Name: 파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 학습하세요 파라핀 포함 및 미생물 바이오필름 얇은 단면 제작 방법을 통해 유전자 발현 분포를 분석하는 기술입니다. 이 방법은 보존된 바이오필름 형태 내에서 고해상도 현미경 관찰이 가능합니다.

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이 작품은 NSF 경력 수상 1553023 및 NIH/NIAID 상 R01AI103369에 의해 지원 되었다.

1입니다. 녹 농 균 식민지 Biofilms의 성장
<ol><li>매체-Bilayer 접시의 준비<ol>
<li>10 g/L tryptone, 한 천 10 g/L를 준비 이온 물에서 ( 재료의 표참조) 솔루션.</li>
		<li>20 분 50-60 ° C에 시원한 물 욕조에 대 한 오토 클레이 브.</li>
		<li>100 mm x 100 mm 정사각형 접시에 agar tryptone 솔루션의 45 mL를 붓고 ( 재료의 표참조) 50 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여. 공고히 한 천 수 (20 ~ 30 분). 두 번째, 15 mL 레이어의 첫 번째 레이어 위에 붓는 다. 밤새 공고히 하자, 보풀 티슈로 닦아 하 여 필요한 경우 뚜껑에서 결로 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>식민지 Biofilms 안보<ol>
<li>관심 종자 파운드 한 천 격판덮개13 에 냉장고 주식에서 행진 하 고 37 ° C와 80-100% 상대 습도에서 12-16 h에 대 한 어둠 속에서 품 어.</li>
		<li>각 스트레인 또는 복제에 대 한 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 2 개 mL를 접종 하 여 37 ° C에서 12-16 h 250 rpm 동요에 대 한 어둠 속에서 품 어.</li>
		<li>서브 1: 100 파운드 신선 하 고 37 ° C에서 2.5-3 h 250 rpm에서 진동에 대 한 어둠 속에서 잠복기에 diluting 하 여 문화.</li>
		<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 하 고 살 균 파운드는 OD와 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 조정500 nm ~ 0.5의.</li>
		<li>원하는 서식 지에 따라 다릅니다 피펫으로 2.5-10 µ L (단계 1.1에서에서 준비) 매체 bilayer 플레이트에 셀 서 스 펜 션의 크기 하 고 자리 ~ 20 분 페 트리 뚜껑 열린 불꽃 근처 열려 떠나 건조 용이 하 게 수에 대 한 건조를 허용.</li>
		<li>최대 4 일 동안 어둠 속에서 25 ° C 및 80-100% 상대 습도에서 자리 식민지를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 통 솔루션의 준비
<ol><li>샘플 수확의 날에 통 솔루션을 준비 합니다. 1 x 4%의 최종 농도에 PBS에 37% 포름알데히드 (FA)를 희석 FA. 주의: FA은 휘발성과 독성이 있습니다. 보호 장비를 착용 하 고 통풍이 잘되는 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>즉시 사용 하기 전에 분해 4% 염 산 L-리 신 FA 50mm L 리 진 HCl의 최종 농도를 실 온에서 (단계 2.1에서에서 준비).</li>
</ol>3. [옵션] 식민지 Biofilm에 정착 액의 응용 프로그램을 직접
참고: 우리는 biofilm 형태학 agar 오버레이 고정 하기 전에 추가 될 때 가장 잘 유지 되는 발견 했다. 그러나,이 단계는 또한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 환경 조건에 변화를 구성 합니다. 따라서 여기에 설명 된 대로 있는 고정 단계는 실시 한 오버레이 추가 하기 전에 별도 프로토콜을 사용 하 여 형광 기자 식 패턴에 확인 한다.
<ol><li>고정, 그리고 환기가 증기 두건에서 한 일에 식민지의 가장자리, 그것은 그것을 잠수 없이 식민지의 주변에 도달 수 있도록 주위 agar 표면에 직접 2 단계에서 준비 하는 정착 제 플라스틱. 약 500 µ L. 허용 식민지 및 주변 agar에 확산 정착 액으로 많은 정착 액 만큼은 완전히 식민지를 둘러싸고에 적용 됩니다.</li>
	<li>일단은 정착 액 식민지 및 주변 미디어, 약 20-30 분에 완전히 흡수 되었으며 잔여 FA는 더 이상 접시에 표시, 단계 3.1을 반복 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액을 허용 합니다.</li>
	<li>일단은 정착 액 완전히 식민지로 흡수 되었으며 주변 미디어 반복 단계 3.1, 식민지의 표면에 직접 고정 제를 적용 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액, 진행 단계 4에만 모든 후 통 흡수 되었으며 더 이상 접시에 볼 수 없습니다.</li>
</ol>4. 오버레이 Agar와 식민지
<ol><li>고정 일에는 10 g/L 이온된 물과 분해에 10-20 분 압력솥에 한 솔루션 준비. 50 ˚C에 물 욕조에 멋진.</li>
	<li>부드럽게 붓는 다 15 mL agar 솔루션의 성장 매체 및 식민지. 5 분 (그림 1B)에 대 한 실 온에서 젤을 형성 하기 위하여 한을 수 있습니다.</li>
	<li>날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 최고 2 개의 층 사이 적 층 하는 식민지와 정사각형, 3 층 척을. 여러 샘플을 준비, 각 척 비슷한 크기로 잘라는 확인 합니다.</li>
	<li>부드럽게 식민지 포함 된 척에서 과도 한을 제거 합니다.</li>
	<li>척 (그림 1C)의 아래쪽 계층에서 agar (식민지 포함)의 2 개의 상위 계층을 해제, PBS 또는 물 1 주걱의 플랫 머리 젖은 하 고 부드럽게 위쪽 및 아래쪽 레이어 사이 삽입 합니다. 적 층된 식민지 아래 계층에서 분리 해야 합니다. 조심 하지 왜곡 하거나 그것의 기초에서 그것을 해제 하는 때 적 층된 식민지를 벤드 합니다.</li>
</ol>5입니다. 고정
<ol><li>적 층된 식민지 (즉, 2 층 척) 포함 카세트로 전송 즉시 환기가 연기 후드, 작업 ( 재료의 표참조), 화학 방지 마킹 펜으로 표시. 유리 슬라이드 우편물 포함 카세트를 넣습니다 (재료의 표 참조) 포함 하는 준비 단계 2.1-2.2에서에서 정착 액. 없음 기포 포함 카세트 안에 갇혀 있다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>하룻밤 실 온에서 어둠 속에서에서 정착 액에 샘플을 품 어.</li>
</ol>6. 샘플 처리: 버퍼 세척, 탈수, 개간, 및 침투
<ol><li>야간 고정 후 샘플 1 h 1 x PBS에 두 번 세척. 최상의 결과 얻으려면 시 균질 스핀을 사용 하 여 자동화 기능 자동 조직 프로세서의 낮은 설정으로 설정 (자료의 표 참조). 없는 프로세서를 사용할 수 있는 경우 처리는 수동으로 실행할 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h 각 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%)에서 에탄올 (EtOH) 희석의 등급된 시리즈를 통해 탈수로 버퍼 세척을 따릅니다.</li>
	<li>100%의 3 개의 세척 탈수 EtOH 각 실 온에서 1 h.</li>
	<li>100% 오렌지 오일 기반 개간 에이전트의 세 가지 세척 탈수 샘플 취소 (재료의 표 참조) 각 실 온에서 1 h.</li>
	<li>침투 지운된 샘플 두 번와 녹은 파라핀 왁 스 ( 재료의 표참조), 55˚C, 2 h에 대 한가 열.</li>
</ol>7. 샘플 포함
<ol><li>55 ˚C를가 열 하는 녹은 파라핀 왁 스 왁 스 몰드를 채우십시오. 온수, 편평한 주걱을 사용 하 여 신속 하 게 포함 카세트의 침투 척 물림 쇠 병렬 형의 기지에 달려 있도록 왁 스 금형에 전송. 물림 쇠에 과도 한 압력을 적용 하지 마십시오. 왁 스 금형 사용자 지정 3 차원 인쇄 될 수 있습니다 또는 상용 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>4 ˚C에서 하룻밤을 강화 하기 위해 왁 스를 수 있습니다. 고체 왁 스 몰드 샘플 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>왁 스가 고형화 되 면 금형에서 샘플을 삭제할 고 면도날으로 샘플 주위에서 과잉 왁 스 손질. 두고 과잉 왁 스 샘플, 단면, 평면에 평행한의 한쪽 끝에서 연장는 톰으로 클램프 하는 데 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 또한 샘플 주위 왁 스, 약 1 m m 두께의 칼 집 두고 그 얼굴을 부드럽게.</li>
</ol>8. 단면
<ol><li>42 ˚C에 물 목욕을 열. 잎의 가장자리에 수직으로 동쪽으로 향하게 하는 식민지의 표면으로 톰으로 샘플을 클램프 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>식민지의 원하는 평면 섹션을 수집 된 것입니다 도달 했습니다 때까지 샘플 50 µ m 간격으로 잘라.</li>
	<li>10 µ m 두께 섹션 75-80 rpm의 단면 속도 6-10˚의 허가 각도를 설정 하는 톰을 사용 하 여 원하는 수의 리본을 잘라. 뾰족한 붓을 사용 하 여 잎에서 리본을 분리.</li>
	<li>부드럽게 전송 파스퇴르 피 펫 (선호) 또는 집게의 끝에 물 한 방울을 사용 하 여, 물 목욕 리본. 섹션에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
	<li>즉시 물 욕조에 슬라이드를 삽입 하 고 45˚에서 리본 메뉴 아래에 위치.</li>
	<li>슬라이드 반투명된 레이블 바로 아래에 리본의 좁은 가장자리를 터치 합니다. 리본을 준수 해야 합니다.</li>
	<li>물 목욕, 물, 표면에 수직이 되도록 각도 조정 하 고 그것의 길이 따라 슬라이드에 대 한 평면을 리본 허용에서 슬라이드를 당겨. 리본 메뉴 아래 초과 물을 트래핑 하지 마십시오.</li>
	<li>부드럽게 서는 흡수 성 보풀 조직, 섹션에서 초과 물을 wicking에 슬라이드.</li>
	<li>종이 타월에 슬라이드를 어둠 속에서 하룻밤 실 온에서 건조 그것을 허용. 슬라이드는 어둠 속에서 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>9. 열 고정, 재, 및 장착
<ol><li>45 ˚C를 수준별된 핫 플레이트를 열. 30-60 분에 대 한 슬라이드를 열. 왁 스 것 이다 될 세미-녹은 평평 하 게 슬라이드에 대 한.</li>
	<li>부드럽게 핫 플레이트에서 슬라이드를 올리고 누워 부드러운, 수준별, 실내 온도 표면에 평면 녹은 왁 스 왁 스 굳은 (~ 1 분) 때까지 슬라이드의 어느 사이드를 당겨 하지 않습니다 보장 하기 위해 관리 사용 하 여.</li>
	<li>세척 사이 솔루션을 제거 하는 Büchner 흡 인기를 사용 하 여 각, 5 분에 대 한 에이전트를 비운의 4 개의 세척 슬라이드 왁 스 드 유리 슬라이드 메일러를 사용 하 여.</li>
	<li>100%에 슬라이드 세 번 씻어 EtOH 1 분.</li>
	<li>각 1 x PBS에이 분 세척 뒤 1 분 (95%, 70%, 50% 및 25%)를 처리 하는 역 순서에서 에탄올의 등급 시리즈에서 슬라이드 리하이드레이션</li>
	<li>즉시 Tris 버퍼 장착 매체에 섹션을 탑재 ( 재료의 표참조) 기포의 도입을 방지 하는 coverslip 적용. 하룻밤 실 온에서 유해를 장착 중간을 수 있습니다.</li>
	<li>일단 생산, 투명 매니큐어를 사용 하 여 슬라이드에 coverslip 인감. 봉인 된 슬라이드 4 ˚C에서 어둠 속에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

파라핀 포함 및 얇은 단면 조직 샘플은 고전적인 조직학 기술 마이크로 형태 구조의 이미징 수 있도록 진 핵 조직에 일반적으로 사용 되 고 약간의 성공을 함께 미생물 샘플8에 적용 된 ,9. Cryoembedding 생 및 immunofluorescent 신호의 강한 보존에 대 한 수, 파라핀 포함 바람직합니다 일반적으로 형태학16의 더 나은 보존을 제공 합니다. 이 방법을 응용 미생물 biofilms에 적응, 우리 우리의 시스템에 고유한 특성에 집중 했다. 세포 및 조직의 매트릭스 종종 함께 비교적 견고 하 게, 동안 유지 biofilms 경향이 더 섬세 한; 우리는 그러므로 일상적인 고정 및 샘플 보존을 극대화 하기 위해 프로토콜을 포함 하는 왁 스를 최적화. 그것의 성장 기판에 샘플을 유지 하 고 고정 직전 agar와 식민지를 오버레이 샘플 상단 이나 기지에서 손실 되지 않습니...

대부분 미생물 형태 biofilms 용량을가지고, 셀의 지역 사회 자체 제작된 행렬에 의해 함께 개최. Biofilms는 영양소와 기판의 다양 한 정권으로 물리적 설정의 많은 종류에 성장 될 수 있다. Biofilm 형성에 대 한 구체적인 분석 재현성 다세포 구조, 항복 하는 경향이 그리고 일반적인 아키텍처 phylogenetically 다양 한 종 지역 사회 또는 거시적인 수준에서 관찰 된다. 미생물 고체 매체는 대기권의 밑에 식민지로 재배 되 고, 거시적인 형태학 매트릭스 생산 용량에 대 한 정보를 전달 하 고 종종 다른 특성 1,2,3와 상관 관계가. 미생물 식민지의 내부 아키텍처 biofilm 특정 화학 및 생리학에 대 한 단서를 제공할 수도 있습니다 하지만 특성화 하는 어려운 되었습니다. 세균성 식민지를 cryoembedding 및 cryosectioning 기술의 최근 응용 프로그램 이미징 및 시각화 전례 없는 해상도 4,,56에서 특정 기능을 활성화 했습니다. 그러나, 동물 조직으로 연구는 파라핀 포함 형태 cryoembedding 7 에 비해 뛰어난 보존 하며 조직을 8,9에서 박테리아를 시각화 하는 데 사용 되었습니다 나타났습니다. 우리는 따라서 기정, 파라핀 포함, 그리고 미생물 식민지 biofilms의 얇은 단면에 대 한 프로토콜을 개발 했습니다. 여기, 녹 농 균 PA14 식민지 biofilm 얇은 섹션 10,11, 준비 설명 합니다 하지만 우리 박테리아에 의해 형성 된 biofilms에 또한 성공적으로이 기술을 적용 된 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae12.
파라핀 포함 및 얇은 단면 biofilms의 과정에는 간단한 논리를 다음과 같습니다. 먼저,는 biofilms는 처리 하는 동안 형태를 보존 하는 agar의 레이어 쌌 다. 둘째, 쌌 다 biofilms crosslink 고분자에는 정착 액에 잠긴, micromorphology를 유지. 이 알코올 탈수 한 다음, 더 비 극 지 용 매로 지워지고 액체 파라핀 왁 스와 함께 침투. 침투, 일단 샘플 단면에 대 한 왁 스 블록에 포함 됩니다. 섹션은, 슬라이드에 잘라내어 다음 그들을 원래의 상태로 돌아가도록 rehydrated. 이 시점에서 그들은 수 수 스테인드 또는 현미경 분석에 대 한 설치 매체에서.
이 프로토콜 조직학 분석을 위한 적합 한 미생물 biofilms의 얇은 섹션을 생성합니다. 이 메서드를 사용 하 여 준비 하는 얇은 단면도 가벼운 현미경 검사 법에 의해 군데 식민지 biofilm 콘텐츠의 표시 됩니다. Biofilms 또한 개별 기능에 대 한 특정 미디어 포함 형광 얼룩에 성장 하거나 재 단계 장착 (9.5-9.6 단계) 직전에서 스테인드 수 있습니다. 마지막으로, 미생물이 지역이 사회 내에서 셀 배포 또는 유전자 표현의 보고 제자리에 있도록 제정 또는 레 귤 레이트 된 패션에 형광 단백질을 생산 하기 위해 설계 될 수 있다. 식민지 biofilm 깊이, 셀 유통, 매트릭스 유통, 성장 패턴 및 spatiotemporal 유전자 발현을 확인 하기 위해 이러한 방법을 사용 했습니다.

<table><tbody><tr><td>5 3/4" 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>대학 바이오스토어에서 구입&nbsp;</td></tr><tr><td>한천&nbsp;</td><td>테크노바&nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner 흡인기 (진공) 플라스크&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>대학 바이오스토어에서 구입&nbsp;</td></tr><tr><td>화학적으로 저항성이 있는 마킹 펜</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>제조사: Leica</td></tr><tr><td>Clear Fingernail Polish&nbsp;</td><td></td><td></td><td>상점에서 구입한</td></tr><tr><td>콩고 레드 인디케이터 등급</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>제조사: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>제조사: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>제조사: Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Embedding Mold&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3D 프린팅 사내</td></tr><tr><td>임베딩 금형(상업용)&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&nbsp;</td><td>2701</td><td>univeristy biostores에서 구입&nbsp;</td></tr><tr><td>세밀한 팁 브러시</td><td></td><td></td><td>상점에서 구입, 페인트 브러시</td></tr><tr><td>Glass Coverslips 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Glass Rehydration Mailer&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 슬라이드 메일러&nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, 오렌지 오일 기반 청정제&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>제조사: National Diagnostics&nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Embedding Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신 염산염&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>로우 프로파일 마이크로톰 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>제조사: Sturkey&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로피펫&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>프로모 팩</td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁&nbsp;</td><td>댓글 섹션</td><td>보기 댓글 섹션</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>마이크로톰&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>모델: HM355S, 제조사: Microm, NON-CATALOG, 공급업체 카탈로그 # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>포름알데히드, 37% 수성 (포르말린)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (파라핀 왁스)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>제조사: McCormick Scientific&nbsp;</td></tr><tr><td>페트리 접시 광장 100x100x15mm</td><td>실험실 일회용 제품&nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨&nbsp;</td><td>EMD 화학&nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>인산염 완충 식염수의 성분, 사내에서 제조&nbsp;</td></tr><tr><td>인산칼륨&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>인산염 완충 식염수의 성분, 자체 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>면도날&nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>유니버시티 바이오스토어에서 구매&nbsp;</td></tr><tr><td>슬라이드 워머&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>NC0865259 NON-CATALOG, 공급업체 카탈로그 # 12857D</td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>인산염 완충 식염수 성분, 자체 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>인산나트륨&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>, 인산염 완충 식염수 성분, 자체 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>Suprafrost 조직학 슬라이드&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>조직 부양 수조&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>제조사: Ted Pella, 공급업체 카탈로그 # 28156-B</td></tr><tr><td>자동 조직 처리기&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>모델: STP120 조직 처리기</td></tr><tr><td>트립톤&nbsp;</td><td>테크노바&nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 biofilms의 얇은 단면

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

파라핀 포함 통해 단면 진 핵 시스템에는 광범위 하 게 설립된 기술입니다. 여기 제공 하는 고정 하는 방법 포함, 끼얹는다 파라핀 왁 스를 사용 하 여 그대로 미생물 식민지 biofilms의 단면. 식민지 biofilms에 사용 하기 위해이 메서드를 적용 하 우리 각 샘플의 성장 기판에 유지 하 고 agar overlayer와 코팅 기술을 개발 하 고 리 통 솔루션에 추가. 이러한 최적화는 샘플 보존 및 micromorphological 기능의 보존을 향상 시킵니다. 이 방식으로 준비 샘플 얇은 단면 및 빛, 형광, 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 이미징 의무가 있다. 우리는 녹 농 균, 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae식민지 biofilms에이 기술을 적용 했습니다. 세부 사항이이 메서드에 의해 생성 된 샘플에서 볼 수의 높은 수준의 결합 기자 스트레인 엔지니어링 또는 특정 염료를 사용 하 여 생리 및 미생물 지역 사회 개발에 대 한 흥미로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 메서드는 biofilm 얇은-섹션 점에서 뚜렷한 형태 기능 및 유전자 발현의 영역 DIC, 형광 현미경 검사 법, 그리고 가장 군데 될 수를 생성 합니다. DIC 이미징 기름 침수 목표 X 40을 사용 하 여 몇몇 형태학 상 특징 (그림 2E)를 표시 하기에 충분 한 수 있습니다, 우리는 발견 그 형광 현미경 constitutively 익스프레스 형광 단백질을 설계 하는 긴장의 향상을 제공 합니다 (그림 2D) 샘플 내 세포 분포의 시각화. 개별 섹션의 이미지 (그림 2B) 전체 식민지의 횡단면을 생성 하 고 거시적인 수준 (비교 전체적인 형태 구조 기능 지역화에 대 한 컨텍스트를 제공 함께 바느질 될 수 있다 그림 2A, B 및 C</str...

우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

이 절차의 전반적인 목표는 온전한 네이티브 형태학 내에서 형광 단백질 생산에 의해 보고된 유전자 발현의 분포를 평가하는 데 사용할 수 있는 파라핀 내장 생물막 절편을 생성하는 것입니다. 이 방법은 천연 생물막 구조의 맥락에서 분포된 외중합체 물질 생산에서 특정 유전자의 발현과 같은 미생물 군집 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생물막 단면의 보존된 형태 내에서 유전자 발현을 분석할 수 있는 동시에 뚜렷한 특징의 염색 및 공초점 또는 전자 현미경과 같은 고해상도 이미징과 같은 다운스트림 처리에 적용할 수 있다는 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 한천 트립톤 용액을 준비한 후 50ml 원뿔형 튜브를 사용하여 45ml의 용액을 100mm x 100mm 정사각형 접시에 붓습니다. 한천이 약 20-30분 동안 굳어지도록 합니다. 첫 번째 층 위에 두 번째 15mm 층을 붓고 밤새 굳히고 필요한 경우 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 뚜껑의 결로를 제거합니다.다음으로, 콜로니 생물막을 발견하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 얼어붙은 스톡에서 분리된 단일 P.Aeruginosa 콜로니를 성장시킨 후 2.5-10마이크로리터의 세포 현탁액을 배지 이중층 플레이트에 피펫팅합니다. 군체는 섭씨 25도의 상대 습도 80-100%의 어둠 속에서 최대 4일 동안 배양할 수 있습니다. 한천 용액 15ml를 성장 배지와 콜로니에 부드럽게 붓고 한천이 실온에서 5분 동안 젤을 형성하도록 합니다.그런 다음 날카로운 면도날을 사용하여 상단 두 층 사이에 콜로니가 적층된 정사각형 3층 척을 자릅니다. 여러 샘플을 준비하는 경우 각 척이 비슷한 크기로 절단되었는지 확인하십시오. 척이 포함된 식민지에서 여분의 한천을 부드럽게 제거합니다.그런 다음 주걱의 평평한 머리를 PBS 또는 물에 적시고 한천의 위층과 아래층 사이에 부드럽게 삽입합니다. 라미네이트된 콜로니를 내화학성 마킹 펜으로 라벨링된 임베딩 카세트로 즉시 옮깁니다. 임베딩 카세트를 미리 준비된 정착제가 들어 있는 유리 슬라이드 메일러에 넣습니다.샘플을 처리합니다. 1X PBS를 사용하여 각각 1시간씩 두 번 세탁하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 자동 조직 처리기의 스핀 기능에 대한 낮은 설정을 사용하여 시약 균질화를 자동화하십시오.샘플을 삽입하려면 섭씨 55도로 가열된 용융 파라핀 왁스로 왁스 몰드를 채운 다음 가열된 평평한 주걱을 사용하여 임베딩 카세트에서 침투된 척을 왁스 몰드로 빠르게 옮겨 척이 금형 바닥과 평행하게 놓이도록 합니다. 왁스가 섭씨 4도에서 밤새 굳어지도록 합니다. 고체 왁스로 성형 된 샘플은이 온도에서 무기한 보관 될 수 있습니다.왁스가 응고되면 금형에서 샘플을 절제하고 면도날을 사용하여 샘플 주변에서 과도한 왁스를 다듬습니다. 샘플의 한쪽 끝에서 뻗어 있는 왁스를 남겨 두어 마이크로톰에 고정하는 데 사용할 수 있습니다. 왁스가 포함된 샘플을 다듬어 모양이 부드러운 선형 리본을 쉽게 수집할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.트리밍의 작은 결함으로 인해 리본에 아티팩트가 생성되고 섹션의 무결성이 손상될 수 있습니다. 다음으로 수조를 섭씨 42도로 가열합니다. 그런 다음 샘플을 집락의 표면이 블레이드 가장자리에 수직으로 향하도록 하여 마이크로톰에 고정합니다.군집의 원하는 평면에 도달할 때까지 샘플을 50마이크로미터 간격으로 자르고, 여기에서 절편 속도가 75-80RPM이고 간격이 6-10도인 간극 각도로 설정된 마이크로톰을 사용하여 절편을 수집합니다. 원하는 수의 10마이크로미터 두께 섹션의 리본을 자릅니다. 그런 다음 끝이 가는 페인트 브러시를 사용하여 블레이드에서 리본을 분리합니다.이제 파스퇴르 피펫 끝에 집게 또는 물 한 방울을 사용하여 리본을 수조에 부드럽게 옮깁니다. 즉시 슬라이드를 수조에 삽입하고 리본 아래에 45도 각도로 배치합니다. 리본의 좁은 가장자리를 젖빛 라벨 바로 아래의 슬라이드에 닿게 합니다.리본이 부착되어야 합니다. 수조에서 슬라이드를 당겨 빼내고 각도를 조정하여 물 표면에 수직이 되도록 하여 리본이 길이를 따라 슬라이드에 평평하게 놓일 수 있도록 합니다. 리본 아래에 과도한 물이 갇히지 않도록 하십시오.슬라이드를 흡수성 보푸라기가 없는 티슈 위에 부드럽게 세워 섹션에서 과도한 물을 흡수합니다. 그런 다음 슬라이드를 종이 타월에 놓고 실온에서 밤새 어둠 속에서 말리십시오. 수평을 이룬 핫 플레이트를 섭씨 45도까지 가열하고 슬라이드를 플레이트에 30-60분 동안 놓습니다.왁스는 반 용융되어 슬라이드에 대해 평평해집니다. 핫 플레이트에서 슬라이드를 부드럽게 들어 올려 왁스가 응고될 때까지 약 1분 동안 매끄럽고 평평한 실온 표면에 평평하게 놓습니다. 용융된 왁스가 슬라이드의 어느 쪽으로도 당겨지지 않도록 하십시오.유리 슬라이드 메일러 안의 샘플을 사용하여 각각 5분 동안 투명제를 4회 세척하여 슬라이드를 디왁스합니다. Buchner 흡입기를 사용하여 세척 사이에 용액을 제거하십시오. 100% 에탄올을 사용하여 슬라이드를 각각 1분 동안 세 번 세척합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 슬라이드를 재수화한 후 즉시 트리스 버퍼 장착 매체에 섹션을 장착하고 커버슬립을 적용합니다. 단면 주위의 오버레이 한천은 고정제와 반응하지 않으므로 차드 슬라이드에 부착되지 않습니다. 이 한천은 재수화 중에 빠져나와 단면을 손상시킬 수 있으므로 재수화 중에 용액을 휘젓지 않도록 주의해야 합니다.장착 매체가 밤새 실온에서 중합되도록 합니다. 중합이 완료되면 투명 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 밀봉합니다. 마지막으로, 밀봉된 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에 무기한 보관하십시오.40배 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하는 DIC 이미징은 생물막 얇은 부분의 일부 형태학적 특징을 보여주기에 충분할 수 있지만, 형광 단백질을 구조적으로 발현하도록 설계된 균주의 형광 현미경 검사는 샘플 내 세포 분포에 대한 향상된 시각화를 제공합니다. 이 패널에서 볼 수 있듯이 개별 섹션의 이미지를 함께 연결하여 전체 군체의 단면을 생성하고 거시적 수준에서 전체 형태 내에서 구조적 특징의 지역화에 대한 컨텍스트를 제공할 수 있습니다. 특정 promoter의 제어 하에 형광 단백질을 발현하도록 조작된 균주를 사용하면 유전자 발현 분포를 시각화할 수 있습니다.또한, 염료를 함유한 배지에서 콜로니를 성장시키거나, 염색체의 특이적 다당류에 절편 후 염료를 첨가할 수 있습니다. 마지막으로, 여기에 제시된 바와 같이 투과 전자 현미경을 사용하여 더 높은 해상도로 샘플을 준비하고 이미지화할 수도 있습니다. 이 절차를 시도할 때 샘플의 취약성과 데이터 해석에 영향을 줄 수 있는 고정, 절편 또는 재수화를 통해 형광 및 구조적 인공물이 유입될 가능성을 염두에 두는 것이 중요합니다.이 절차를 통해 형광 리포터의 발현 프로파일을 형태학적 특징 및 생물막의 Z축과 상관시키는 것과 같은 정량적 이미지 분석이 가능합니다. 이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 의학적 및 산업적 중요성을 가진 다양한 종의 생물막 형성 미생물에 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 파라핀 포매를 통한 절단을 위해 콜로니 생물막을 성장시키고 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

빛과 전자 현미경에 대한 sectioning 수 있도록 효모 식민지를 포함하는 방법. 이 프로토콜은 곰팡이 지역 사회 내에서 세포 유형의 조직을 이해하는 방향으로 새로운 도구를 제공하는 식민지 이내 sporulated 세포 pseudohyphal 세포의 분포의 결정 수 있습니다.

효모 콜로니 임베딩 방법

다음 비디오는 포르말린 고정 및 파라핀 임베딩으로 조직의 형태를 보존하는 방법을 설명합니다.

포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 보존: 조직 형태학 연구 방법

출처: Bucher, T. 외, 『B. subtilis 바이오필름 연구를 위한 소분자 바이오필름 억제제 특성화 모델로서의 방법론』. J. Vis. 경험(2016)이 영상은 고해상도 이미징을 위해 성숙한 박테리아 바이오필름 집락을 준비하는 과정을 보여줍니다. 고정, 탈수, 장착, 금속 코팅 단계를 다루어 바이오필름 형태를 보존하고 시각화합니다.

형태학적 분석을 위한 박테리아 바이오필름 군락 준비

이 비디오는 현미경을 사용하여 곰팡이 균사에서 박테리아 생물막을 성장시키고 정성적으로 분석하는 방법을 설명합니다. 박테리아 생물막은 곰팡이 표면에 자주 형성되며 대사 협력, 경쟁 또는 포식과 같은 수많은 박테리아-곰팡이 상호 작용 과정을 포함합니다.

진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법

본 연구는 생물막 억제제와 Bacillus subtilis 다세포성에 미치는 영향을 연구하기 위한 재현 가능한 방법론의 개발을 제시합니다.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

칸디다 알비칸스 생물막의 내부 특징을 보고 정량화하기 위해 굴절률 매칭을 통해 명확히 된 고정 된 손상되지 않은 표본을 준비합니다. 이어서, 광학 단면 현미경 검사법은 생물막의 전체 두께를 가하지만 3차원 이미지 데이터를 얻기 위하여 이용될 수 있다.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

여기에서 자사는 100μm에서 수 밀리미터 범위의 고정 3차원 세포 배양 모델의 염색 및 세포내 분해능 이미징을 수행하기 위한 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜을 제공하여 형태, 세포 유형 구성 및 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

학습하세요 파라핀 포함 및 미생물 바이오필름 얇은 단면 제작 방법을 통해 유전자 발현 분포를 분석하는 기술입니다. 이 방법은 보존된 바이오필름 형태 내에서 고해상도 현미경 관찰이 가능합니다.

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

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