파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

이 절차의 전반적인 목표는 온전한 네이티브 형태학 내에서 형광 단백질 생산에 의해 보고된 유전자 발현의 분포를 평가하는 데 사용할 수 있는 파라핀 내장 생물막 절편을 생성하는 것입니다. 이 방법은 천연 생물막 구조의 맥락에서 분포된 외중합체 물질 생산에서 특정 유전자의 발현과 같은 미생물 군집 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생물막 단면의 보존된 형태 내에서 유전자 발현을 분석할 수 있는 동시에 뚜렷한 특징의 염색 및 공초점 또는 전자 현미경과 같은 고해상도 이미징과 같은 다운스트림 처리에 적용할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 한천 트립톤 용액을 준비한 후 50ml 원뿔형 튜브를 사용하여 45ml의 용액을 100mm x 100mm 정사각형 접시에 붓습니다. 한천이 약 20-30분 동안 굳어지도록 합니다. 첫 번째 층 위에 두 번째 15mm 층을 붓고 밤새 굳히고 필요한 경우 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 뚜껑의 결로를 제거합니다.

다음으로, 콜로니 생물막을 발견하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 얼어붙은 스톡에서 분리된 단일 P.Aeruginosa 콜로니를 성장시킨 후 2.5-10마이크로리터의 세포 현탁액을 배지 이중층 플레이트에 피펫팅합니다. 군체는 섭씨 25도의 상대 습도 80-100%의 어둠 속에서 최대 4일 동안 배양할 수 있습니다. 한천 용액 15ml를 성장 배지와 콜로니에 부드럽게 붓고 한천이 실온에서 5분 동안 젤을 형성하도록 합니다.

그런 다음 날카로운 면도날을 사용하여 상단 두 층 사이에 콜로니가 적층된 정사각형 3층 척을 자릅니다. 여러 샘플을 준비하는 경우 각 척이 비슷한 크기로 절단되었는지 확인하십시오. 척이 포함된 식민지에서 여분의 한천을 부드럽게 제거합니다.

그런 다음 주걱의 평평한 머리를 PBS 또는 물에 적시고 한천의 위층과 아래층 사이에 부드럽게 삽입합니다. 라미네이트된 콜로니를 내화학성 마킹 펜으로 라벨링된 임베딩 카세트로 즉시 옮깁니다. 임베딩 카세트를 미리 준비된 정착제가 들어 있는 유리 슬라이드 메일러에 넣습니다.

샘플을 처리합니다. 1X PBS를 사용하여 각각 1시간씩 두 번 세탁하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 자동 조직 처리기의 스핀 기능에 대한 낮은 설정을 사용하여 시약 균질화를 자동화하십시오.

샘플을 삽입하려면 섭씨 55도로 가열된 용융 파라핀 왁스로 왁스 몰드를 채운 다음 가열된 평평한 주걱을 사용하여 임베딩 카세트에서 침투된 척을 왁스 몰드로 빠르게 옮겨 척이 금형 바닥과 평행하게 놓이도록 합니다. 왁스가 섭씨 4도에서 밤새 굳어지도록 합니다. 고체 왁스로 성형 된 샘플은이 온도에서 무기한 보관 될 수 있습니다.

왁스가 응고되면 금형에서 샘플을 절제하고 면도날을 사용하여 샘플 주변에서 과도한 왁스를 다듬습니다. 샘플의 한쪽 끝에서 뻗어 있는 왁스를 남겨 두어 마이크로톰에 고정하는 데 사용할 수 있습니다. 왁스가 포함된 샘플을 다듬어 모양이 부드러운 선형 리본을 쉽게 수집할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.

트리밍의 작은 결함으로 인해 리본에 아티팩트가 생성되고 섹션의 무결성이 손상될 수 있습니다. 다음으로 수조를 섭씨 42도로 가열합니다. 그런 다음 샘플을 집락의 표면이 블레이드 가장자리에 수직으로 향하도록 하여 마이크로톰에 고정합니다.

군집의 원하는 평면에 도달할 때까지 샘플을 50마이크로미터 간격으로 자르고, 여기에서 절편 속도가 75-80RPM이고 간격이 6-10도인 간극 각도로 설정된 마이크로톰을 사용하여 절편을 수집합니다. 원하는 수의 10마이크로미터 두께 섹션의 리본을 자릅니다. 그런 다음 끝이 가는 페인트 브러시를 사용하여 블레이드에서 리본을 분리합니다.

이제 파스퇴르 피펫 끝에 집게 또는 물 한 방울을 사용하여 리본을 수조에 부드럽게 옮깁니다. 즉시 슬라이드를 수조에 삽입하고 리본 아래에 45도 각도로 배치합니다. 리본의 좁은 가장자리를 젖빛 라벨 바로 아래의 슬라이드에 닿게 합니다.

리본이 부착되어야 합니다. 수조에서 슬라이드를 당겨 빼내고 각도를 조정하여 물 표면에 수직이 되도록 하여 리본이 길이를 따라 슬라이드에 평평하게 놓일 수 있도록 합니다. 리본 아래에 과도한 물이 갇히지 않도록 하십시오.

슬라이드를 흡수성 보푸라기가 없는 티슈 위에 부드럽게 세워 섹션에서 과도한 물을 흡수합니다. 그런 다음 슬라이드를 종이 타월에 놓고 실온에서 밤새 어둠 속에서 말리십시오. 수평을 이룬 핫 플레이트를 섭씨 45도까지 가열하고 슬라이드를 플레이트에 30-60분 동안 놓습니다.

왁스는 반 용융되어 슬라이드에 대해 평평해집니다. 핫 플레이트에서 슬라이드를 부드럽게 들어 올려 왁스가 응고될 때까지 약 1분 동안 매끄럽고 평평한 실온 표면에 평평하게 놓습니다. 용융된 왁스가 슬라이드의 어느 쪽으로도 당겨지지 않도록 하십시오.

유리 슬라이드 메일러 안의 샘플을 사용하여 각각 5분 동안 투명제를 4회 세척하여 슬라이드를 디왁스합니다. Buchner 흡입기를 사용하여 세척 사이에 용액을 제거하십시오. 100% 에탄올을 사용하여 슬라이드를 각각 1분 동안 세 번 세척합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 슬라이드를 재수화한 후 즉시 트리스 버퍼 장착 매체에 섹션을 장착하고 커버슬립을 적용합니다. 단면 주위의 오버레이 한천은 고정제와 반응하지 않으므로 차드 슬라이드에 부착되지 않습니다. 이 한천은 재수화 중에 빠져나와 단면을 손상시킬 수 있으므로 재수화 중에 용액을 휘젓지 않도록 주의해야 합니다.

장착 매체가 밤새 실온에서 중합되도록 합니다. 중합이 완료되면 투명 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 밀봉합니다. 마지막으로, 밀봉된 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에 무기한 보관하십시오.

40배 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하는 DIC 이미징은 생물막 얇은 부분의 일부 형태학적 특징을 보여주기에 충분할 수 있지만, 형광 단백질을 구조적으로 발현하도록 설계된 균주의 형광 현미경 검사는 샘플 내 세포 분포에 대한 향상된 시각화를 제공합니다. 이 패널에서 볼 수 있듯이 개별 섹션의 이미지를 함께 연결하여 전체 군체의 단면을 생성하고 거시적 수준에서 전체 형태 내에서 구조적 특징의 지역화에 대한 컨텍스트를 제공할 수 있습니다. 특정 promoter의 제어 하에 형광 단백질을 발현하도록 조작된 균주를 사용하면 유전자 발현 분포를 시각화할 수 있습니다.

또한, 염료를 함유한 배지에서 콜로니를 성장시키거나, 염색체의 특이적 다당류에 절편 후 염료를 첨가할 수 있습니다. 마지막으로, 여기에 제시된 바와 같이 투과 전자 현미경을 사용하여 더 높은 해상도로 샘플을 준비하고 이미지화할 수도 있습니다. 이 절차를 시도할 때 샘플의 취약성과 데이터 해석에 영향을 줄 수 있는 고정, 절편 또는 재수화를 통해 형광 및 구조적 인공물이 유입될 가능성을 염두에 두는 것이 중요합니다.

이 절차를 통해 형광 리포터의 발현 프로파일을 형태학적 특징 및 생물막의 Z축과 상관시키는 것과 같은 정량적 이미지 분석이 가능합니다. 이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 의학적 및 산업적 중요성을 가진 다양한 종의 생물막 형성 미생물에 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 파라핀 포매를 통한 절단을 위해 콜로니 생물막을 성장시키고 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.