수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

안녕하세요, 제 이름은 로버트 샤우트 박사이고 아이오와주 에임스에 있는 국립동물질병센터의 과학자입니다. 이 JoVE 비디오에서는 다운스트림 RNA 실험에 사용하기 위해 대형 동물의 림프절 수집 및 처리에 대한 정보를 공유할 것입니다. 예를 들어, 이러한 실험에는 역전사 산물에 대한 정량적 PCR 또는 전사체의 RNA 염기서열분석 연구가 포함될 수 있습니다.

림프절은 숙주 면역 반응을 평가하는 데 유용한 샘플이지만 림프절 내 면역 세포에 존재하는 세포 내 병원체의 경우와 같이 연구를 위한 병원체 RNA의 출처를 제공할 수도 있습니다. 가축과 야생 동물 종을 포함한 대형 동물의 샘플은 동물원성 질병 연구에 관심이 있습니다. 미국 국립동물질병센터(National Animal Disease Center)에서는 소와 들소에서 브루셀라병을 유발하는 브루셀라 보투스(brucella abortus)와 소의 장 궤적에서 배출된 대장균 O157:H7과 같은 종에 가축의 감염을 연구

우리는 또한 사슴과 엘크와 같은 야생 동물 종의 조직 샘플을 회수할 것입니다. 다양한 질병에 감염된 동물로부터 다양한 림프절을 채취할 수 있습니다. 이러한 자연 숙주 종의 조직에 대한 연구는 일반적으로 마우스 모델보다 질병의 자연적 진행과 더 관련이 있습니다.

그러나 큰 종에서 조직을 채취하는 과정은 안락사와 조직 채취 사이의 더 긴 지연과 림프절의 크기가 더 큰 것을 포함하여 생쥐보다 필연적으로 더 복잡합니다. 여기에서는 RNA 연구를 위한 대형 동물 림프절 분리를 위한 프로토콜을 제시하며, 이는 대형 동물 감염에 대한 전사체 연구에 참여하는 분자 생물학자와 전사체 연구를 시작하는 수의학 연구원에게 유익할 것입니다. 이 비디오에서는 소의 림프절에 대한 절차를 시연할 것입니다.

부검 전에 조직 분리 절차에 특정한 다음 공급품을 조립하는 것이 좋습니다. RNAlater와 같은 약 1ml의 RNA 조직 방부제, 일회용 메스, 세척 및 오토클레이브 겸자, 생검 바늘, 사용한 메스 및 바늘을 위한 날카로운 용기, 관련 물질의 감염 수준에 따라 도마 또는 일회용 트레이로 채워진 마이크로퓨지 튜브. 이 경우, 우리는 일반적으로 소에서 채취하는 림프절을 사용하여 절차의 핵심 요소를 시연할 것입니다.

그들은 브루셀라병을 일으키는 박테리아에 감염되어 있습니다. 이들은 견갑골 전 림프절과 이하선 림프절입니다. RNA 회수를 위해 대규모 동물 부검을 수행할 때는 최소 3명의 참가자가 동물 조직에 대해 작업하도록 하는 것이 유용합니다.

해부 1은 동물의 여러 부위에 대한 대형 동물 절편을 담당하고, 해부 2는 주요 부검 테이블에서 다른 동물 절편의 림프절을 회수하며, 해부 3은 별도의 테이블에서 작업하여 각 림프절의 절편을 분리하고 방부액이 있는 튜브로 옮깁니다. 견갑골 전 림프절의 확인 및 제거부터 시작하겠습니다. 이상적으로는 절제 전에 림프절을 촉진하면 림프절의 위치를 확인하는 데 도움이 됩니다.

항상 감지할 수 있는 것은 아니지만, 견갑전 림프절은 일반적으로 건강한 동물에서 만져질 수 있습니다. 동물을 옆으로 누운 자세로 놓는 것으로 시작합니다. 앞다리를 무릎 높이로 뒤로 움직여 어깨를 펴십시오.

이 동작은 어깨를 뒤로 젖히고 림프절을 쉽게 촉진할 수 있습니다. 그림과 같이 림프절의 존재를 느끼십시오. 위치를 찾아 어깨를 펴고 메스나 괴검 칼을 사용하여 어깨 윤곽을 따라 피부를 절개합니다.

피부를 수축시켜 어깨와 목의 근육 부위를 드러냅니다. 피하 지방의 한 부분이 때때로 관찰되는데, 특히 과도하게 조절된 동물에서 그러하다. 견갑골 전 림프절은 종종 피하 지방 부분과 함께 발견됩니다.

여기에서 피부, 근육, 피하 지방의 3층을 볼 수 있습니다. 다시 한 번, 림프절의 위치를 촉진합니다. 피하 지방과 달리 림프절은 촉진될 때 모양을 유지합니다.

견갑골 전 림프절을 찾은 후 조심스럽게 피하 지방과 림프절을 절개합니다. 그레이터 옐로스톤(Greater Yellowstone) 지역의 들소가 브루셀라에 취약하기 때문에 브루셀라병 연구에 사용한 들소의 이러한 림프절의 모습은 비슷합니다. 여기에서 우리는 미국 들소의 오른쪽 어깨에서 절개된 견갑전 림프절의 모양을 보여줍니다.

다음으로 이하선 림프절의 분리로 이동합니다. 동물이 옆으로 누운 상태에서 턱관절을 찾습니다. 메스나 검검을 사용하여 조심스럽게 피부를 절개합니다.

등쪽에서 관절까지 시작하여 턱선을 따라 수직으로 뻗습니다. 피부를 절개하여 피하 조직을 드러냅니다. 이하선 타액선은 먼저 크기가 크고, 소엽 표면 모양이 있으며, 붉은 색으로 착색되기 때문에 볼

겸자와 메스를 사용하여 이하선 타액선을 옆으로 움직여 타액선의 두개골과 내측에 위치한 이하선 림프절을 찾습니다. 이하선 림프절을 분리할 때는 이하선 타액선 조직에서 림프절 조직을 분리하는 것이 중요합니다. 조직 유형은 조직 단면을 포함하여 뚜렷하게 보입니다.

이것은 왼쪽에서 귀밑 림프절, 오른쪽에 귀밑샘에서 관찰할 수 있습니다. 추가 처리 전에 이하선 림프절 조직의 질감을 주의 깊게 검사하십시오. 어떤 경우에는 이하선 림프절을 찾기 위해 이하선 타액선을 절제해야 할 수도 있습니다.

다음은 수송아지에서 절제된 이하선의 예로, 림프절이 침샘 내에 내장되어 있어 분비샘 제거 전에는 보이지 않습니다. 선택된 림프절의 식별에 대한 추가 정보는 주요 원고에 제공되어 있습니다. 림프절이 채취되면 보존을 위해 절편을 절제할 준비가 된 것입니다.

메스나 검검을 사용하여 림프절의 일부를 제거하고 시상 절개를 만들어 림프절을 엽니다. 림프절 내부, 특히 감염된 동물의 표본에서 비대칭, 병변, 색상 차이 등을 검사합니다. 이 소의 견갑전 림프절에서는 육안으로 여러 가지 특징을 볼 수 있습니다.

여기에는 B 림프구의 본거지인 난포와 T 세포의 본거지인 심부 피질 단위가 포함됩니다. 이러한 이유는 더 가벼운 수질동보다 더 어둡게 나타납니다. 여기에서는 감염되지 않은 림프절의 또 다른 예가 나와 있습니다.

이 림프절은 어린 들소의 림프절입니다. 이 예에서는 난포가 덜 뚜렷합니다. 처리를 위해 조직을 절단하기 위한 한 가지 옵션은 후속 RNA 회수를 위해 메스로 각 림프절에서 작은 조직 조각을 수집하는 것입니다.

그러나 샘플 간의 발현 프로파일을 비교할 때 한 가지 주요 과제는 RNA 추출을 위해 쉽게 통째로 추출할 수 있는 마우스 림프절과 비교하여 큰 동물 림프절의 크기가 크다는 것입니다. 결과적으로, 작은 조직 절편은 림프절에 걸쳐 세포의 프로필을 균일하게 포착하지 못합니다. 대신, 림프절의 윤곽을 가로질러 세포를 포획하기 위해, 림프절에서 파이 모양의 쐐기를 절제하고, 5mm 이하의 두께로 작은 조각으로 자른 다음, 집게와 함께 RNAlater가 들어 있는 튜브에 넣는다.

또는 생검 방법을 활용하여 각 림프절에서 조직 절편을 절제합니다. 결절에서 특정 난포와 같은 특정 절편을 수집한 다음 집게를 사용하여 RNAlater로 옮기려면 punch 생검 도구를 선택하십시오. 샘플이 RNAlater로 옮겨지면 실험실로 다시 옮기고 조직이 침투할 수 있도록 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다.

그 후, 과도한 RNAlater를 제거하고 조직 샘플을 섭씨 80도에서 보관하십시오. RNA 방부제 용액을 사용하는 것의 장점은 부검 시 또는 현장에서 샘플을 채취할 때 액체 질소가 필요하지 않다는 것입니다. 샘플에 접근하기 전에 균질화를 위해 분취 전 Trizol 시약을 튜브에 넣습니다.

샘플을 냉동고에서 꺼낸 후 제조업체의 권장 사항에 따라 후속 처리를 위해 즉시 Trizol 시약으로 옮깁니다. 여기서, 50-100mg의 조직 조각이 Trizol 시약으로 옮겨집니다. Trizol을 추가하기 전에 가능한 한 해동을 제한하십시오.

드라이 아이스에 보관하면 여러 샘플을 냉동고에서 꺼내 처리 할 때 사용할 수 있습니다. 균질화기에 튜브를 놓고 Trizol 시약에서 균질화합니다. 여기서, 2분 RNA 추출 설정이 사용됩니다.

완료되면 흐린 모양이 나타나는지 확인합니다. 필요한 경우 반복합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 각 샘플에 대한 수성 및 유기 층을 생성합니다.

피펫 팁으로 상부 투명 수성상을 제거합니다. 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 동일한 부피의 100 % 에탄올과 혼합하십시오.

철저히 섞는다. 튜브가 종종 흐린 것처럼 보입니다. 마이크로 피펫 팁을 사용하여 액체를 실리카 기반 상업용 스핀 컬럼으로 옮겨 RNA를 추가로 정제한 다음 용리시킵니다.

RNA 품질을 평가하려면 분석을 위해 용리된 RNA 샘플 1개 또는 2l를 분광광도계에 로드합니다. 절차가 완료된 후 260-280 비율과 260-230 비율에 대해 약 2의 흡광도 비율이 관찰되며, 이는 화학적 캐리오버를 최소화한 고순도를 나타냅니다. 페놀 오염은 260-230nm 흡광도 비율의 감소에서 관찰 할 수 있습니다.

들소와 같은 동물의 경우 부검 과정에서 안락사와 첫 번째 조직 샘플을 방부제로 옮기는 데 최소 20분의 시간이 걸리는 것을 관찰했습니다. 반면, 쥐 림프절은 안락사 후 몇 분 만에 제거하고 보존할 수 있습니다. 따라서 우리는 시간이 지남에 따라 림프절의 저하 프로파일을 특성화하는 데 관심이 있었습니다.

주요 원고에서는 다른 출판물에서 테스트된 다양한 다른 조직 유형의 RNA 안정성 프로파일에 대한 요약도 편집했습니다. 들소 림프절로 수행된 대표적인 실험에서, RNA 안정성은 안락사 후 한 시간 동안 비교적 일관적이었다. 여기에서는 미국 들소의 상부 림프절 조직 조각에서 정제된 전체 RNA의 겔 이미지를 묘사합니다.

이 발견은 문헌에서 수집된 다른 조직 유형에 대한 이전 데이터와 일치합니다. 이는 유전자 발현의 다운스트림 분석에 적합한 품질의 샘플이 들소와 엘크와 같은 더 까다로운 종에서도 수집될 수 있음을 시사합니다. 그러나 사멸과 시료 보존 사이의 시간이 길어지면 mRNA 전사체의 3개 프라임 말단에서 분해가 증가하는 등 RNA 발현 프로파일에 변화가 발생할 수 있다는 점을 인식하는 것이 중요합니다.

따라서 생물학적으로 가장 유효한 RNA 프로파일을 얻기 위해 동물을 부검할 수 있게 된 후 추가 지연을 줄이기 위해 조직 회수를 위한 빠르고 간소화된 워크플로우를 활용하는 것이 여전히 중요합니다. 또한, 조직 내에 이미 존재하는 것 이상의 RNA 오염 물질이 공정 전반에 걸쳐 샘플에 유입되지 않도록 절차 전반에 걸쳐 주의를 기울여야 합니다. 여기에는 다른 필수 개인 보호 장비의 일부로 장갑을 사용하는 것이 포함됩니다.

또한 RNA 샘플의 freestalling을 최대한 제한하기 위해 최종 RNA 산물을 여러 튜브로 분취합니다. 예를 들어, 품질 관리 테스트에 사용하기 위해 별도의 부분 표본을 보관할 수 있습니다. 요약하면, 이 비디오에서는 다운스트림 유전자 발현 분석을 위한 림프절의 식별, 수집, 대표 샘플링 및 처리에 사용하기 위한 중요한 정보를 제공했습니다.

우리의 대표 비디오는 소와 들소를 예시하여 시연되었지만, 우리는 염소와 엘크를 포함한 다른 대형 종의 림프절도 사용하여 작업했습니다. 이 비디오가 작업에 전사체 방법 사용을 고려하는 수의학 과학자이든, 대형 동물 과학 분야에 관심이 있는 분자 생물학자이든 관계없이 작업에 유용