약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

이 실험의 전반적인 목표는 고처리량 스크리닝에 적합한 방식으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 간세포 유사 세포로 분화시키는 것입니다. 간세포는 실험실에서 성장하기 어렵지만, 유도만능줄기세포에서 생성될 수 있어 간 질환 치료법을 확인할 수 있는 스크리닝 플랫폼을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 실험실에서 질병을 재현하는 간 질환이 있는 모든 환자로부터 무제한의 간세포가 생성될 수 있다는 것입니다.

이 절차는 줄기 세포 생물학에 대한 광범위한 지식이 없어도 비교적 쉽게 확립할 수 있습니다. 재현성 덕분에 연구원들은 복잡한 로봇 공학 없이도 수천 개의 화합물을 스크리닝할 수 있습니다. 박사 후 연구원인 Ray Liu와 대학원생인 Paige Lamprecht가 오늘 이 절차를 시연할 예정입니다.

먼저, 융합 단백질 Ecad를 칼슘과 마그네슘을 함유한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 15마이크로그램으로 희석합니다. 100mm 현탁 조직 배양 접시에 5ml의 희석된 매트릭스를 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 기질을 제거하고 5ml의 iPSC 배양 배지로 교체합니다.

액체 질소에서 냉동 보존된 인간 유도 만능 줄기 세포 바이알을 회수합니다. 작은 얼음 결정이 남을 때까지 섭씨 37도에서 해동합니다. 그런 다음 4ml의 배양 배지가 들어 있는 멸균된 15ml 원뿔형 튜브에 세포를 부드럽게 피펫으로 넣습니다.

300G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 Rho 관련 코일 코일 함유 단백질 키나아제의 선택적 억제제인 Y-27632의 10마이크로몰이 보충된 5ml의 배지로 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 이제 Ecad로 코팅된 10mm 현탁 조직 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 5ml의 세포를 추가합니다.

iPSC가 약 80%의 포화도에 도달하면 배양 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS로 한 번 세척합니다. DPBS를 흡인하고 접시를 덮을 수 있도록 충분한 양의 0.02%EDTA 용액을 추가합니다. 그런 다음 실온에서 최대 3분 동안 세포를 배양합니다.

세포가 방출되기 시작하자마자 0.02%EDTA 용액을 제거하고 접시에 10밀리리터의 M 배지를 주입하여 세포를 방출합니다. 부드러운 피펫팅으로 iPSC의 분리를 돕습니다. 5ml의 M 배지를 함유한 새로운 Ecad-코팅된 조직 배양 접시당 부유 세포의 1/10을 옮깁니다.

섭씨 37도에서 4 % 산소와 5 % 이산화탄소에서 배양물을 배양하고 배지를 매일 바꿉니다. 250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 매트릭스 스톡을 밀리리터당 2밀리그램 농도로 추출하여 얼음 위에서 해동합니다. 다음으로, 사전 냉각된 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합하여 최종 농도를 밀리리터당 0.05mg으로 만들어 해동된 매트릭스와 10ml의 차가운 DMEM/F12를 결합합니다.

100마이크로리터의 희석된 매트릭스를 96웰 조직 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 섭씨 37도의 온도에서 산소 4%와 이산화탄소 5%에서 최소 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 매트릭스를 버리고 웰당 50마이크로리터의 M 배지로 교체하고 나머지 플레이트에 대해 동일한 코팅 절차를 반복합니다.

이제 세포가 80% 포화도에 도달할 때까지 100mm 접시에서 iPSC를 배양합니다. 각 100mm 플레이트에서 iPSC를 채취하려면 배양 배지를 흡인하고 5ml의 DPBS로 헹굽니다. 헹굼액을 Accutase와 같은 3ml의 세포 박리 용액으로 교체하십시오.

그런 다음 섭씨 37도에서 산소 4%와 이산화탄소 5% 이하에서 약 2분 동안 배양합니다. 세포가 분리되기 시작하자마자 7ml의 M 배지를 첨가하여 수확합니다. 세포 군체를 약 3-6개의 세포로 구성된 작은 클러스터로 해리하기 위해 여러 번 피펫팅합니다.

다음으로, iPSC를 15ml 멸균 원심분리기 튜브에 넣고 300G에서 5분 동안 원심분리기합니다. 완료되면 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 5ml의 M 배지에 다시 현탁시킵니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 현탁 세포를 각 웰에 피펫팅하여 96웰 매트릭스 코팅된 플레이트에 세포를 고르게 분배합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 산소 4%와 이산화탄소 5%에서 밤새 세포를 배양하고 나머지 플레이트와 함께 세포 파종 절차를 반복합니다. 현미경으로 96웰 플레이트를 검사하여 세포가 각 개별 웰 표면의 70% 이상을 덮고 있는지 확인합니다. 분화 1일차부터 2일차까지 배양 배지를 웰당 100마이크로리터의 RPMI 기반 분화 배지로 교체합니다.

그런 다음 섭씨 37도의 주변 산소와 5% 이산화탄소에서 매일 중간 교대로 2일 동안 세포를 배양합니다. 분화 3일차부터 5일차까지 배양 배지를 2%B27 및 활성 NA 1밀리리터당 100나노그램이 보충된 100마이크로리터의 RPMI 기반 분화 배지로 교체합니다. 섭씨 37도의 주변 산소와 5%의 이산화탄소에서 매일 매체를 바꾸면서 3일 동안 세포를 배양합니다. 분화 5일째에 0.02%EDTA 용액 100마이크로리터로 각 웰을 30초 동안 처리하고 용액을 즉시 제거합니다.

100마이크로리터의 새로운 RPMI 기반 분화 배지를 추가하고 나머지 플레이트에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 6일에서 10일 사이의 분화를 위해 배양 배지를 100마이크로리터의 RPMI 기반 분화 배지로 교체하십시오. 섭씨 37도에서 산소 4%와 이산화탄소 5%에서 매일 중간 교대로 5일 동안 세포를 배양합니다.

11일에서 15일 사이의 분화를 위해 배양 배지를 100마이크로리터의 RPMI 기반 분화 배지로 교체하고 2%B27 및 HGF 밀리리터당 20나노그램을 보충합니다. 섭씨 37도에서 산소 4%와 이산화탄소 5%에서 매일 중간 교대로 5일 동안 세포를 배양합니다. 16일에서 20일 사이의 분화를 위해 배양 배지를 온코스타틴-M 밀리리터당 20나노그램이 보충된 간세포 세포 배양 배지로 교체합니다.

섭씨 37도의 주변 산소와 5% 이산화탄소에서 매일 중간 교대로 5일 동안 세포를 배양합니다. 20일째에 분화가 완료되면 배양 배지를 100마이크로리터의 새로운 간세포 세포 배양 배지로 교체하고 온코스타틴-M 밀리리터당 20나노그램이 보충됩니다. 24시간 동안 배양한 후 배양 배지를 새로운 96웰 플레이트에 넣고 섭씨 20도에서 보관합니다.

나머지 플레이트에 대해 동일한 수집 절차를 반복합니다. 온코스타틴-M이 보충된 90마이크로리터의 신선한 간세포 세포 배양 배지를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 이전에 준비된 작업 원료 용액에서 선택한 각 화합물 10마이크로리터를 추가합니다.

처리된 샘플의 최종 농도와 일치하도록 대조군 웰에 DMSO를 0.2%에 추가합니다. 24시간 동안 배양한 후 배양 배지를 새로운 96웰 플레이트에 모아 섭씨 20도에서 보관합니다. 나머지 플레이트에 대해 동일한 수집 절차를 반복합니다.

5일간의 치료 후, 세포는 최종 내배엽(Definitive Endoderm)에서 특징적으로 발현되는 단백질을 발현합니다. 5일 더 분화한 후, 내배엽은 간 운명으로 전환되고 세포는 FOXA2 및 HNF 4a를 발현합니다. HGF 첨가 후, 세포는 태아 간세포에서 발견되는 단백질을 발현하고, 분화가 완료되면 세포는 두드러진 핵을 포함하는 핵과 여러 지질 방울을 가진 큰 세포질을 가진 직육면체 형태를 채택합니다.

분화 20일째에 HNF 4a 및 알부민을 검출하기 위한 면역염색은 이러한 간세포 단백질의 분포가 모든 웰에서 유사하다는 것을 보여줍니다. 소분자 스크리닝에 iPSC 유래 간세포를 사용하는 예를 제공하기 위해 APOB 저하 화합물을 스크리닝하는 데 iPSC를 사용했습니다. APOB 분석의 z-factor는 0.73으로 신약 개발을 위한 플랫폼 사용의 적합성을 확인합니다.

APOB의 투여 후, 투여 전 비율은 각 화합물에 대해 결정되었습니다. 적중 식별은 z-score 분석을 통해 달성되었습니다. APOB 비율이 0.86에서 0.44 사이인 24개의 잠재적 적중이 확인되었습니다.

세포 생존율에 부정적인 영향을 미치는 화합물을 제외시킨 후, 두 가지 화합물이 APOB를 낮추는 데 재현 가능한 것으로 밝혀졌습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 25일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 매일 새로운 배지를 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

분해로 인한 성분의 잘못된 농도는 세포의 분화 능력에 변화를 줄 것입니다. 개발 후 이 기술은 신약 개발 분야의 연구자들이 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 간 질환에 대한 치료 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 유도 만능 줄기세포를 배양 및 유지하는 방법과 고처리량 스크리닝을 위해 작은 표면 압착 형태로 간 분화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑 및 실험실 가운과 같은 개인 보호 장비를 항상 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.