Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정
February 27th, 2018
다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.
이 절차의 전반적인 목표는 캡슐 직경의 시각화 및 측정을 위해 C.neoformans 균주의 다당류 캡슐을 염색하는 것입니다. 이러한 방법은 연구자가 Cryptococcus neoformans에서 캡슐 크기의 유도, 이미징 및 측정에 도움이 될 수 있습니다. 염색 및 이미징 기술의 주요 장점은 간단하고 빠르며 캡슐 직경을 정확하게 측정할 수 있다는 것입니다.
이 방법을 처음 사용할 때 소프트웨어 단계가 혼동될 수 있으므로 시각적 시연이 중요합니다. Cryptococcus neoformans'capsule의 직경은 종종 독성의 척도로 사용됩니다. 이 프로세스를 자동화하면 분석 시간을 크게 절약할 수 있습니다.
캡슐 생산을 유도하려면 먼저 섭씨 37도의 효모 펩톤 포도당 육수에 C.neoformans 콜로니를 배양하고 배양이 로그 단계에 도달할 때까지 18-36시간 동안 흔듭니다. 배양이 끝나면 원심분리로 효모를 펠릿화하고 PBS에서 효모를 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후, DMEM 농도 2밀리리터당 5번째 세포까지 10의 2배로 효모를 재현탁시키고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 18시간 동안 배양합니다.
다음날, 원심분리로 세포를 수집하고 상층액의 마지막 10마이크로리터를 제외한 모든 것을 제거합니다. 효모를 인도 잉크로 염색하려면 펠릿을 잔류 상층액에 재현탁시키고 4마이크로리터의 세포 현탁액과 4마이크로리터의 인도 잉크를 유리 현미경 슬라이드에 옮깁니다. 거품이 생성되지 않도록 결과 용액을 부드럽게 혼합합니다.
그런 다음 셀 샘플 위에 1.5 두께 13mm 유리 커버슬립을 놓고 가장자리를 무독성 밀봉제로 밀봉합니다. 효모를 형광 염료로 염색하려면 1% 소 혈청이 보충된 50마이크로리터의 PBS에 하룻밤 배양 펠렛을 재현탁시키고 55-60마이크로리터의 calcofluor-white 및 Alexa Fluor 488 conjugated capsule monoclonal 18B7 항체에서 세포를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 10마이크로리터의 PBS와 소 혈청 알부민에 재현탁합니다.
그런 다음 8마이크로리터의 세포를 유리 현미경 슬라이드로 옮기고, 1.5 두께 13mm 유리 커버슬립으로 세포 샘플을 덮고 가장자리를 무독성 밀봉제로 밀봉합니다. 두 염료로 효모를 염색하려면 먼저 방금 설명한 것처럼 형광 캡슐과 세포벽 염색으로 세포를 배양합니다. 그런 다음 4마이크로리터의 형광 염색 세포와 4마이크로리터의 인도 잉크를 유리 슬라이드에 넣고 시연된 대로 곰팡이 세포 샘플 위에 밀봉된 커버슬립을 놓습니다.
광학 현미경으로 세포를 이미지화하려면 100X objective를 선택하고 작은 세포의 움직임으로 인한 흐림을 최소화하면서 이미지 대비를 최대화하도록 최적화된 노출 시간으로 조건당 최소 50개의 겹치지 않는 세포를 이미지화합니다. 형광 현미경 검사로 세포를 이미지화하려면 현미경 이미징 소프트웨어를 열고 사용된 형광단에 적합한 excitation 및 emission 파장을 선택합니다. Z 스택 제어판에서 첫 번째 마지막 옵션을 선택합니다.
현미경의 미세 초점 제어를 사용하여 먼저 단일 효모 세포의 세포체의 가장 넓은 지점 아래에 초점을 맞추고 현재 시야 내에 있는 모든 세포에 대해 캡슐에 초점을 맞추고 먼저 설정을 클릭합니다. 다음으로, fine focus control을 사용하여 현재 시야 내에 있는 모든 세포에 대해 동일한 세포의 세포체와 캡슐의 가장 넓은 지점 위에 초점을 맞추고 set last를 클릭합니다. 그런 다음 획득 탭을 열고 실험 시작을 클릭하여 현재 위치에 대한 Z 스택을 획득합니다.
캡슐 및 셀 직경을 수동으로 측정하려면 적절한 셀 측정 프로그램을 열고 측정할 이미지를 선택하십시오. 측정을 선택하고 커서를 사용하여 전체 셀의 가장 넓은 지점을 통과하는 직선을 그려 전체 셀 직경을 측정합니다. 다시 측정을 클릭하고 세포체를 통해 직선을 그려 세포체 직경을 측정하고 다음 세포를 엽니다.
모든 셀이 측정되면 이미지를 저장합니다. 캡슐 및 세포 직경을 자동으로 측정하려면 먼저 적절한 이미지 편집 프로그램을 열고 모든 인도 잉크 염색 셀 이미지를 반전합니다. 다음으로, 원본 이미지와 반전된 이미지를 모두 셀 측정 소프트웨어로 가져오려면 측정 프로그램에서 파일 메뉴를 열고 시퀀스 가져오기, 이미지 로드, 시퀀스 수동 정의, 채널 치수, 가져오기 및 적용을 선택합니다.
세포체를 검출하고 마스킹하려면 관심 있는 첫 번째 반전 이미지에 대한 colony analyzer 형광 프로토콜을 선택하고 apply를 클릭합니다. 콜로니 분석기 형광 프로토콜을 다시 선택하여 캡슐에서 반전된 C.neoformans 세포체 이미지를 분할하고 적용을 다시 클릭하여 카운트 마스크를 생성합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 카운트 마스크 세포체의 이름을 바꾸고 원본 이미지에서 세포 증식 프로토콜을 사용하여 캡슐을 검출하고 마스킹합니다.
적용을 클릭하여 원본 이미지에 대한 카운트 마스크를 만들고 카운트 마스크 캡슐의 이름을 바꿉니다. 원본 이미지 위에 새 마스크를 만들어 인접한 캡슐을 서로 분할하려면 캡슐 영역에 대해 캡슐 파티션과 캡슐을 선택합니다. 데이터를 내보내려면 스프레드시트를 클릭한 다음 스프레드시트로 내보내기 아이콘을 클릭합니다.
내보낼 측정값을 선택한 다음 마지막으로 데이터를 저장합니다. 캡슐 크기 증가는 유도 후 대부분의 균주에서 분명하지만 일부 균주는 자연적으로 작은 캡슐을 나타냅니다. 이 대표적인 실험에서, 가장 큰 균주와 두 개의 작은 균주 사이에서 캡슐 크기의 상당한 차이가 일관되게 관찰되었습니다.
캡슐 크기의 차이는 형광 염료를 사용하여 감지할 수도 있습니다. Z 스택 이미지 캡처는 각 세포에 대해 최대 캡슐 및 세포체 직경을 획득하도록 합니다. 그런 다음 스택을 처리하여 효모 세포 캡슐 및 세포 직경의 수동 측정을 위한 최대 강도 투영을 생성할 수 있습니다.
두 염색 방법을 사용한 캡슐 측정 간에 실험 내 큰 차이는 없지만, 인도 잉크를 사용하여 캡슐 직경을 측정할 때 형광 염료 염색에 비해 더 큰 실험 간 변동성이 관찰됩니다. 서로 다른 연구자 간의 캡슐 직경 측정에서 유의미한 차이는 일반적으로 사용된 방법에 관계없이 관찰되지 않는 반면, 캡슐 크기의 작지만 유의미한 차이는 자동 측정 방법을 사용하여 감지할 수 있습니다. 성공적인 자동 측정을 위해서는 세포에 초점이 맞춰져 있어야 하고, 중대형 캡슐이 있어야 하며, 과도하게 밀집되어 있지 않아야 합니다.
이 비디오를 시청한 후에는 Cryptococcus neoformans에서 캡슐을 유도하고, 인도 잉크 또는 형광 염색을 사용하여 캡슐을 염색하고, 캡슐을 이미지화하고, 자동화된 소프트웨어를 통해 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 Cryptococcus neoformans의 다당체 캡슐, 중요한 병원성 인자를 염색하고 측정하는 방법을 제시합니다. 설명된 기술은 균주의 병원성과 상관관계가 있는 정확한 시각화 및 직경 측정을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 미생물학
- 병원성
- 면역학
배경
- 다당체 캡슐은 Cryptococcus neoformans의 병원성에 중요합니다.
- 캡슐 직경은 균주 병원성의 중요한 척도입니다.
- 정확한 측정 기술은 치료 효과 평가에 필수적입니다.
- 시각적 시연은 방법론 이해에 도움이 됩니다.
연구 목적
- 캡슐 유도를 위한 표준화된 방법 제공
- 다양한 염색 및 측정 기술 비교
- 캡슐 직경 측정의 정확성 및 효율성 향상
사용된 방법
- C. neoformans 균주에서 다당체 캡슐 유도
- 시각화를 위한 염색 기술
- 이미징 소프트웨어를 사용한 캡슐 직경 측정
- 효과성에 대한 다양한 염색 방법 비교
주요 결과
- 제시된 방법으로 간단하고 빠른 캡슐 시각화가 가능합니다.
- 캡슐 직경의 정확한 측정이 달성되었습니다.
- 프로세스 자동화는 분석 시간을 크게 줄일 수 있습니다.
- 소프트웨어 단계를 이해하는 데 시각적 보조가 중요합니다.
결론
- 제시된 방법은 C. neoformans 병원성 연구에 효과적입니다.
- 정확한 캡슐 측정은 치료 효과 평가에 중요합니다.
- 향후 연구는 이러한 기술의 자동화에서 이점을 볼 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of Cryptococcus neoformans capsule diameter provides a quantitative proxy for virulence assessment, supporting target validation in antifungal discovery. The ability to automate capsule size measurement enhances reproducibility and throughput in phenotypic screening campaigns. This method enables mechanistic de-risking by linking capsule modulation to therapeutic intervention efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of virulence-associated phenotypes through direct measurement of capsule diameter.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical modulators of capsule biosynthesis.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by correlating capsule size with pathogenic potential.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantifiable readout for high-content screening of compounds affecting capsule formation.
- Operational Value: India ink staining with automated image analysis enables scalable, standardized capsule diameter measurement.
- Strategic Value: Improves assay reproducibility and reduces inter-operator variability in virulence phenotype assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links capsule diameter changes to strain virulence, supporting predictive modeling of therapeutic efficacy.
- Operational Value: Fluorescent co-staining with confocal imaging allows for precise, resolution-enhanced capsule visualization.
- Strategic Value: Enables translational continuity from in vitro phenotype to in vivo pathogenicity assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical evaluation, where capsule diameter serves as a biomarker of virulence modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of capsule biosynthesis pathways as virulence determinants.
- Screening: Enables automated, quantitative measurement of capsule size for compound library screening.
- Analytics: Generates morphometric data (capsule and cell body diameter) for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro capsule measurements to in vivo virulence models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for antifungal lead identification and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virulence assessment through direct, quantifiable phenotyping.
- Operational Value: Standardization via automated image analysis improves throughput and reduces manual measurement bias.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in go/no-go decisions by linking capsule size to pathogenic potential.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antifungal candidates based on virulence attenuation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological culture techniques and microscopy-based imaging.
- Dependent on access to light or fluorescence microscopy and image analysis software capable of morphometric segmentation.
- Necessitates standardization of capsule induction protocols across laboratories to ensure comparability.
- Automated measurement requires cells to be in focus with sufficient capsule size and minimal clustering for accurate segmentation.
- Inter-experiment variability is higher with India ink than fluorescent staining, necessitating careful protocol adherence.
