Name: Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 학습하세요 마우스 간에서 2광자 실시간 이미징을 이용해 지질다당류 유도 패혈증 동안 백혈구의 형태와 기능을 관찰하는 최소 침습적 수술 기법을. 이 방법은 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 교부 금에서 국가 연구 재단의 한국 (NRF) (MSIP; 보조금 번호 2016R1A2B4008199 Y-m 한국 정부에 의해 자금에 의해 지원 되었다. H.)와 사역의 건강 및 복지, 한국 (번호 부여: HI14C1324).

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 연 세 대학의과 대학교의 지침에 따라 실시 했다. LysM-녹색 형광 단백질 (GFP; gfp / +) 마우스8 및 CX3Cr1 GFP (gfp / +) 나이의 8 ~ 12 주에9 마우스 intravital 이미징 사용 되었다. 모든 수술 도구 압력가 마로 소독 하 고 70% 알코올로 소독 했다.
1. 맞춤형 마우스 간 이미징 지원 도구와 챔버
<ol><li>마우스 간 이미징 챔버 디자인<ol>
<li>마우스 간 (그림 1) 이미징에 대 한 다음과 같은 크기의 방 만들기: 내부 챔버 (120 m m 길이 × 폭 160 m m × 30 m m 높이), 외부 챔버 (100 m m 길이 × 폭 100 m m × 24 m m 높이), 볼트 (Ф 높이 3 m m × 30 m m), 너트 (Ф 4 m m) 그리고 날개 모양의 너트 (Ф 4 m m).</li>
		<li>실리콘의 120 g의 총 수 있도록 경화 에이전트 및 1:9 비율에 탄성 중합체를 측정 합니다.</li>
		<li>250 mL 삼각 플라스 크에에서 액체 실리콘 혼합물을 넣고 잘 섞는다. 다음은 desiccator에 플라스 크를 넣어 고 펌프를 통해 진공에서 약 1 시간에 대 한 기포를 제거 합니다.</li>
		<li>높이 10 m m로 높은 맞춤형 마우스 챔버에 액체 실리콘 믹스를 부 어 하 고 며칠 (그림 1A)에 대 한 치료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표지 슬라이드와 침대 고정 간의 준비<ol>
<li>금속 프레임에서 실리콘 접착제를 사용 하 여 덮개 유리를 첨부 합니다. 1 일 (그림 1B)에 대 한 건조 하자.</li>
		<li>효과적으로 물 침수 렌즈에 대 한 증류수 보전, 반영구적 물 차단 구조는 필수적 이다. 1 m m 실리콘 접착제를 반올림 하 고 밤새 그것을 강화.</li>
		<li>경화 에이전트 및 기본 고무를 혼합 하 고에 부 어 그것은 높이 약 8-10 m m. 수행 6 잘 플레이트 강화 과정 1.1.2-1.1.4에 설명 된 대로.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. LPS의 준비
<ol><li>살 균 1 × 인산 염 버퍼 식 염 수 희석 살 모 넬 라 enterica serotype enteritidis에서 LPS 분말 (PBS)를 준비 합니다. (1 × PBS: 137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4).</li>
	<li>미리 37 ° C에 물 목욕에 PBS가 열 하 고 신중 하 게 LPS 분말 병 (25 mg)를 엽니다.</li>
	<li>피펫으로 원조를 사용 하 여, LPS 분말 병에 무 균 PBS (5 mL)을 부 어 부드럽게 저 어 하거나 재고 솔루션을 준비 하는 솔루션을 일시 중단 합니다. 참고: LPS 분말 액 화 후 가혹한 vortexing 거품을 일으킬 수 있습니다. 1.5 mL 튜브에 aliquots를 만들 때 손실을 최소화 하기 위해 거품을 만드는 하지 마십시오.</li>
	<li>−20 ° C, 재고 LPS 솔루션을 저장 하 고 주입을 위해 1 mg/mL LPS 솔루션으로 그것을 희석.</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용 하 여 비 취 마우스의 복 막에 1 mg/mL LPS 솔루션 (20 mg/kg)를 삽입할. 제어 동물에 대 한 PBS의 동일한 볼륨을 주입.</li>
	<li>충분 한 염증 반응에 대 한 2 시간을 기다립니다.</li>
</ol>3. 혈관 얼룩 텍사스 레드 Dextran의 준비
<ol><li>두 개의 15 mL 원뿔 튜브 및 살 균 PBS의 10 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>텍사스 레드 Dextran 분말 (25 밀리 그램) 3 ml PBS의 묽 게 하십시오와 잘 섞는다. 빈 15 mL 원뿔 튜브에 혼합물을 전송.</li>
	<li>Dextran 혼합물 (3 mL)를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 남아 있는 PBS (7 mL)를 전송 합니다.</li>
	<li>10 mL 주사기의 끝에 0.45 μ m 주사기 필터를 연결 합니다. 필터 주사기는 바늘을 교체 해야 합니다.</li>
	<li>Dextran 혼합물 (10 mL) 필터링. 흘리 고 피하기 위해 주사기를 균등 하 게 누르십시오.</li>
	<li>빛 차단 1.5 mL 튜브에 2.5 mg/mL dextran 솔루션의 500 µ L를 분배 하 고 −20 ° c.에 그것을 저장합니다 일단 해 동, 4 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
</ol>4. 수술 과정
<ol><li>치료 수술 테이블 및 수술 하기 전에 70% 알코올을 사용 하 여 모든 악기. 다음, 간 수술 도구를 설정 하 고 (그림 2A, B) 37 ° C에 난방 격판덮개를 조정 합니다.</li>
	<li>마 취에 대 한 intraperitoneally에 30 mg/kg tiletamine/zolazepam와 xylazine의 10 mg/kg는 쥐 주사. 이러한 솔루션은 혼합 고 동시 주입에 대 한 PBS에 희석 수 있습니다. 마우스의 발가락을 부드럽게 눌러 anesthetization를 확인 합니다.  아니 반사 때 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>마우스의 망막의 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고의 작은 금액을 적용 합니다.</li>
	<li>제 모 크림 (그림 2C)를 사용 하 여 복 부 주변 몸 머리를 제거 합니다.</li>
	<li>꼬리 정 맥 또는 인슐린 주사기 (그림 2D)를 사용 하 여 역 궤도 주입을 통해 텍사스 레드 Dextran 솔루션 (2.5 mg/mL의 농도)의 200 µ L을 주입.</li>
	<li>표시와 함께 바로 subcostal 영역을 표시 합니다. 라인은 갈비뼈의 끝에 칼 과정에서 그려야 한다. 집게와가 위 (그림 2E, F) 표 피를 잘라.</li>
	<li>마이크로-가 위, 집게를 사용 하 여 복 부 구멍 열고 간 신중 하 게 노출 합니다. 왼쪽된 측면 엽 면봉 (그림 2G, H)를 사용 하 여 밖으로 굴러 될 해야 합니다.</li>
	<li>간 건조를 방지 하기 위해 복 부 구멍에 살 균 PBS의 500 µ L를 붓는 다.</li>
	<li>사용자 정의 설계 실에서 오른쪽 decubitus 위치에 마우스를 놓고 실리콘 침대에 조직 접착제의 작은 금액을 적용 합니다. 그럼, 신중 하 게 간 면봉 (그림 2I)를 사용 하 여 연결 합니다. 참고: 간 조직 매우 어렵다면 있기 때문에, 기계적으로 당기지 마십시오 간 밖으로. 부드럽게 롤 그것 밖으로 면봉으로.</li>
	<li>몇 초 후, 젖은 간 밖으로 건조 하지 않도록 하는 살 균 PBS의 500 µ L로 다시 간. 간장에 금속 프레임을 놓고 너트 (그림 2J)와 그것을 단단히 고정 합니다.</li>
</ol>5. intravital 영상 2 광자 현미경으로 간
<ol><li>880 nm, 그리고 녹색, 세트에 선 소프트웨어 (Carl Zeiss) 레이저에 설정, 파장을 설정 실행 및 빨간색 채널. 레이저 파워 형광 강도 (그림 3A)에 따라 조정 합니다. 배기 필터 정보는 다음과 같습니다: 그린/Alexa488, 500-550 nm와 적색/알 렉 사 555, 575-610 nm.</li>
	<li>이미징 단계에 챔버를 놓고 물 침수 렌즈 커버 유리에 가까운 X 20를 배치 합니다.</li>
	<li>실리콘 고무 히터의 온도 (그림 3B)를 유지 하기 위해 마우스 몸 아래의 수정.</li>
	<li>금속 프레임에 증류수 500 µ L를 삭제 하 고 (그림 3C) 간 가까운 대물 렌즈를 당겨.</li>
	<li>초점을 조정 하 고 깊이 이미지 영역의 시간 확인.</li>
	<li>행위 이미지입니다.</li>
	<li>장기적인 이미징, 이미징 동안 각 시간 tiletamine/zolazepam 및 xylazine 혼합물의 절반 복용량 주입. 이 단계 동안 37 ° C에서 쥐의 체온을 유지 필수적 이다. 항상 계속 눈에 마우스, 모든 마우스에서 anesthetization 시간 차이가 있기 때문. 참고:이 방법은 아니다 복구에 대 한 적절 한 수술 및 이미징 후. 우리는 윤리적으로 수술 후 즉시 마우스를 희생.</li>
	<li>안정적인 anesthetization에 대 일 분 마다 페달 반사를 확인 하십시오.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>데이터 분석 소프트웨어 Volocity를 연 다음 소프트웨어 라이브러리에서 원시 데이터를 가져올 합니다.</li>
	<li>상황에 맞게 하 고 스냅숏을 이미지에서 노이즈를 제거 합니다. 참고: 부드러운 이미지를 얻기 위해 '벌금' 또는 '중간' 필터를 사용 합니다. 또한, '콘트라스트 향상' 기능을 사용 하 여 어둡거나 흐린 이미지를 선명 하 게.</li>
	<li>스냅숏 이미지를 JPEG 또는 TIFF 파일 및 AVI 파일 영화에 대 한 수출을 100% 편집된 항목에 맞게.</li>
</ol>

<ol><li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuels%2C+hormones%2C+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li>
<li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li>
<li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection%3A+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303(2015).</li>
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<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).</li>
<li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

간은 많은 그룹3,10, 그것의 기능의 중요성 때문에 의해 적극적으로 연구 되었습니다. 예를 들어, Heymann 외. agarose를 사용 하 여 섬세 한 방법을 제안 했다. 이 메서드는 매우 정확 하 게 발견 되었다, agarose 설정 시간이 걸립니다. 그러나, 우리의 방법론으로 모든 절차 수 실행 될 다른 혼동 요인을 최소화 하는 30 분 이내. 하트 비트 비디오를 방해 할 수 있기 때문에 둘째, 간 안정화 매우 중요 하다. 이 현상 제거, 우리는 오른쪽 decubitus 위치에 쥐를 재배치.
이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계 생산의 금속 커버 프레임 및 금속 막대에 위치 했다. 우리가 직면 하는 가장 중요 한 장애물 간 고정 압력의 적절 한 금액을 사용 하 여 따라 간의 friability를 극복 하는 방법을 결정 했다. 처음에 때만 나비 너트 커버 슬라이드를 적용...

간은 포유류; 주요 대사 기관 그것은 에너지, 호르몬, 및 해독1에 대 한 컨트롤 타워 역할을 합니다. 그 중요성으로 인해 연구팀은 염증 동안에 변화를 명료 하 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 실시 했습니다. Intravital 현미경 검사 법은 간2 에서 라이브 이미지를 캡처하는 데 사용 되었습니다. 실제로, 다양 한 간 이미징 방법 되었습니다 도입2,,34,,56. 그러나, 더 단순화 된 외과 접근을 개발 하 고 대상 기관 및 면역 세포의 안정화를 달성, 우리는 intravital 이미징에 대 한 그들의 노력을 최소화 하기 위해 연구원 안내 하는 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.
이 연구에서 우리는 안정적이 고 새로운 이미징 챔버 및 출혈 및 가능한 감염을 최소화 하기 위해 사용 될 수 있는 수술 기법 도입. 우리는 간 이상 2 시간에 대 한 온전 하 게 남아 확인 했다. 이 방법으로, 우리는 성공적으로 LCMs7 및 부패 시키는 조건 하에서 호 중구의 형태학 식별. 이 방법에 대 한 응답에서에 면역 세포의 급성 반응을 관찰 하 사용 될 수 있기 때문에이 방법은 수술 중 떨림과 예기치 않은 염증 등 물리적 및 생물학적 혼동 요인 최소화, 기대 시 약 같은 LPS.

<table><tbody><tr><td>맞춤형으로 설계된 챔버</td><td>라이브 셀 기기</td><td></td><td>맞춤형으로 설계된 크기</td></tr><tr><td>금속 커버 슬라이드</td><td>라이브셀 기기</td><td></td><td>맞춤형으로 설계된 크기</td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>전자 현미경 과학</td><td>#72204-03</td><td></td></tr><tr><td>실가드 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>다우코닝</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼각식 플라스크</td><td>DURAN</td><td>21 216 36</td><td></td></tr><tr><td>세포배양판 (Flat type)</td><td>HYUNDAI Micro Co.</td><td>H31006</td><td></td></tr><tr><td>데시케이터</td><td>ADARSH</td><td>55204</td><td></td></tr><tr><td>High Q BOND SE 5 mL</td><td>BJM LAB</td><td></td><td>반영구적 댐</td></tr><tr><td>유연한 실리콘 고무 히터</td><td>Omega</td><td>SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800</td><td></td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치</td><td>Toyotech</td><td>DP30-03A</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td></td><td></td><td>수제</td></tr><tr><td>Salmonella enteria serotype enteritidis의 Lipopolysaccharides (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6011</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 고선명 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>FALCON</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 필터 (Minisart 주사기 필터)</td><td>Sartorius</td><td>16555k</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Micro Tube, Amber</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-X</td><td>차광용</td></tr> 1 <tr><td>mL 주사기</td><td>한국 백신</td><td>KV-S01</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 주사기</td><td>한국 백신</td><td>KV-S03</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>한국 백신</td><td>KV-S10</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mL 인슐린 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>324900</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림 100 mL</td><td>바디 나투르</td><td></td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>ABDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 5 mL</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun 10 mL</td><td>바이엘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열판</td><td>라이브 셀 기기</td><td>PH-S-10</td><td>맞춤형 크기</td></tr><tr><td>DC 컨트롤러</td><td>라이브 셀 기기</td><td>CU-301</td><td></td></tr><tr><td>Microdessection 가위</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-5418</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Vet bond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 소프트웨어 (블랙 에디션)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>프로그램 for LSM 7 MP</td></tr><tr><td>LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>분석 프로그램</td></tr></tbody></table>

lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 intravital 이미징

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

패 혈 증은 조직 기관 실패를 일으킬 수 있는 심각한 감염의 유형을 손상. 패 혈 증과 관련 된 사망률과 병 적 속도 매우 높은, 아니 직접 치료 이나 기관 관련 메커니즘을 실시간으로 자세히 검사 합니다. 간 독 소 및 인체에 감염을 관리 하는 핵심 기관 이다. 여기, 우리 면역 세포, 호 중구 등 간 capsular 세포 (LCMs)의 운동 성을 추적 endotoxemia의 유도 후 마우스 간 intravital 이미징 수행 목적입니다. 따라서, 우리는 최소 침 습 수술으로 간의 노출에 대 한 새로운 수술 방법 설계 되었습니다. 마우스 intraperitoneally lipopolysaccharide (LPS), 일반적인도로 주입 했다. 노출 및 LPS 처리 LysM-녹색 형광 단백질 (GFP)에 마우스 간, 우리는 그 neutrophil 발견 채용의 intravital 이미징에 대 한 우리의 새로운 외과 접근을 사용 하 여 마우스 간 그 인산 염 버퍼에 비해 증가 했다 염 분 처리 간입니다. LPS 치료 후, 호 중구 수 시간 크게 증가. 또한, 우리가 성공적으로 간 상주 대 식 세포 라는 LCMs 시각 CX3Cr1 GFP 마우스를 사용 하 여. 따라서, vivo에서면역 이동성 제어를 새로운 시 약의 효능을 조사, 운동 성 및 간에서 호 중구 및 LCMs의 형태 결정 수 기관 실패 및 조직 손상으로 인 한 치료 효과 확인 하 패 혈 증에 백혈구 활성화입니다.

간단 하 고 매우 안정적인 이미징 챔버 고안 되었다. 챔버의 하단 마우스 몸과 장기의 미 끄 러 방지 실리콘으로 덮여 있었다. 또한, 실리콘 탄성의 적절 한 금액을가지고, 때문에 그것은 커버 슬라이드 (그림 1A, C)의 압력에 의해 유도 된 예상된 피해를 막을 수 있습니다. 두 번째, 조직 안전한 접착제 (본드 수 의사)는 원 모양의 실리콘 침대에서 추출 된 간 해결 하기 위해 적용 되었습니다. 이 메서드는 하트 비트 또는 respirational 운동으로 인 한 떨림 방지를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 금속 커버 슬라이드 배치 되었고 볼트와 너트 쥐의 몸 크기와 튀어나온 간 (그림 1B-D)의 위치에 기반 하 여 고정. 마 취는 제대로 수행 되었다 때 이미징 설정과 ...

우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

이 절차의 전반적인 목표는 패혈성 쇼크 동안 간 내부의 백혈구의 형태와 기능을 관찰하는 것입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간 내부의 백혈구에 대한 직접적인 비디오를 얻을 수 있다는 것입니다. 수술 전에 70% 에탄올을 사용하여 수술대와 모든 기구를 소독하십시오.그런 다음 간 수술을 위한 도구를 설정하고 가열판을 섭씨 37도로 조정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 LPS 또는 PBS 주입 마우스를 마취한 후 망막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 소량의 눈 연고를 도포합니다. 면도기와 제모 크림을 사용하여 복부 주변의 털을 제거합니다.그런 다음 젖은 거즈를 사용하여 복부를 청소합니다. 인슐린 주사기를 사용하여 역궤도 주사를 수행하는 동안 200마이크로리터의 텍사스 레드 덱스트란 용액을 주입합니다. 마커를 사용하여 xyphoid process에서 rib 끝까지 오른쪽 늑골 아래 영역을 표시합니다.그런 다음 포비돈 요오드를 마우스의 복부에 바르면 2차 감염을 예방할 수 있습니다. 집게와 가위를 사용하여 표피를 자릅니다. 다음으로, 마이크로 가위와 집게를 사용하여 복강을 열고 조심스럽게 간을 노출시킵니다.면봉을 사용하여 왼쪽 측엽을 굴립니다. 그런 다음 500마이크로리터의 멸균 PBS를 복강에 부어 간이 건조해지는 것을 방지합니다. 맞춤형으로 설계된 챔버의 올바른 식욕 제거 위치에 마우스를 놓고 실리콘 베드에 소량의 조직 접착제를 바릅니다.그런 다음 면봉을 사용하여 간을 조심스럽게 부착합니다. 간 조직은 매우 부서지기 쉽습니다. 간을 노출시키고 잡을 때 날카롭거나 무거운 도구를 사용하지 마십시오.몇 초 후 간이 건조해지는 것을 방지하기 위해 500마이크로리터의 멸균 PBS로 간을 다시 적십니다. 그런 다음 금속 프레임을 간에 놓고 너트를 사용하여 단단히 고정합니다. 금속 프레임을 배치하기 전에 항상 지지 너트를 놓으십시오.이것은 금속 프레임의 압력을 줄이는 데 도움이 됩니다. 간의 생체 내 이미징을 수행하려면 Zen 소프트웨어를 실행하여 레이저를 켜십시오. 파장을 880나노미터로 설정하고 녹색 및 빨간색 채널을 설정합니다.그런 다음 형광 강도에 따라 레이저 출력을 조정하십시오. 챔버를 이미징 스테이지에 놓고 20 파워 워터 이멀젼 대물 렌즈를 커버 유리 가까이에 배치합니다. 마우스 본체 아래에 실리콘 고무 히터를 고정하여 체온을 유지하십시오.다음으로 금속 프레임에 500마이크로리터의 증류수를 끌어올립니다. 그런 다음 대물 렌즈를 간 가까이에 놓습니다. 초점을 조정하고 이미징 영역의 깊이와 시간을 결정합니다.장기 이미징의 경우, 윤리적인 이유로 이미징 중 매 시간마다 이전에 준비된 Zoletil 및 Rompun 마취 혼합물의 절반 용량을 주입합니다. 체온을 섭씨 37도로 유지하고 마취 시간은 마우스마다 다르므로 항상 마우스를 주시하십시오. 데이터를 분석하려면 Velocity를 열고 라이브러리에서 원시 데이터를 가져옵니다.그런 다음 이미지에서 노이즈를 제거하고 스냅샷을 찍습니다. 마지막으로 편집된 항목을 100%에 맞추고 파일을 스냅샷 이미지의 경우 JPEG 또는 TIF 파일로, 동영상의 경우 AVI 파일로 내보냅니다. 대조군 마우스의 생체 내 이미징 분석은 소수의 호중구가 혈관에서 순환하고 있음을 보여주었습니다.반면 호중구의 수는 LPS 처리된 마우스에서 크게 증가했습니다. LPS 상태에서는 많은 호중구가 혈류 내부를 순환하고 있었지만 혈관 밖으로 이동하지는 않았습니다. 이 영화에서 볼 수 있듯이 대조군 마우스에 비해 LPS 처리된 마우스의 호중구는 혈관의 내강 표면에 더 단단히 부착되어 혈관에서 호중구가 더 자주 감지되었습니다.호중구의 운동성 외에도 CX3CR1-GFP 마우스의 간 캡슐 대식세포(LCM)는 조직 깊숙한 곳이 아닌 간 조직 표면에서 관찰되었습니다. 또한, LCM은 LPS를 투여한 마우스에서도 간에서 거의 움직임이나 활성화를 보이지 않았습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 xiphoid process에서 오른쪽 늑골 아래 복부 끝까지 절개 라인을 설정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 간이 손상 및 감염에서 어떻게 회복되는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 치료 주사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 의학 분야의 연구자들이 패혈증 중 백혈구의 반응을 탐구하고 잠재적인 약물을 테스트할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 최소한의 복부 절개로 간을 노출시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 지질다당류로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 살균 및 손 씻기와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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