마우스 결 장 종양 모델에서 콜론 미생물 생물 다양성에 환경 농축의 효과 정의 하는 방법

이 간행물의 주요 목표는 설치류의 마이크로바이옴을 정상화하는 방법을 제시하는 것입니다. 이 시연에서는 대장 종양 발생 중에 마이크로바이옴에 대한 환경 풍부화의 영향을 분석합니다. 이 프로토콜은 환경 농축 개입 전에 마이크로바이옴을 정규화하면 실험 재현성이 어떻게 향상되는지 보여줍니다.

또한 풍부한 환경을 사용하여 동물의 스트레스를 줄이고 상호 작용을 개선하는 방법을 보여줍니다. 우리는 대장 종양 모델에서 환경 풍부화의 효과에 초점을 맞추었지만, 이 방법은 질병의 병인학에서 마이크로바이옴의 역할을 더 잘 이해하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다. 통풍이 잘되는 후드 아래에서 작동하는 멸균 상태에서 케이지를 설정하십시오.

이 실험의 대조군은 둥지를 틀기 위한 침구와 실험실 조직이 있는 기존 케이지로 구성되지만, 그 외에는 농축 장치가 없습니다. 강아지 사육 또는 환경이 풍부한 케이지를 설정하려면 두 개의 대형 오토클레이브 케이지를 멸균 그로밋 보안 터널과 연결하고 각 케이지에 멸균 플랫폼을 포함하여 바닥 공간을 늘리십시오. EE의 경우 멸균된 주행 바퀴, 터널, 이글루, 오두막, 크롤 볼 및 중첩 재료도 제공합니다.

농축 케이지와 제어 케이지를 모두 동일한 랙에 배치하여 동일한 환기를 제공합니다. 번식을 위해 일반 케이지에 1 개의 씨수말과 2 개의 잠재적 인 댐을 결합하십시오. 매일 아침, 동물이 밤에 짝짓기를 했다는 것을 나타내는 질 마개가 있는지 확인하십시오.

플러그가 보이지 않으면 질 프로빙에 대한 저항이 내부화된 플러그를 감지할 수 있습니다. 암컷에게 질 마개가 있으면 큰 강아지 사육 케이지로 옮기십시오. 최대 12개의 임산부 댐을 환경이 풍부한 케이지에 수용할 수 있으며, 플랫폼이 모두 같은 주에 분만될 것으로 예상됩니다.

새끼가 생후 21일에서 28일이 되면 유전자형별로 수컷과 암컷을 대조 환경 또는 풍부한 환경에 분배합니다. 각 케이지에서 각 유전자형의 비율을 유지해야 합니다. 비농축 케이지는 최대 5마리의 마우스를 지원할 수 있는 반면, 농축 케이지는 사회적 자극을 위해 최소 20마리의 마우스가 필요하며 최대 41마리의 마우스를 지원할 수 있습니다.

쥐를 안락사시키기 하루나 이틀 전에 대변을 모으기 시작하십시오. 항상 같은 시간에 수집하십시오. 살아있는 동물의 대변을 채취하려면 깨끗한 케이지 위에서 동물을 조심스럽게 긁습니다.

그런 다음 멸균 집게를 사용하여 배변된 대변을 수거하고 멸균 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 동물이 즉시 배변하지 않으면 깨끗한 케이지에 넣고 동물이 배변할 때까지 기다리며 최대 한 시간이 걸릴 수 있습니다. 안락사된 동물의 대변을 채취하려면 대장을 해부하여 대장에 접근하십시오.

그런 다음 맹장 바로 아래의 결장을 자르고 여과지 위에 결장을 놓습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 결장관 상단을 들어 올리고 가위를 사용하여 내강을 엽니다. 결장을 세로로 벌리기 위해 원위부에서 근위부로 절단합니다.

그런 다음 멸균 집게를 사용하여 원위 결장에서 멸균 마이크로분리 튜브로 대변을 수집합니다. 대변 샘플은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 대변 외에도 결장과 소장, 마이크로솜, 지방 조직 등에서 다른 조직 샘플을 수집합니다.

대변 병원체 검출 프로토콜에 따라 대변에서 미생물 DNA를 분리하기 위해 상용 키트를 활용합니다. 이 경우 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 샘플을 드라이아이스에 옮겨 무게를 잰다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미생물 DNA를 증폭하는 PCR을 설정합니다.

그런 다음 자성 비드를 사용하여 반응 생성물을 청소합니다. 세척을 위해 먼저 앰플리콘 PCR 플레이트를 잠시 원심분리하여 반응 산물을 풀링합니다. 다음으로, 마그네틱 비드를 와류로 둘러싸서 고르게 분산시키고 20마이크로리터 분취액을 각 반응 웰로 전달합니다.

전체 부피를 천천히 10회 피펫팅하여 비드와 용액을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 구슬을 5분 동안 가라앉힙니다. 다음으로, PCR 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드의 마그네틱 수집 후 상층액이 제거될 때까지 2분 동안 기다립니다.

그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 다음으로, 플레이트를 자석에 올려 놓고 각 비드 웰에 200 마이크로 리터의 신선한 80 % 에탄올을 채우고 30 초 동안 기다립니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

이 세척 단계를 한 번 반복하고 비드를 10분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하고 각 웰에 52.5마이크로리터의 Tris를 추가하여 비드에서 반응 생성물을 용리합니다. 전체 부피를 천천히 10회 피펫팅하여 비드를 용액에 완전히 혼합합니다.

그런 다음 이전과 같이 마그네틱 스탠드에 비드를 수집하고 상등액 50마이크로리터를 깨끗한 PCR 플레이트에 옮깁니다. 투명한 접착제로 접시를 덮고 최대 1주일 동안 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 수집된 상등액을 사용하여 인덱스 PCR을 수행하여 어댑터 시퀀스에 바코드를 부착합니다.

그런 다음 산물을 정제하고 염기서열분석을 위해 색인된 라이브러리를 준비합니다. 생쥐의 경우, 환경 강화는 수명을 연장하고 종양 상처를 복구하는 것으로 알려져 있습니다. 이 표현형에서 미생물총(microbiota)의 역할을 정의하기 위해, 번식 동물은 미생물총(microbiota)을 정상화하기 위해 최소 한 달 동안 마우스 군체에 통합되었습니다.

그런 다음 그들은 사육되었고 그들의 자손은 풍요로운 환경 또는 정상적인 환경에서 자랐습니다. 자손은 또한 종양을 지니거나 야생형이었습니다. 16주 후, 동물들을 안락사시키고 대변 샘플을 채취하여 미생물 DNA를 분리했습니다.

다음으로, PCR을 사용하여 샘플의 16S 리보솜 소단위체를 증폭하여 마이크로바이옴 구성 요소를 조사했습니다. 그런 다음 바코드 인덱싱을 사용하여 반응 생성물을 식별했습니다. 흥미롭게도, 개선된 환경은 야생형 동물의 생물 다양성을 향상시키지 않지만, 종양을 가진 동물의 생물 다양성을 크게 증가시킨다.

이것은 방법의 민감도를 보여줍니다. 이러한 생물 다양성의 증가는 알파 프로테오 박테리아 (alphaproteobacteria)와 베타 프로테오 박테리아 (betaproteobacteria) 등급이 크게 증가하고 병원성 감마 프로테오 박테리아 (hospitalogenic gammaproteobacteria)가 감소하면서 프로테오 박테리아 (Proteobacteria)의 존재가 증가했기 때문입니다. 베타프로테오박테리아 부류에서 가장 큰 증가는 Sutterella 속에서였는데, 이는 분비된 면역글로불린 A 분해에 관여하는 공생일 가능성이 높습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 개입을 시작하기 전에 실험 동물 간의 마이크로바이옴을 정상화하기 위해 사육 관행을 변경하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 절차를 수행하는 동안 동물이 환경 내에서 자신의 영역을 설정했음을 기억하십시오. 이 때문에 환경 변화는 동물의 마이크로바이옴에 영향을 미치는 스트레스를 유발할 수 있습니다.

동물의 갑작스러운 행동 변화는 스트레스의 신체적 징후입니다. 이 절차에 따라 특정 미생물을 분리하고 추가로 특성화하여 질병 진행에 대한 식별된 미생물의 충분성을 테스트할 수 있습니다.