Name: 약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 학습하세요 iPSC에서 hepatocyte-like 세포로 분화시키는 방법으로 간 질환 치료제 고속 스크리닝 플랫폼을 구축하는 기술입니다. 환자 유래 세포를 활용한 맞춤형 의약 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 건강의 국가 학회 (DK55743, DK087377, DK102716 및 HG006398에 S.A.D)에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 Behshad Pournasr, 닥터 제임스 해 슬 롭 그들의 공헌에 대 한 란 Jing를 감사 하 고 싶습니다.

1. 인간의 문화 유도 만능 줄기 세포
<ol><li>
재조합 인간 E Cadherin Fc 융합 단백질 (E-cad-Fc) 또는 다른 행렬 hPSC 문화에 대 한 적합 한 코팅 6<ol>
<li>Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 칼슘 및 마그네슘 (DPBS (+))와 함께 전자 cad Fc 15 μ g/mL를 희석.</li>
		<li>100 m m 정지 조직 문화 요리 희석된 전자 cad Fc의 5 mL와 코트 및 적어도 1 h. 제거 기판에 대 한 37 ˚C에서 품 어와 매체 (예를 들어, 이제 M 매체 라고는 mTeSR1)의 5 mL을 바꿉니다7. 참고: 이 프로토콜에 사용 되는 배양은 게시 프로토콜7다음을 준비 하 고 있다. 그러나, 다른 여러 미디어 준비 설명 되었습니다 또는 사용할 수 상업적으로, 절차와 호환이 되는 가능성이 있습니다.</li>
		<li>액체 질소에서 cryopreserved Ipsc의 유리병을 검색 합니다. 작은 얼음 크리스탈 남아 때까지 37 ˚C에서 해 동. M-중간의 4 mL를 포함 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 부드럽게 플라스틱.</li>
		<li>5 분은 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 다시 셀 Y-27632로 관련, 코일 코일 포함 단백질 키 니 아 제 (바위)의 선택적 억제제의 10 µ M으로 보충 하는 매체의 5 mL을 일시 중단에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
		<li>M-중간 단계 1.1.2에서에서 제거 하 고 전자 cad Fc 코팅 100 m m 서 스 펜 션 조직 문화 요리 단계 1.1.4에서에서 셀의 5 mL을 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화에서 인간의 Ipsc 유지
	<ol>
<li>Ipsc 주위에 도달 되 면 80 %confluency, 문화 매체를 제거 하 고 칼슘과 한 번 세척 및 마그네슘 DPBS (-) 무료. DPBS (-) aspirate 고 0.02 %EDTA 솔루션 커버 플레이트, 다음 실 온에서 최대 3 분 동안 품 어 충분 한 양의 추가 합니다. 참고: 80% 합류에 접시 2 x 107 셀을 포함 해야 합니다. 그것은 중요 하지 자라 다 셀, 셀 undifferentiated 형태 유지 되도록입니다. 세포의 pluripotency 줄기 세포 표식 Tra-1-60 또는 동등한8얼룩에 의해 확인할 수 있습니다.</li>
		<li>마자 셀 출시를 시작으로 0.02 %EDTA 용액을 제거 하 고 셀 출시 M 매체의 10 mL와 함께 요리를 홍수. 부드럽게 pipetting으로 Ipsc의 분리를 지원. 참고: 세포 분리를 위한 평균 부 화 시간은 약 3 분, 그러나이 각 iPSC 라인에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가 있다. 셀 주위에 포함 된 작은 클러스터로 나와야 한다 5-10 Ipsc 클러스터 당.</li>
		<li>신선한 전자 cad Fc 코팅된 100 m m 정지 조직 문화 접시 M-중간의 5 mL를 포함 된 당 정지 세포의 1/10을 전송 합니다. 37 ˚C O 4% 아래에서 문화를 품 어2/5% CO2 와 변경 매체 매일. 참고: Ipsc pluripotency 홍보 생리 산소 조건 하에서 교양 정기적으로, 비록 Ipsc 또한 주변 산소를 사용 하 여 성장 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 96 잘 접시에 Hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 차별화
참고: 심사와 호환 되는 형식 Ipsc의 차별화에 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 인간의 Ipsc 차별화 하 고 20 일에서 hepatocyte 같은 세포 형성을 유도 하는 것이 가능 하다. 이 대부분 분석 실험에 적합, 문화의 길이 세포의 성숙도 향상 시키기 위해 확장할 수 있습니다.
<ol><li>
감소 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스 96-잘 조직 배양 플레이트 코팅
	<ol>
<li>매트릭스 2 mg/mL 차가운 살 균 DMEM/F12 조직 문화 매체를 diluting 하 여 재고를 준비 합니다. 250 μ aliquots에 매트릭스를 분할 하 고 필요할 때까지-80 ˚C에 저장. 얼음에 30 분 검색에 대 한 얼음에 DMEM/F12의 10 mL 250 μ 2 mg/mL 매트릭스 재고의 약 수를 재개 진정.</li>
		<li>0.05 mg/mL의 최종 농도를 미리 냉장된 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 혼합 하 여 차가운 DMEM/F12의 10 mL와 매트릭스를 결합 합니다.</li>
		<li>96-잘 조직 배양 플레이트의 각 음을 희석된 매트릭스의 100 μ를 전송. 37 ˚C에서 품 어, 4% O2/5% CO2 이상 1 헤에 대 한 행렬을 삭제 하 고 잘 당 50 μ M-중간의 바꿉니다. 37 ° c, 4% O2/5% CO2 필요할 때까지 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플레이트 셀 차별화
	<ol>
<li>셀 접근 80% 합류까지 100 mm 접시에 Ipsc 문화. 접시에 약 2 × 107 셀 포함 되어 있는지 확인 합니다. 셀 흐름 cytometer 또는 hemocytometer 핸드폰 번호를 확인 합니다. 참고: 경험, Ipsc 셀의 품질은 현미경;에 의해 재판 될 수 있다 그러나, 세포의 98 %pluripotency 마커 TRA-1-60 epitope FACS 또는 immunostaining에 의해 측정 될 때 같은 표현 한다. 셀 적극적으로 나누어 남아 자란 하지 중요 하다.</li>
		<li>각 100 mm 접시에서 Ipsc 수확, 문화 매체를 발음 하 고 DPBS (-)의 5 mL로 씻어. 세포 분리 솔루션 (예를 들어, accutase)의 3 mL와는 린스를 장착 하 고 37 ° C, 4% O2/5% CO2에서 약 2 분 동안 품 어. 참고: 그것은 현미경으로 세포의 분리를 수행 해야 합니다. Accutase와 다이제스트 이상 하지 않습니다. 목표는 최소한의 치료와 함께 작은 클러스터로 셀을 공개 하는.</li>
		<li>최대한 빨리 셀 분리 하기 시작, M-중간의 7 mL을 추가 하 여 수확. 주위의 작은 클러스터로 셀 식민지를 해리를 여러 번 플라스틱 3-6 셀 (그림 1A).</li>
		<li>5 분은 상쾌한을 제거 하 고 다시 5 ml M-중간 셀 펠 릿을 일시 중단에 대 한 15 mL 메 마른 분리기 관 300 x g에서 원심 분리기에는 Ipsc를 수집 합니다.</li>
		<li>각 우물에 96-잘 매트릭스 코팅 접시에 셀 현 탁 액 셀의 pipetting 50 μ에 의해 균등 하 게 배포 합니다. 각 96 잘 접시를 설정 하려면, 주위 5 x 106 세포 분화를 설치를 포함 약 80 %confluency 세포와 Ipsc의 하나 100 mm 접시를 사용 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여이 과정을 속도를. 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에서 하룻밤 셀 문화. 참고: 동일한 수의 셀을 재현할 차별점을 보장 하기 위해 각 잘 입금이 중요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포의 분화를 유도
	<ol>
<li>96 잘 접시 셀 각각의 표면에의 적어도 70%를 잘 커버 되도록 현미경으로 검사 합니다. 범위는 70% 미만, 신선한 매체와 매체를 대체 하 고 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에 추가적인 24 h에 대 한 품 어. 참고: 일반적으로 분화를 유도 하지 않고 도금 후 48 h에 대 한 셀을 잠복기 차별화의 효율성을 감소 시킨다. 차별화도 발생 주변 산소를 사용 하 여 효율성에 영향을 받는. 수 있지만
</li>
		<li>차별화의 하루 2 하루 1, 바꿉니다 문화 매체 (인슐린), 없이 2 %B27 보충 RPMI 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4, 및 20 ng/mL FGF2. 잘 당 매체의 100 μ를 추가 하 고 주변 O2/5% CO2 2 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에서 품 어. 참고: 96 잘 접시의 큰 숫자를 다루는 보조 피 펫 또는 로봇의 사용을 해야 합니다. 12 채널 및 96 채널 펫 매일 매체 변화에 이상적입니다.</li>
		<li>차별화의 주 5 일 3, 대체 RPMI와 문화 매체 (인슐린) 없이 2 %B27 100 ng/mL Activin A. 문화 세포 주변 O2/5% CO2 3 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에 보충.</li>
		<li>신선한 문화 매체, 각 치료와 함께 교체 하기 전에 차별화 날 5, 100 μ 0.02 %EDTA 솔루션 30 s, 다음 제거 및 교체에 대 한 잘 신선한 문화 매체와. 참고: Endoderm 차별화 효율적 이면 세포 분화의 단층은 접시에서 필 링을 하는 경향이. 0.02 %EDTA 솔루션 간략 한 치료 세포 분리를 완화 하는 데 도움이 됩니다. 이 치료 차별화 hepatocytes에 영향을 주지 않습니다.</li>
		<li>10 월 6 일 사이 감 별 법, 문화 매체 RPMI / 2% (인슐린)와 B27 20 ng/mL BMP4와 10 ng/mL FGF2 보충 및 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 매일 중간 변화 5 일에 품 어 교체 합니다. 이 단계 세포 간 조상 세포로 분화를 유도 합니다.</li>
		<li>15 일 11 사이의 차별화, B27 (인슐린)와 보충 문화 매체 RPMI / 2 %20 ng/mL HGF 바꿉니다. 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 매일 중간 변화 5 일에 품 어.</li>
		<li>20 일 16 사이의 차별화, 문화 매체는 hepatocyte 세포 배양 매체 (호치민시) 20 ng/mL Oncostatin M (OSM)의 보충 바꿉니다. 주변 O2/5% CO2 5 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에서 세포를 품 어. 참고: 개별 웰 스 간의 차별화의 재현성 효율적으로 알 부 민, AFP, 또는 APOB ELISA 매체에 분 비의 상대적 수준을 측정 하 여 결정 될 수 있다 (3.2 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 작은 분자 검사
참고: 다음에서는 가족성 콜레스테롤 혈 증 Ipsc에서 파생 하는 hepatocyte 같은 셀의 매체에서 APOB의 저수준에 사용 될 수 있는 화합물을 식별 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 모델 및 콜레스테롤 낮추는 약물의 식별에 사용 설명 설명에 자세히 이전5,9. 현재 예제에서는 1000 화합물 사우스 캐롤라이나 복합 컬렉션 (SC3) 도서관에서 상영 했다. 각 화합물 2 μ g/mL의 농도에서 시험 되었다.
<ol><li>
IPSC-작은 분자와 파생된 hepatocytes의 치료
	<ol>
<li>2 %DMSO-20 ˚C에서 저장소 작업 주식 20 μ g/mL의 농도에서 화합물의 접시를 생성 하는 마스터 화합물 라이브러리를 희석.</li>
		<li>테스트할 각 화합물 수 있도록 iPSC 파생 hepatocytes의 충분 한 96 잘 접시를 준비 합니다. 참고: 상영 하는 화합물의 수는 필요한 96 잘 접시의 수를 쓰게 됩니다. 일반적으로, 단일 잘 준비 되어야 한다 모든 컨트롤 샘플에 대 한 각 추가 플러스 화합물, 웰 스에 대 한. 플레이트의 바깥쪽 우물은 해석 손상 가장자리 효과의 가능성을 줄이기 위해 일반적으로 피 한다. 복제를 사용 하 여 필요 없이 z-점수 방법을 사용 하 여 조회 수를 확인할 수 있습니다. 복제에 포함 되어 있다면, t 검정을 사용 하 여 더 적합 하다.</li>
		<li>차별화 (하루 20, 참조 2.3.7)의 완료에 신선한 호치민시의 100 μ와 문화 매체 대체Oncostatin M의 20 ng/mL으로 보충. 37 ˚C에서 품 어, 4% O2/5% CO2 정확히 24 h. 신선한 96 잘 접시와-20 ˚C에 게 문화 매체를 검색 합니다. 이 샘플을 사용 하 여 약물의 추가 하기 전에 매체에서 APOB의 수준을 계산.</li>
		<li>20 ng/mL Oncostatin M의 각 음에 보충 하는 신선한 호치민시의 90 μ를 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 후 작동 주식에서 각 화합물의 10 μ를 추가 합니다. 치료 샘플에서 최종 농도 일치 하는 37 ˚C에서 품 어 웰 스 제어를 0.2 %DMSO 추가, 주변 O2/5% CO2 정확히 24 h. 문화 매체를 수집 하 고-20 ˚C에 저장. 이 예제를 사용 하 여 화합물과 치료 후 APOB의 수준을 결정 하기 위하여.</li>
		<li>옵션-immunostaining, 세포 생존 능력, 또는 mRNA 수준의 표준 방법을 사용 하 여 분석을 위해 나머지를 처리할 수 있습니다. 참고: 이 화면은 APOB 수준에 빠른 효과 가진 약물을 식별 하도록 설계 되었습니다. 그러나, 질병 모델, 다운스트림 분석 실험, 또는 약 활동의 기계 장치에 따라서 그것은 여러 날에 대 한 샘플을 치료 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA APOB 레벨 결정
	<ol>
<li>두 사전 및 사후 약물 치료 샘플 제조 업체의 프로토콜에 따라 인간의 APOB ELISA 개발 키트를 사용 하 여에서 Apolipoprotein B (APOB) 농도 결정 합니다.</li>
		<li>
다음 솔루션을 준비 하 고
		<ol>
<li>0.05%의 구성 워시 버퍼 PBS, pH 7.4에에서 트윈 20. 사용까지 4 ˚C에 저장 합니다.</li>
			<li>인큐베이션 버퍼, 0.05% 트윈 20 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, pH 7.4에에서 이루어져 있습니다. 사용까지 4 ˚C에 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2 µ g/ml PBS, pH 7.4에에서 diluting 하 여 APOB (20/17 mAB) 항 체를 준비 합니다. 잘 당 희석된 항 체의 100 μ를 추가 하 고 밤새 4 ˚C에서 품 어.</li>
		<li>분석 결과 격판덮개에서 항 체를 제거 하 고 각 PBS, pH 7.4의 200 μ로 잘 두 번 세척.</li>
		<li>0.05%의 200 μ/잘 추가 트윈 20, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, pH 7.4에에서 고 실 온에서 1 h 떨고 플랫폼에 품 어.</li>
		<li>PBS, APOB의 다음 농도와 pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA 사용 하 여 8 포인트 표준 곡선을 준비: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL, 및 50 ng/mL.</li>
		<li>PBS, pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA 테스트 샘플 1: 4을 희석.</li>
		<li>인큐베이션 버퍼와 차단의 1 시간 후 버퍼를 삭제 하 고 5 번와 200 μ 0.05%의 분석 결과 접시 세척 PBS, pH 7.4에에서 트윈 20.</li>
		<li>완전히 어떤 잔여 세척 버퍼를 제거 하 고 시험 접시에 희석된 샘플 및 APOB 표준의 90 μ를 전송. 1 시간에 대 한 통에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>샘플을 삭제 하 고 200 μ 0.05%로 씻어 PBS, pH 7.4 잘 당에 트윈 20. 세척 총 5 회 반복 합니다. PBS, pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA mAB LDL 11 biotin 희석된 1:1,000의 당 100 μ를 추가 합니다. 1 h 떨고 플랫폼에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>시 무시 하 고 잘 세척 버퍼 당 200 μ와 5 번 씻어. 추가 Streptavidin HRP 항 체의 당 100 μ (1:1, 000 부 화 버퍼를 사용 하 여 희석), 다음 1 시간을 위한 떨고 플랫폼에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>삭제 시와 200 μ 0.05%로 씻어 PBS, pH 7.4 잘 당에 트윈 20. 세척 총 5 회 반복 합니다. 완전히 시험 접시에서 잔여 세척 버퍼를 제거 하 고 Tetramethylbenzidin (TMB) 기판 솔루션의 당 100 μ 추가 하 고 8 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>TMB 기판 제거 하지 않고 직접 중지 솔루션 (1N HCl)의 당 100 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>450에서 흡 광도 결정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.</li>
		<li>4 매개 변수 로지스틱 회귀 방법을 사용 하 여 다음 각 샘플10APOB의 농도 정의 하는 데 사용 하는 표준 곡선을 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>사전 마약 검사: APOB 낮은 잠재력을 가진 화합물을 식별 하는 각 샘플에서 APOB의 사후 약 비율 매체 수준.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

기반으로 하는 대상 약물 발견, 작은 분자 식별 됩니다 특정 단백질의 활동에 영향을 주는 많은 기존 심사 활동의 초점이 되었습니다. 이 이렇게는 수많은 제약, 반전 형, 고전 학, 바탕 화면을 제공 하 고 있지만 임상 효능1되었습니다 일등석에서 화합물을 식별 하는 것에 더 성공한 되었습니다. Phenotypic 약물 발견에 단점은 적절 한 질병 모델의 가용성에 의존입니다. 이 질병의 셀 모델을 사용할 수 없을 때 도전이 될 또는 일반적인 연구 동물 종의 임상 증상을 정리 하지 못할 때 수 있습니다. 그러나, 환자의 체세포에서 Ipsc를 생성 하는 기능 문화3모델 인간의 질병에 새로운 기회를 제공 했다. 희귀 유전 질환과 같은 일부 질환, 환자 번호에 액세스 하 고 동의 하기 어려운 몇 될 수 있습니다. 그러나, 게놈 엔지니어링의 도래와 함께 그것은 원인이 돌연변이 희귀 질환의 희귀 한 모델 수 iPSC 게놈으로 소개를 상대적으로 간단 합니다.<...

희귀 한 질병을 대상으로 사용할 수 있는 약물을 확인 성공 심사에 사용할 수 있는 분석 실험의 발달에 의존 합니다. 가설 또는 대상 기반 화면 (역방향 약리학) 유용 합니다, 하지만 질병의 분자 기준의 상세한 이해를 요구. Phenotypic 화면 (클래식 약리학) 생화학 경로 대 한 자세한 이해에 대 한 필요 하지만 대신 질병의 이상 정확 하 게 반영 하는 모델의 개발에 따라. 대상-기반 접근에 대 한 열정에 불구 하 고 FDA 승인 첫-에서-클래스 약물의 분석 공개 phenotypic 스크린 훨씬 더 성공적인1되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 심사 하는 높은 처리량에 대 한 플랫폼을 설정 하 대사 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하 사용 될 수 있다입니다. 여러 생체 외에서 모델 기본 hepatocytes은 세포 및 간 조상 세포2를 포함 하 여 기술 되었다. 그러나, 대부분 이러한 모델의 한계, 있고 정확 하 게 문화에서 대사 간 결함의 이상 정리 수 있습니다 새로운 모델에 대 한 필요가 있다. 최근, 인간의 pluripotent 줄기 세포 유전자 편집 함께 액세스 환자 필요 없이 문화에 희귀 질환의 희귀 한 것도 모델 수 있는 기회를 제공 직접3. 환자 전용 Ipsc의 사용 하면서 희귀 한 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 발견 하는 도구는 개념적으로 합리적으로이 접근4의 타당성을 입증 하는 몇 가지 보고서만 있다. 그러나, 우리는 최근 iPSC 파생 hepatocytes 약물 간 신진 대사5결함의 치료를 위해 repurposed 수 성공적으로 확인을 사용 하는 플랫폼을 설립.
이 프로토콜 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시에 인간의 Ipsc를 차별화 하 고 작은 분자의 라이브러리 화면에 그들을 사용 하 여 과정을 설명 합니다. 그것은 또한 신진 대사 간 질환의 예로 콜레스테롤 혈 증을 사용 하 여 끝점 분석을 설명 합니다. 이 방법은 역할 및 전염 성 간 질환, 간 대사 질환, 약물 독성, 및 다른 간 질환의 맥락에서 작은 분자의 응용 연구에 유용 해야 한다.

<table><tbody><tr><td>100mm x 20mm 멸균 조직 배양 접시&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm 멸균 현탁액 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 조직 배양 플레이트&nbsp;</td><td>코닝</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>항 인간 알부민</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>항 인간 FOXA2 (6C12)</td> <td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>항 인간 HNF4 알파</td><td>산타 크루즈</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>안티 휴먼 Oct-3/4 항체</td><td>산타 크루즈</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>안티 휴먼 SOX17</td><td>R & D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A 재조합 인간 단백질&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제, 인슐린 제외&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제, 무혈청;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 재조합 인간 단백질&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr>세포 <tr><td>해리 시약 StemPro&nbsp; 아쿠아타제&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석&nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(칼슘, 마그네슘)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(칼슘 없음, 마그네슘 없음)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA human APOB ELISA 개발 키트</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>간세포 성장 인자&nbsp; (HGF)</td><td>인비트로젠</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 솔루션</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) 재조합 인간 단백질&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>피더 무료 만능 줄기 세포 배지: mTesR1&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>감소 성장 인자 기저막 매트릭스&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere 정의 매트릭스 hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA 기질 솔루션</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK 억제제</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Hepatocyte 모양의 세포 (HLCs)로 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)를 차별 하는 능력 선된 천 성 간 물질 대사 연구에 새로운 기회를 제공 합니다. 그러나, 잠재적으로 간 질환 치료에 사용 될 수 있는 작은 분자의 id를 지 원하는 플랫폼을 제공 하는 절차 화합물의 수천을 심사와 호환 되는 문화 형식이 필요 합니다. 여기, 우리는 hepatocyte 같은 셀 96-잘 조직 문화 접시에 인간의 Ipsc의 재현 차별화를 허용 하는 완전히 정의 된 문화 조건을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 가족성 콜레스테롤 혈 증 환자에서 발생 하는 iPSC 파생 hepatocytes에서 생산 하는 Apolipoprotein B (APOB) 낮은 화면 화합물 그들의 능력에 대 한 플랫폼을 사용 하 여 제공 합니다. 약물 발견과 호환 되는 플랫폼의 가용성 간에 영향을 주는 질병에 대 한 새로운 치료제를 식별 하는 연구를 허용 해야 합니다.

Hepatocyte의 세대 - 세포 처럼: 그림 1 는 hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 분화 하는 동안 발생 하는 변경의 기간을 설명 합니다. 전자 Cad Fc에 Ipsc의 문화 제공 약 2 mm 직경 식민지 만능 마커 OCT4 표현 (그림 1A-B). 전자 cadherin 매트릭스에 성장 하는 세포의 형태는 약간 다른 다른 표면에 경작 그 있을 것입니다. 그들은 큰 세포질 표면 영역 (그림 1A)와 병합 된 형태를가지고 경향이 있다. 비록 인간의 pluripotent 줄기 세포 다른 행렬11의 수에 효율적으로 경작 될 수 있다, 전자...

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

이 실험의 전반적인 목표는 고처리량 스크리닝에 적합한 방식으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 간세포 유사 세포로 분화시키는 것입니다. 간세포는 실험실에서 성장하기 어렵지만, 유도만능줄기세포에서 생성될 수 있어 간 질환 치료법을 확인할 수 있는 스크리닝 플랫폼을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 실험실에서 질병을 재현하는 간 질환이 있는 모든 환자로부터 무제한의 간세포가 생성될 수 있다는 것입니다.이 절차는 줄기 세포 생물학에 대한 광범위한 지식이 없어도 비교적 쉽게 확립할 수 있습니다. 재현성 덕분에 연구원들은 복잡한 로봇 공학 없이도 수천 개의 화합물을 스크리닝할 수 있습니다. 박사 후 연구원인 Ray Liu와 대학원생인 Paige Lamprecht가 오늘 이 절차를 시연할 예정입니다.먼저, 융합 단백질 Ecad를 칼슘과 마그네슘을 함유한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 15마이크로그램으로 희석합니다. 100mm 현탁 조직 배양 접시에 5ml의 희석된 매트릭스를 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 기질을 제거하고 5ml의 iPSC 배양 배지로 교체합니다.액체 질소에서 냉동 보존된 인간 유도 만능 줄기 세포 바이알을 회수합니다. 작은 얼음 결정이 남을 때까지 섭씨 37도에서 해동합니다. 그런 다음 4ml의 배양 배지가 들어 있는 멸균된 15ml 원뿔형 튜브에 세포를 부드럽게 피펫으로 넣습니다.300G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 Rho 관련 코일 코일 함유 단백질 키나아제의 선택적 억제제인 Y-27632의 10마이크로몰이 보충된 5ml의 배지로 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 이제 Ecad로 코팅된 10mm 현탁 조직 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 5ml의 세포를 추가합니다.iPSC가 약 80%의 포화도에 도달하면 배양 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS로 한 번 세척합니다. DPBS를 흡인하고 접시를 덮을 수 있도록 충분한 양의 0.02%EDTA 용액을 추가합니다. 그런 다음 실온에서 최대 3분 동안 세포를 배양합니다.세포가 방출되기 시작하자마자 0.02%EDTA 용액을 제거하고 접시에 10밀리리터의 M 배지를 주입하여 세포를 방출합니다. 부드러운 피펫팅으로 iPSC의 분리를 돕습니다. 5ml의 M 배지를 함유한 새로운 Ecad-코팅된 조직 배양 접시당 부유 세포의 1/10을 옮깁니다.섭씨 37도에서 4 % 산소와 5 % 이산화탄소에서 배양물을 배양하고 배지를 매일 바꿉니다. 250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 매트릭스 스톡을 밀리리터당 2밀리그램 농도로 추출하여 얼음 위에서 해동합니다. 다음으로, 사전 냉각된 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합하여 최종 농도를 밀리리터당 0.05mg으로 만들어 해동된 매트릭스와 10ml의 차가운 DMEM/F12를 결합합니다.100마이크로리터의 희석된 매트릭스를 96웰 조직 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 섭씨 37도의 온도에서 산소 4%와 이산화탄소 5%에서 최소 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 매트릭스를 버리고 웰당 50마이크로리터의 M 배지로 교체하고 나머지 플레이트에 대해 동일한 코팅 절차를 반복합니다.이제 세포가 80% 포화도에 도달할 때까지 100mm 접시에서 iPSC를 배양합니다. 각 100mm 플레이트에서 iPSC를 채취하려면 배양 배지를 흡인하고 5ml의 DPBS로 헹굽니다. 헹굼액을 Accutase와 같은 3ml의 세포 박리 용액으로 교체하십시오.그런 다음 섭씨 37도에서 산소 4%와 이산화탄소 5% 이하에서 약 2분 동안 배양합니다. 세포가 분리되기 시작하자마자 7ml의 M 배지를 첨가하여 수확합니다. 세포 군체를 약 3-6개의 세포로 구성된 작은 클러스터로 해리하기 위해 여러 번 피펫팅합니다.다음으로, iPSC를 15ml 멸균 원심분리기 튜브에 넣고 300G에서 5분 동안 원심분리기합니다. 완료되면 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 5ml의 M 배지에 다시 현탁시킵니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 현탁 세포를 각 웰에 피펫팅하여 96웰 매트릭스 코팅된 플레이트에 세포를 고르게 분배합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 산소 4%와 이산화탄소 5%에서 밤새 세포를 배양하고 나머지 플레이트와 함께 세포 파종 절차를 반복합니다. 현미경으로 96웰 플레이트를 검사하여 세포가 각 개별 웰 표면의 70% 이상을 덮고 있는지 확인합니다. 분화 1일차부터 2일차까지 배양 배지를 웰당 100마이크로리터의 RPMI 기반 분화 배지로 교체합니다.그런 다음 섭씨 37도의 주변 산소와 5% 이산화탄소에서 매일 중간 교대로 2일 동안 세포를 배양합니다. 분화 3일차부터 5일차까지 배양 배지를 2%B27 및 활성 NA 1밀리리터당 100나노그램이 보충된 100마이크로리터의 RPMI 기반 분화 배지로 교체합니다. 섭씨 37도의 주변 산소와 5%의 이산화탄소에서 매일 매체를 바꾸면서 3일 동안 세포를 배양합니다. 분화 5일째에 0.02%EDTA 용액 100마이크로리터로 각 웰을 30초 동안 처리하고 용액을 즉시 제거합니다.100마이크로리터의 새로운 RPMI 기반 분화 배지를 추가하고 나머지 플레이트에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 6일에서 10일 사이의 분화를 위해 배양 배지를 100마이크로리터의 RPMI 기반 분화 배지로 교체하십시오. 섭씨 37도에서 산소 4%와 이산화탄소 5%에서 매일 중간 교대로 5일 동안 세포를 배양합니다.11일에서 15일 사이의 분화를 위해 배양 배지를 100마이크로리터의 RPMI 기반 분화 배지로 교체하고 2%B27 및 HGF 밀리리터당 20나노그램을 보충합니다. 섭씨 37도에서 산소 4%와 이산화탄소 5%에서 매일 중간 교대로 5일 동안 세포를 배양합니다. 16일에서 20일 사이의 분화를 위해 배양 배지를 온코스타틴-M 밀리리터당 20나노그램이 보충된 간세포 세포 배양 배지로 교체합니다.섭씨 37도의 주변 산소와 5% 이산화탄소에서 매일 중간 교대로 5일 동안 세포를 배양합니다. 20일째에 분화가 완료되면 배양 배지를 100마이크로리터의 새로운 간세포 세포 배양 배지로 교체하고 온코스타틴-M 밀리리터당 20나노그램이 보충됩니다. 24시간 동안 배양한 후 배양 배지를 새로운 96웰 플레이트에 넣고 섭씨 20도에서 보관합니다.나머지 플레이트에 대해 동일한 수집 절차를 반복합니다. 온코스타틴-M이 보충된 90마이크로리터의 신선한 간세포 세포 배양 배지를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 이전에 준비된 작업 원료 용액에서 선택한 각 화합물 10마이크로리터를 추가합니다.처리된 샘플의 최종 농도와 일치하도록 대조군 웰에 DMSO를 0.2%에 추가합니다. 24시간 동안 배양한 후 배양 배지를 새로운 96웰 플레이트에 모아 섭씨 20도에서 보관합니다. 나머지 플레이트에 대해 동일한 수집 절차를 반복합니다.5일간의 치료 후, 세포는 최종 내배엽(Definitive Endoderm)에서 특징적으로 발현되는 단백질을 발현합니다. 5일 더 분화한 후, 내배엽은 간 운명으로 전환되고 세포는 FOXA2 및 HNF 4a를 발현합니다. HGF 첨가 후, 세포는 태아 간세포에서 발견되는 단백질을 발현하고, 분화가 완료되면 세포는 두드러진 핵을 포함하는 핵과 여러 지질 방울을 가진 큰 세포질을 가진 직육면체 형태를 채택합니다.분화 20일째에 HNF 4a 및 알부민을 검출하기 위한 면역염색은 이러한 간세포 단백질의 분포가 모든 웰에서 유사하다는 것을 보여줍니다. 소분자 스크리닝에 iPSC 유래 간세포를 사용하는 예를 제공하기 위해 APOB 저하 화합물을 스크리닝하는 데 iPSC를 사용했습니다. APOB 분석의 z-factor는 0.73으로 신약 개발을 위한 플랫폼 사용의 적합성을 확인합니다.APOB의 투여 후, 투여 전 비율은 각 화합물에 대해 결정되었습니다. 적중 식별은 z-score 분석을 통해 달성되었습니다. APOB 비율이 0.86에서 0.44 사이인 24개의 잠재적 적중이 확인되었습니다.세포 생존율에 부정적인 영향을 미치는 화합물을 제외시킨 후, 두 가지 화합물이 APOB를 낮추는 데 재현 가능한 것으로 밝혀졌습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 25일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 매일 새로운 배지를 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.분해로 인한 성분의 잘못된 농도는 세포의 분화 능력에 변화를 줄 것입니다. 개발 후 이 기술은 신약 개발 분야의 연구자들이 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 간 질환에 대한 치료 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 유도 만능 줄기세포를 배양 및 유지하는 방법과 고처리량 스크리닝을 위해 작은 표면 압착 형태로 간 분화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑 및 실험실 가운과 같은 개인 보호 장비를 항상 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.

간 질환 연구를 위한 말초 혈액의 인간 간 스페로이드

이 프로토콜은 빠르고 재현 가능한 내배엽 간 오가노이드(eHEPO)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 eHEPO를 2주 이내에 생산할 수 있으며 차별화와 기능을 잃지 않고 장기(1년 이상)로 확장할 수 있습니다.

기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

학습하세요 iPSC에서 hepatocyte-like 세포로 분화시키는 방법으로 간 질환 치료제 고속 스크리닝 플랫폼을 구축하는 기술입니다. 환자 유래 세포를 활용한 맞춤형 의약 연구에 활용할 수 있습니다.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

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