Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 패혈성 쇼크 동안 간 내부의 백혈구의 형태와 기능을 관찰하는 것입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간 내부의 백혈구에 대한 직접적인 비디오를 얻을 수 있다는 것입니다. 수술 전에 70% 에탄올을 사용하여 수술대와 모든 기구를 소독하십시오.

그런 다음 간 수술을 위한 도구를 설정하고 가열판을 섭씨 37도로 조정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 LPS 또는 PBS 주입 마우스를 마취한 후 망막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 소량의 눈 연고를 도포합니다. 면도기와 제모 크림을 사용하여 복부 주변의 털을 제거합니다.

그런 다음 젖은 거즈를 사용하여 복부를 청소합니다. 인슐린 주사기를 사용하여 역궤도 주사를 수행하는 동안 200마이크로리터의 텍사스 레드 덱스트란 용액을 주입합니다. 마커를 사용하여 xyphoid process에서 rib 끝까지 오른쪽 늑골 아래 영역을 표시합니다.

그런 다음 포비돈 요오드를 마우스의 복부에 바르면 2차 감염을 예방할 수 있습니다. 집게와 가위를 사용하여 표피를 자릅니다. 다음으로, 마이크로 가위와 집게를 사용하여 복강을 열고 조심스럽게 간을 노출시킵니다.

면봉을 사용하여 왼쪽 측엽을 굴립니다. 그런 다음 500마이크로리터의 멸균 PBS를 복강에 부어 간이 건조해지는 것을 방지합니다. 맞춤형으로 설계된 챔버의 올바른 식욕 제거 위치에 마우스를 놓고 실리콘 베드에 소량의 조직 접착제를 바릅니다.

그런 다음 면봉을 사용하여 간을 조심스럽게 부착합니다. 간 조직은 매우 부서지기 쉽습니다. 간을 노출시키고 잡을 때 날카롭거나 무거운 도구를 사용하지 마십시오.

몇 초 후 간이 건조해지는 것을 방지하기 위해 500마이크로리터의 멸균 PBS로 간을 다시 적십니다. 그런 다음 금속 프레임을 간에 놓고 너트를 사용하여 단단히 고정합니다. 금속 프레임을 배치하기 전에 항상 지지 너트를 놓으십시오.

이것은 금속 프레임의 압력을 줄이는 데 도움이 됩니다. 간의 생체 내 이미징을 수행하려면 Zen 소프트웨어를 실행하여 레이저를 켜십시오. 파장을 880나노미터로 설정하고 녹색 및 빨간색 채널을 설정합니다.

그런 다음 형광 강도에 따라 레이저 출력을 조정하십시오. 챔버를 이미징 스테이지에 놓고 20 파워 워터 이멀젼 대물 렌즈를 커버 유리 가까이에 배치합니다. 마우스 본체 아래에 실리콘 고무 히터를 고정하여 체온을 유지하십시오.

다음으로 금속 프레임에 500마이크로리터의 증류수를 끌어올립니다. 그런 다음 대물 렌즈를 간 가까이에 놓습니다. 초점을 조정하고 이미징 영역의 깊이와 시간을 결정합니다.

장기 이미징의 경우, 윤리적인 이유로 이미징 중 매 시간마다 이전에 준비된 Zoletil 및 Rompun 마취 혼합물의 절반 용량을 주입합니다. 체온을 섭씨 37도로 유지하고 마취 시간은 마우스마다 다르므로 항상 마우스를 주시하십시오. 데이터를 분석하려면 Velocity를 열고 라이브러리에서 원시 데이터를 가져옵니다.

그런 다음 이미지에서 노이즈를 제거하고 스냅샷을 찍습니다. 마지막으로 편집된 항목을 100%에 맞추고 파일을 스냅샷 이미지의 경우 JPEG 또는 TIF 파일로, 동영상의 경우 AVI 파일로 내보냅니다. 대조군 마우스의 생체 내 이미징 분석은 소수의 호중구가 혈관에서 순환하고 있음을 보여주었습니다.

반면 호중구의 수는 LPS 처리된 마우스에서 크게 증가했습니다. LPS 상태에서는 많은 호중구가 혈류 내부를 순환하고 있었지만 혈관 밖으로 이동하지는 않았습니다. 이 영화에서 볼 수 있듯이 대조군 마우스에 비해 LPS 처리된 마우스의 호중구는 혈관의 내강 표면에 더 단단히 부착되어 혈관에서 호중구가 더 자주 감지되었습니다.

호중구의 운동성 외에도 CX3CR1-GFP 마우스의 간 캡슐 대식세포(LCM)는 조직 깊숙한 곳이 아닌 간 조직 표면에서 관찰되었습니다. 또한, LCM은 LPS를 투여한 마우스에서도 간에서 거의 움직임이나 활성화를 보이지 않았습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 xiphoid process에서 오른쪽 늑골 아래 복부 끝까지 절개 라인을 설정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 간이 손상 및 감염에서 어떻게 회복되는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 치료 주사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 의학 분야의 연구자들이 패혈증 중 백혈구의 반응을 탐구하고 잠재적인 약물을 테스트할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 최소한의 복부 절개로 간을 노출시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 지질다당류로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 살균 및 손 씻기와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.