들이 매년 매달 기록1어떤 Ebola 발발 보다 더 나타냅니다. 노출의 가장 일반적인 경로 환경7평범 desiccated 포자를 흡입에서 발생 합니다. 입력 되 면 폐, 감염 된 개인에서 C. neoformans 의 성공에 기여 하는 여러 가지 독성 요인 있다. Acapsular 변종 악성8되지 않는 다 당 류 캡슐 미생물의 기본 독성 요인으로 간주 됩니다.
Cryptococcal 캡슐의 3 개의 원리 구성 요소를 만든: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), mannoproteins (MPs)9. MPs는 캡슐의 비교적 작은 세포 벽 관련 구성 요소, 면역성 이며 주로 프로 염증 반응을9,10를 홍보할 수 있습니다. GXM 및 GalXM 캡슐의 대부분을 확인 하는 반면, (> 90% 무게에 의해) 면역 효과11있다. 그것의 immunomodulatory 효과 이외에는 캡슐 vivo에서 의 급속 한 확대는 호스트 phagocytic 세포 (즉, 중 성구 및 대 식 세포)12섭취에 기계적인 장벽을 만듭니다. C. neoformans 캡슐과 그것의 종합은 복잡 하지만 전반적으로, 증가 캡슐 직경 증가 독성6,,1314와 상관 된다. 이 감안할 때, 신속 하 고 정확 하 게 계량 캡슐 측정 수 C. neoformans 연구에 대 한 중요 하다.
C. neoformans 세포와 그것의 다 당 류 캡슐 동적 구조 이며 시간15변화 표시. 캡슐은 밀도, 크기, 및 호스트 환경16,,1718의 변화에 대 한 응답에서 어셈블리에서 변경할 수 있습니다. 낮은 철 또는 영양 수준, 혈 청, 인간의 생리 적 pH를 증가 CO2 노출 캡슐 성장16,18,,1920를 시작으로 알려져 있습니다. 또한, 연구원은 보여주었다는 감염 시 immunoreactivity에 큰 차이가 발생 하는 구조적인 변화 대출 호스트 C. neoformans 를 이점을21,22. 이것은 C. neoformans 캡슐의 아키텍처는 다양 한 방법으로 분석 하기 때문에 알려져 있다. 전자 현미경 검사 법, 예를 들어 캡슐 외부, 더 투과 층23아래 내부 전자 밀도 레이어와 이기종 매트릭스는 계시 했다. 산란 및 광학 족집게를 사용 하 여 연구자의 고분자 속성24더 명료를 허용 했습니다. 둘 다 정적 및 동적 산란 측정에서 결과 분석, 우리는 알고 다 당 류 캡슐 복잡 한 분기 구조23있다. 광학 핀셋 구조 강성을 테스트 하 고 평가 하는 그것의 항 체 반응24사용 되었습니다. 그러나, 지금까지 가장 자주 고용된 분석 C. neoformans 캡슐의 그것의 크기의 측정 이다.
캡슐 크기 척도, 연구원은 간단한 측정 해야 사용: 캡슐의 선형 직경. 디지털 현미경 인도 잉크 또는 형광 염료와 스테인드 여러 C. neoformans 셀 (일반적으로 수백)의 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 각 셀 몸과 주변 캡슐의 크기 측정 됩니다. 데이터는 컴파일하고 캡슐의 평균 직경 (셀 바디 + 캡슐) 전체 셀 직경에서 세포 체 직경을 빼서 계산 됩니다. 이 시점까지이 측정 수행 되었습니다 수동으로. 그러나 일반적으로 정확 하 고, 연구자에 대 한이 메서드는 단점이 있습니다. 큰 데이터 집합 며칠이 걸릴 수 있습니다 또는 직접 분석 하는 주. 그리고 이러한 측정 수동으로 할 수 있습니다, 때문에 주관과 인간의 오류 영향을 미칠 수 결과.
자동화 된 컴퓨터 이미지 분석 생물 이미지 25,,2627의 더 빠르고 더 신뢰할 수 있는 분석을 사용 하는 분자 세포 생물학의 여러 분야에서 연구자 불가 결 한 도구가 되고있다. 정확한 이미지 분석 기법 무엇입니까 종종 복잡 하 고 거 대 한 데이터 집합에서 양적 정보 내 필요 하다. 그러나, 일부 측정, 특히 C. neoformans 캡슐의 측정을 자동화 하기 어려운 되었습니다. 정확 하 게 식별 하는 세포 벽과 캡슐, 일반적으로 어두운 링 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 군데 나타나는 간의 인터페이스 간단한 임계값을 사용 하 여 해결 성가신 될 수 있습니다. 또한, C. neoformans 세포 문화에 함께 덩어리 하는 경향이 셀의 정확한 세분화 정확한 측정을 위해 필요 합니다.
이 프로젝트의 목표는 (i) C. neoformans, (ii) 비교 및 대비 인도 잉크 캡슐 유도 대 한 표준 프로토콜 중 하나를 설명 했다 고 형광 얼룩으로 직경 측정 캡슐 관련 된 (iii) 개발 간단 하 고, 계산 방법 인도 잉크 얼룩이 이미지 분석 소프트웨어, (iv)를 사용 하 여 셀의 이미지를 사용 하 여 캡슐 직경을 측정 하는 이점 및 제한 수동으로 캡슐 직경을 측정 하 고 소프트웨어 자동화를 사용 하 여의 평가 합니다. 우리 두 착 방법, 형광 세포 벽 및 캡슐의 라벨의 찾을, 더 시간이 걸리는 반면, 실험 사이 가장 일관 된 결과 제공. 그러나 두 방법 모두 성공적으로 구별을 사용 하는, 실험실 및 임상 C. neoformans 사이 긴장 다른 전시 캡슐 크기. 또한, 우리는 인도 잉크 얼룩이 이미지에서에서 캡슐 직경의 측정을 자동화 하 고 이것은 캡슐의 수동 측정에 대안을 발견 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>Capsule Induction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. neoformans cells</td><td></td><td></td><td>임상 실험실 균주 H99S는 Dr. John Perfect (Duke University)의 친절한 선물이었습니다. 임상 균주 B18 및 B52는 Greg Bisson 박사(펜실라니아 대학)의 친절한 선물이었습니다.</td></tr><tr><td>효모 펩톤 포도당 육수(YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td>이것은 표준 레시피(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/고포도당, L-글루타민, 피루브산 나트륨 없음</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India</td><td>ink Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 마우스 anti-GXM 항체가 Alexafluor 488</td><td></td><td></td>에 접합됨 <td>Dr. Arturo Casadevall (존스 홉킨스 대학)로부터의 친절한 선물&nbsp;</td></tr><tr><td>1% 소 혈청 알부민(BSA)이 함유된 PBSPBS</td><td></td><td></td><td>는 1% BSA가 첨가되고 필터 멸균된 위에 나열된 것과 동일한 레시피(4행)입니다.</td></tr><tr><td>소 세럼 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼프로스트 현미경 슬라이드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>코닝</td><td>2855-18</td><td>#1.5 두께</td></tr><tr><td>투명 네일 폴리시 또는 기타 비독성 밀봉제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력>이미지 획득&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>침수 오일</td><td>Cargille&nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>잠수 오일 목표가 있는 광학</td><td>현미경 Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 플랜 - NEOFLUAR 100x 오일 이멀젼 NA 1.30 오브젝</td></tr>티브 <tr><td>광학 현미경 카메라</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD 카메라</td></tr><tr><td>오일 이멀젼 오브젝티브가 있는 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 레이저 스캐닝 컨포칼은 Plan-Apochromat 63X NA 1.4 오일 이멀젼 DIC M27 목표가 장착되어 있습니다. 주의;</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 소프트웨어</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 카메라</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) 및 1.5x 배율 변환기.&nbsp;</td></tr><tr><td>광시야 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsule Measurement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)Automated</td><td></td><td></td></tr> <tr>meesurement Aivia (DRVision<td>)를 위한 이미지 분석 소프트웨어</td><td> 기술)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스프레드시트 소프트웨어</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 의 기본 독성 요소 이며 가장 일반적으로이 병원 성 효 모의 측면을 공부. 캡슐 크기 긴장 사이 넓게 변화할 수 있다, 스트레스 또는 낮은 영양 조건에 도입 하는 때 급속 하 게 성장 수 있으며 변형 독성과 긍정적으로 상관 되었다. 이러한 이유로, 캡슐의 크기는 C. neoformans 연구자에 게 큰 관심입니다. C. neoformans 캡슐의 성장 phenotypic 테스트 하는 동안 긴장의 효 모 또는 크기 차이에 다른 처리의 효과 이해할 수 있도록 유도 된다. 여기 우리 캡슐 유도 및 비교 두 허용 방법 얼룩이 지 고 캡슐 직경 측정의 표준 방법 중 하나를 설명: (i) 인도 잉크, 부정적인 얼룩, 함께 기존의 가벼운 현미경 검사 법 및 (ii) 공동으로 얼룩에 사용 세포 벽 및 캡슐 뒤에 confocal 현미경 검사 법의 형광 페인트 마지막으로, 우리는 어떻게 인도 잉크 얼룩이 진 샘플에서 캡슐 직경의 측정 수 보여 전산 이미지 분석을 사용 하 여 자동화.

캡슐 유도, 세포 얼룩, 이미징, 및 측정 기법을 설명 하기 위해 사용 하는의 3 개의 긴장 C. neoformans: 일반적인, 잘 특징이 실험실 스트레인, H99S30및 2 개의 임상으로 고립 된 긴장의 이전 알 수 없는 캡슐 직경, B18, b 5231.
캡슐 유도, 얼룩, 및 인도 잉크를 사용 하 여 이미지 수집 워크플로 그림 1A에 표시 됩니다. 모든 3 개의 긴장에서 촬영 한 이미지는 사전 및 사후 유도 그림 1B 에서 표시 됩니다. 연구원은 캡슐 유도 하지 않은 동일한 문화에서 그 캡슐 유도 받은 셀을 비교 하 여 성공 했는지 알 수 있습니다. ...

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

이 절차의 전반적인 목표는 캡슐 직경의 시각화 및 측정을 위해 C.neoformans 균주의 다당류 캡슐을 염색하는 것입니다. 이러한 방법은 연구자가 Cryptococcus neoformans에서 캡슐 크기의 유도, 이미징 및 측정에 도움이 될 수 있습니다. 염색 및 이미징 기술의 주요 장점은 간단하고 빠르며 캡슐 직경을 정확하게 측정할 수 있다는 것입니다.이 방법을 처음 사용할 때 소프트웨어 단계가 혼동될 수 있으므로 시각적 시연이 중요합니다. Cryptococcus neoformans'capsule의 직경은 종종 독성의 척도로 사용됩니다. 이 프로세스를 자동화하면 분석 시간을 크게 절약할 수 있습니다.캡슐 생산을 유도하려면 먼저 섭씨 37도의 효모 펩톤 포도당 육수에 C.neoformans 콜로니를 배양하고 배양이 로그 단계에 도달할 때까지 18-36시간 동안 흔듭니다. 배양이 끝나면 원심분리로 효모를 펠릿화하고 PBS에서 효모를 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후, DMEM 농도 2밀리리터당 5번째 세포까지 10의 2배로 효모를 재현탁시키고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 18시간 동안 배양합니다.다음날, 원심분리로 세포를 수집하고 상층액의 마지막 10마이크로리터를 제외한 모든 것을 제거합니다. 효모를 인도 잉크로 염색하려면 펠릿을 잔류 상층액에 재현탁시키고 4마이크로리터의 세포 현탁액과 4마이크로리터의 인도 잉크를 유리 현미경 슬라이드에 옮깁니다. 거품이 생성되지 않도록 결과 용액을 부드럽게 혼합합니다.그런 다음 셀 샘플 위에 1.5 두께 13mm 유리 커버슬립을 놓고 가장자리를 무독성 밀봉제로 밀봉합니다. 효모를 형광 염료로 염색하려면 1% 소 혈청이 보충된 50마이크로리터의 PBS에 하룻밤 배양 펠렛을 재현탁시키고 55-60마이크로리터의 calcofluor-white 및 Alexa Fluor 488 conjugated capsule monoclonal 18B7 항체에서 세포를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 10마이크로리터의 PBS와 소 혈청 알부민에 재현탁합니다.그런 다음 8마이크로리터의 세포를 유리 현미경 슬라이드로 옮기고, 1.5 두께 13mm 유리 커버슬립으로 세포 샘플을 덮고 가장자리를 무독성 밀봉제로 밀봉합니다. 두 염료로 효모를 염색하려면 먼저 방금 설명한 것처럼 형광 캡슐과 세포벽 염색으로 세포를 배양합니다. 그런 다음 4마이크로리터의 형광 염색 세포와 4마이크로리터의 인도 잉크를 유리 슬라이드에 넣고 시연된 대로 곰팡이 세포 샘플 위에 밀봉된 커버슬립을 놓습니다.광학 현미경으로 세포를 이미지화하려면 100X objective를 선택하고 작은 세포의 움직임으로 인한 흐림을 최소화하면서 이미지 대비를 최대화하도록 최적화된 노출 시간으로 조건당 최소 50개의 겹치지 않는 세포를 이미지화합니다. 형광 현미경 검사로 세포를 이미지화하려면 현미경 이미징 소프트웨어를 열고 사용된 형광단에 적합한 excitation 및 emission 파장을 선택합니다. Z 스택 제어판에서 첫 번째 마지막 옵션을 선택합니다.현미경의 미세 초점 제어를 사용하여 먼저 단일 효모 세포의 세포체의 가장 넓은 지점 아래에 초점을 맞추고 현재 시야 내에 있는 모든 세포에 대해 캡슐에 초점을 맞추고 먼저 설정을 클릭합니다. 다음으로, fine focus control을 사용하여 현재 시야 내에 있는 모든 세포에 대해 동일한 세포의 세포체와 캡슐의 가장 넓은 지점 위에 초점을 맞추고 set last를 클릭합니다. 그런 다음 획득 탭을 열고 실험 시작을 클릭하여 현재 위치에 대한 Z 스택을 획득합니다.캡슐 및 셀 직경을 수동으로 측정하려면 적절한 셀 측정 프로그램을 열고 측정할 이미지를 선택하십시오. 측정을 선택하고 커서를 사용하여 전체 셀의 가장 넓은 지점을 통과하는 직선을 그려 전체 셀 직경을 측정합니다. 다시 측정을 클릭하고 세포체를 통해 직선을 그려 세포체 직경을 측정하고 다음 세포를 엽니다.모든 셀이 측정되면 이미지를 저장합니다. 캡슐 및 세포 직경을 자동으로 측정하려면 먼저 적절한 이미지 편집 프로그램을 열고 모든 인도 잉크 염색 셀 이미지를 반전합니다. 다음으로, 원본 이미지와 반전된 이미지를 모두 셀 측정 소프트웨어로 가져오려면 측정 프로그램에서 파일 메뉴를 열고 시퀀스 가져오기, 이미지 로드, 시퀀스 수동 정의, 채널 치수, 가져오기 및 적용을 선택합니다.세포체를 검출하고 마스킹하려면 관심 있는 첫 번째 반전 이미지에 대한 colony analyzer 형광 프로토콜을 선택하고 apply를 클릭합니다. 콜로니 분석기 형광 프로토콜을 다시 선택하여 캡슐에서 반전된 C.neoformans 세포체 이미지를 분할하고 적용을 다시 클릭하여 카운트 마스크를 생성합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 카운트 마스크 세포체의 이름을 바꾸고 원본 이미지에서 세포 증식 프로토콜을 사용하여 캡슐을 검출하고 마스킹합니다.적용을 클릭하여 원본 이미지에 대한 카운트 마스크를 만들고 카운트 마스크 캡슐의 이름을 바꿉니다. 원본 이미지 위에 새 마스크를 만들어 인접한 캡슐을 서로 분할하려면 캡슐 영역에 대해 캡슐 파티션과 캡슐을 선택합니다. 데이터를 내보내려면 스프레드시트를 클릭한 다음 스프레드시트로 내보내기 아이콘을 클릭합니다.내보낼 측정값을 선택한 다음 마지막으로 데이터를 저장합니다. 캡슐 크기 증가는 유도 후 대부분의 균주에서 분명하지만 일부 균주는 자연적으로 작은 캡슐을 나타냅니다. 이 대표적인 실험에서, 가장 큰 균주와 두 개의 작은 균주 사이에서 캡슐 크기의 상당한 차이가 일관되게 관찰되었습니다.캡슐 크기의 차이는 형광 염료를 사용하여 감지할 수도 있습니다. Z 스택 이미지 캡처는 각 세포에 대해 최대 캡슐 및 세포체 직경을 획득하도록 합니다. 그런 다음 스택을 처리하여 효모 세포 캡슐 및 세포 직경의 수동 측정을 위한 최대 강도 투영을 생성할 수 있습니다.두 염색 방법을 사용한 캡슐 측정 간에 실험 내 큰 차이는 없지만, 인도 잉크를 사용하여 캡슐 직경을 측정할 때 형광 염료 염색에 비해 더 큰 실험 간 변동성이 관찰됩니다. 서로 다른 연구자 간의 캡슐 직경 측정에서 유의미한 차이는 일반적으로 사용된 방법에 관계없이 관찰되지 않는 반면, 캡슐 크기의 작지만 유의미한 차이는 자동 측정 방법을 사용하여 감지할 수 있습니다. 성공적인 자동 측정을 위해서는 세포에 초점이 맞춰져 있어야 하고, 중대형 캡슐이 있어야 하며, 과도하게 밀집되어 있지 않아야 합니다.이 비디오를 시청한 후에는 Cryptococcus neoformans에서 캡슐을 유도하고, 인도 잉크 또는 형광 염색을 사용하여 캡슐을 염색하고, 캡슐을 이미지화하고, 자동화된 소프트웨어를 통해 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을...

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

출처: Feltwell, T., et.al. 불연속적인 밀도 구배를 사용하여 캡슐 양으로 박테리아를 분리합니다. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 다양한 캡슐 생산을 가진 박테리아 균주의 준비 및 특성화를 보여줍니다. 캡슐 관련 유전자에 서로 다른 돌연변이를 가지고 있는 병원성 균주를 배양하고, 액체 배지에서 성장시키고, 원심분리하여 펠릿 밀도를 기반으로 캡슐 표현형을 구별합니다. 완충액 처리는 캡슐 구조를 보존하면서 세포를 세척하고 안정화하는 데 사용됩니다.

캡슐 형성 병원성 박테리아 균주의 배양 및 분리

우리는 macrophage- C.를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 디지털 광 현미경을 사용하여 비 - 용해성 세포 외 유출의 프로세스에 특정 중점을 실시간으로 상호 작용. 개별적 감염된 대 식세포를이 방법을 사용하는 것은 이러한 현상의 다양한 양태를 확인하기 위해 조사 될 수있다.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화 크립토 콕 쿠스 네오 포르 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

이 프로토콜 / 원고는 석송의 포자에서 sporopollenin exine 캡슐 (SEC 초)의 생산을위한 이러한 SEC 초에 친수성 화합물의 로딩을위한 간소화 된 프로세스에 대해 설명합니다.

마이크로 캡슐화 애플리케이션을위한 추출 공장 기반 캡슐

이 프로토콜은 BSL-2, -3 또는 -4 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 음성 염색 바이러스 샘플을 제공합니다. 여기에는 투과 전자 현미경 그리드를 보호하고 생체 내에서 난기류 환경에서 사용자가보다 쉽게 ​​취급 할 수있게 해주는 혁신적인 가공 캡슐의 사용이 포함됩니다.

Biocontainment 내 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 캡슐의 활용

이 기술은 다 당 류 캡슐 몸과 반지름을 측정 하도록 설계 되어 자동된 배치 이미지 프로세서를 설명 합니다. 처음 Cryptococcus neoformans 캡슐 측정을 위해 설계 자동된 이미지 프로세서는 원형 개체의 다른 기반으로 하는 대비 검출에도 적용할 수 있습니다.

Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

이 작품 박테리아와 그들의 해당 나노 입자를 통해 나트륨 tungstate, 나트륨 몰 리브 덴 microcapsules 제조에 대 한 프로토콜을 제공합니다.

나트륨 Tungstate 및 세균성 미네랄 배설을 통해 나트륨 몰 리브 덴 Microcapsules 합성

캡슐 생산에 따라 세균성 인구를 분리 하기 위하여 불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 설명 합니다. 이 메서드는 문화 사이 캡슐 금액 비교, 특정 캡슐 형으로 돌연변이 체를 분리 하거나 캡슐 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 사용 됩니다. 여기에 설명 된 최적화 및 분석 결과의 실행 이다.

불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

이 논문에서는 스틸, 형광 이미지 및 고해상도 투과 전자 현미경 이미지를 사용하여 연구되는 크립토코카인 세포 및 아메바의 공동 배양을 준비하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 여기에 예시된 것은 정량적 데이터가 이러한 정성적 정보를 보완하는 방법입니다.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

인간 진균 병원체인 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 숙주 내에서 생존을 촉진하기 위해 다양한 독성 인자(예: 펩티다아제)를 생성합니다. 환경적 틈새는 새로운 천연 펩티다아제 억제제의 유망한 공급원입니다. 이 프로토콜은 연체 동물 추출물의 준비와 곰팡이 독성 인자 생산에 미치는 영향에 대한 평가를 간략하게 설명합니다.

연체 동물의 원유 및 정제 추출물의 추정 항 크립토 코커스 특성 평가

우리는 압축 시험을 사용하여 접안렌즈의 유효 탄성 계수를 특성화하기 위한 자동화된 방법을 제시합니다.

접안 수정체의 자동 압축 검사

배우세요 Cryptococcus neoformans의 다당류 캡슐을 염색하고 직경을 측정하는 방법을. 인도 잉크와 형광 염색을 활용한 이 기법은 병원성 연구에 필수적인 정확한 시각화와 자동화된 분석을 가능하게 합니다.

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

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