Name: 공부 Varicosity 형성 및 중앙 신경 축 삭에서 복구 하기 위한 Microbiomechanical 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 중추 신경 축삭에서 가소성 형성과 회복 메커니즘을 연구하는 가압 유체 기법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 뇌 손상 치료 및 신경 세포 형태 변화 연구에 활용됩니다.

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모든 동물 실험 지침에 따라 국립 연구소의 건강 동물 사용 실시 되었습니다. 이 작품은 C. 번에 건강의 국가 학회 (R01NS093073 및 R21AA024873)에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 되었다.

아래에서 설명 하는 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 오하이오 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. Coverslip 준비
<ol><li>70% 질소 산을 포함 하는 유리 비 커에 12 m m 또는 25 mm coverslips의 하나 이상의 상자를 놓고 하룻밤 실 온에서 coverslips를 품 어. 참고: 12 m m coverslips로 같은 비 커에 25 mm coverslips 씻지 않는. 별도로 그들을 세척 하는 것이 낫다.</li>
	<li>가득한 ddH2O의 2.5 L 4 L 비 커에 모든 coverslips를 전송 하 고 100 rpm에서 1 h에 대 한 coverslips를 포함 하는 비이 커를 흔들어. 고무 밴드를 사용 하 여 비 커를 동요 하는 동안. 4 번 신선한 2.5 L ddH2O와 린스를 반복 합니다.</li>
	<li>금속 커버와 함께 건조 플라스 크를 청소 coverslips를 전송 합니다. Coverslips 6 h 225 ° C에서 오븐에 구워 고 실내 온도에 냉각 하도록 허용. 참고: 25 mm coverslip 끊기에 수 그린 이다. Coverslips 하나 하나를 분리 하 고, 건조 한 공기 다음 오븐에 구워.</li>
	<li>사용법까지 멸 균된 플라스틱 컨테이너에 실 온에서 건조 및 청소 coverslips를 저장 합니다.</li>
	<li>
코트는 coverslips 다음과 같습니다.
	<ol>
<li>원심 분리기 튜브에서 신선한 코팅 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>24-잘 (또는 6 잘) 접시의 한 잘에 각 coverslip을 넣으십시오. 12 m m (또는 25 mm) coverslip 소용돌이에 coverslip 코팅 솔루션 (표 1)의 30 (또는 100) µ L를 놓습니다. 우물에 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 조직 문화 등급)의 1 mL를 추가 합니다. 이 판 수 중 즉시 사용 또는 주일에 대 한 살 균 PBS에 4 ° C에 저장 될.</li>
		<li>해 부의 날, PBS를 제거 합니다. 건조 하 고 자외선 (30W) 2-4 h 아래 접시를 놓습니다. 참고: 마지막 단계 세포 문화 층 류 두건에 UV 빛과 완료 되어야 한다. 후드의 문은 coverslips를 건조 공기 흐름을 허용 하도록 약간 해제 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 해 부, 분리, 및 임신 마우스/쥐에서 Hippocampal 신경의 문화
<ol><li>
해 부와 문화에 대 한 hippocampal 신경의 분리
	<ol>
<li>Protease 효소 솔루션 (3 mg/mL protease 23 된, 표 1에서) 해 동 및 중 도금을 따뜻한 미디어 (표 2) 37 ° c.</li>
		<li>해 부 해 마 그리고 이전 게시14에서 설명 하는 방법에 따라 된, 린스. 참고: 4 개의 된 한 24-잘 또는 한 6 잘 플레이트에 대 한 충분 한 세포를 제공합니다.</li>
		<li>제거 된 프로 테아 제 효소 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c, 5% CO2 15 분 샘플을 품 어.</li>
		<li>해 마 explants 도금 매체의 5-10 mL와 함께 두 번 세척. 중 도금의 5 mL를 추가 합니다. 1 mL 플라스틱 팁을 피 펫을 사용 하 여 작은 소용돌이 생성 하 여 단일 세포로 hippocampal explants 해리. 플라스틱 아래로 약 40 배, 유지 산소 거품, 솔루션은 흐린 됩니다 때까지 explant의 더 큰 조각을의 형성을 방지. 참고: 세척 하는 동안 몇 가지 미디어를 떠나 기억, hippocampal explants 전체 과정에서 매체에 잠긴 남아 있어야 한다.</li>
		<li>1125 x g 3 분 제거 셀으로 상쾌한 미디어에 빠져들에 대 한에 셀 원심 미디어를 도금의 145 ml 셀 resuspend 셀 서 스 펜 션의 1 mL/잘 24-잘 접시 (3 mL/잘 6 잘 플레이트)를 추가 합니다. 참고: 미디어를 도금의 145 mL 낮은 세포 밀도 세포 현 탁 액을 생산 하기 위해 사용 됩니다. 이 볼륨에는 6 24-잘 접시, 8 6-잘 접시, 또는 실험 실시에 따라 24-또는 6-잘 접시의 다양 한 조합으로 셀의 도금 수 있게 됩니다. 24-잘 접시의 각 잘 약 3 x 104 의 세포9있을 것 이다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 2-4 h에서 도금 미디어에 셀을 품 어 다음 모든 도금 미디어를 제거 하 고 신선한 유지 보수 미디어 바꿉니다.</li>
		<li>2 일 후 ( 체 외에서2 일, 2DIV), 대체 미디어의 절반 2 µ M 섬유 아 세포, 내 피, 그리고 glial 세포의 성장을 억제 유지 미디어에 녹아 있는 아 라-C (arabinosylcytosine). 이틀 동안 아 라-c 셀을 노출 후 미디어를 신선한 유지 보수 미디어 바꿉니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection 세포 형태학의 시각화를 위한 참고: Transfect 녹색 형광 단백질 (GFP), 노란 형광 성 단백질 (YFP), mCherry, 개별 뉴런의 형태를 밝히는 등 의 형광 구문으로 셀.<ol>
<li>Opti 메모리 미디어 (Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 구조물의 0.8 µ g)와 소용돌이로 재고 (1 µ g / µ L)에서 구조를 희석. 각 잘 1 구문 희석을 준비 합니다. 참고: 24-잘 접시 Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 구문의 0.8 µ g을 필요합니다. 6 잘 플레이트 구문 150 µ L Opti 메모리 미디어에서 2.4 µ g이 필요합니다.</li>
		<li>Opti 메모리 미디어 (Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 transfection 시 약의 1.5 µ L)와 소용돌이 transfection liposome 중재 시 약 희석. 각 잘 1 transfection 희석을 준비 합니다. 참고: 24-잘 접시 Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 transfection 시 약의 1.5 µ L를 필요합니다. 6 잘 플레이트 4.5 µ L을 Opti 메모리 미디어의 150 µ L에서 transfection 시 약의 필요합니다.</li>
		<li>Opti 메모리 미디어와 소용돌이 Opti 메모리 미디어와 transfection 시 약에 구성의 1:1 혼합물 (100 µ L)를 준비 합니다. 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어. 참고: 잘, 당 이어야 한다 약 100 µ L 24-잘 접시 (6-잘 접시 300 µ L)을 사용 하는 경우 구문, transfection 시 약 및 Opti 메모리 미디어를 포함 하는 솔루션의.</li>
		<li>각 우물에서 미디어 (24-잘 접시, 6 잘 플레이트 1.5 mL 500 µ L)의 절반을 제거 하 고 깨끗 한 원뿔 관으로이 매체를 전송. 인큐베이터에이 튜브를 유지. 다음 우물에 있는 나머지 미디어를 100 µ L 혼합물 (2.2.3 단계)를 추가 합니다. 20-30 분 동안 37 ° C에서 품 어를 셀 수 있습니다.</li>
		<li>인큐베이션 (2.2.4 단계) 동안 신선한 유지 보수 미디어의 볼륨 원뿔 튜브 (단계 2.2.4)에 미디어를 추가 합니다. 같은 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 혼합물을 놓습니다.</li>
		<li>외피, 다음 우물에서 transfection 솔루션을 포함 하는 모든 미디어를 제거 하 고 1:1 혼합물의 원뿔 튜브 (단계 2.2.5)에 신선한 유지 보수 미디어와 그것을 대체 합니다. 참고: 구문의 크기에 따라 세포 수 있습니다 시작 12 h; 내 표현 더 큰 구조에 대 한 3-4 일의 구문이 피크 식에 도달 하기 전에 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Puffing 피 펫 장치 설정
참고:이 설정에 5 개의 기본 구성 요소가 있습니다: 유리 피 펫, 튜브, 주사기, micromanipulator, 그리고 버퍼 (행 크). 이 설정에 관련 된 순수 소금 농도 모든 버퍼를 사용 수 있습니다.
<ol><li>붕 규 산 피 펫 45 µ m 직경 오프닝 팁 micropipette 끌어당기는 사람 및 사양 표 3에 사용 하 여 주위를 당겨. 참고: 그것은 발견 하는 45 µ m 실험 조건 하에서 여 피 펫의 직경에 대 한 적당 한 크기입니다. 오프닝 크기에 약간의 변화가 크게 미치지 않습니다 결과. 그것은이 숫자에서 큰 출발, 튜브를 통해 피 펫에 연결 되는 주사기의 높이 조정 하 여 varicosity 유도 여전히 작동 해야 하지만이 압력 값의 재를 필요 합니다.</li>
	<li>얇은 고무 튜브에 피펫으로 취소 가져온된 끝을 삽입 합니다. 참고: 튜브 벽 얇고 주사기의 높이 무시할 수 저항 피펫으로 통해 흐르는 액체의 압력에 직접 비례 보장 유체 저항을 최소화 하기 위해 엄격한 해야 합니다. 튜브 보다는 저항을 최소화 하는 길이 더 약 0.6 m 이상 이어야 한다.</li>
	<li>회전 수 밸브와 커넥터를 통해 10 mL 플라스틱 주사기에 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 참고: 플라스틱 주사기는 피 펫에서 흐르는 가정된 압력에 대 한 정확한 측정을 보장 하기 위해 일정, 측정 높이에서 개최 될 필요가 있다. 이 최소한의 압력을 제공 하지만 안정적으로 유도 하는 축 삭에 varicosities 190 m m의 높이 이용 되었다. 다른 높이 값 압력 coverslip 표면에서 분리 하는 세포가 발생할 경우에 사용할 수 있습니다. 실험을 통해 동일한 설정을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>장소에는 피 펫 잡아 micromanipulator 나사 상단에 피펫으로 삽입 합니다. 고무 튜브를 연결 하는 곳 바로 위에 피 펫의 유엔 가져온된 끝 보유 하 고 있도록 micromanipulator 팔에 부착 된 금속, 평면 올랐다 나사를 나사. 각도 45 ° 각도 신경 포함 된 coverslips의 표면에 피 펫. 참고:는 micromanipulator 피펫으로 constricting 고무 튜브 없이 개최 될 수 있도록 건설 되어야 한다. micromanipulator 셀의 범위 내에서 정확 하 게 위치를 x, y 및 z 방향에서 피 펫의 움직임을 허용 해야 합니다. 그래픽으로 기구의 사진 (그림 1) 아래 제공 됩니다.</li>
	<li>형광 필터, 조리개를 열고 켜고 보장 형광 자리는 목표를 통해 오고 볼 수 있습니다. micromanipulator를 사용 하 여 형광 자리 끝까지 라인을 피펫으로 세포 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 높이 보다 큰 위치에 낮은 위치에 피펫으로 이동 합니다. 그것은 위치에, 일단 전송 빛 하 고 형광을 끄십시오.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여, 추가 한 coverslip (피펫으로 쪽으로 향하도록 셀) 셀 문화 판에서 실 온에서 행 크의 버퍼의 약 2 mL를 포함 하는 셀 문화 접시에.</li>
	<li>포함 하는 범위에 coverslip 문화 접시를 놓습니다.</li>
	<li>정밀한 초점 손잡이 및 20 X 목표 using, 셀 (약 0.4 m m) 보다 약 4 전체 회전 평면에 초점. micromanipulator를 사용 하 여 초점을 맞춘 고 센터, 눈 조각을 통해 본 비행기의 왼쪽에에서 피 펫 팁의 위치. 참고: 모 수석 세포 체에서 발생 같은 프레임에 있어야 하는 프로젝션 됩니다. Axonal varicosities 유도, 한 중간과 원심 축 삭을 세포 체에서 더 이상 예측을 따라야 한다.</li>
</ol>4. 보정 Stretchable 막 시스템을 활용 하 여 피 펫의 압력
<ol><li>﹙ 실리콘 막 (직경에서 500 µ m) 및 50 µ m 두께 포함 하는 시스템을 통해 위에서 설명한 대로 정확한 동일한 매개 변수와 함께 puffing 피 펫 장치를 설치 하 고 막의 표면에 현미경을 집중 한다. 참고:이 시스템 작은 압력 값을 측정 하도록 설계 되었습니다 및 시스템에 대 한 설명10전에 게시 되었습니다. 이 측정만 한 번 피의 정확한 동일한 설정을 사용 하는 경우 실험 피에 대 한 필요가 있다.</li>
	<li>센터 사이 측정 현미경 (4 µ m 직경에서)와 10 µ m 간격, microdots 배열에 초점. 스톱 밸브를 설정 하 고 피펫으로에서 흐르는 액체를 허용 합니다. 유체 압력에 응답에서 막의 편향 confocal 현미경으로 검사 합니다.</li>
	<li>막의 편향와 관련 된 해당 압력을 결정 하는 선형 모델을 활용 합니다. 참고: 동안 최근 연구 발견 w의 편향-3.143 = 0.69 ± µ m 높이 190 m m 주사기에 대 한 얻은,이 생산은 생리 적 및 병 적인 범위 내에서 하지만 현재 피 펫 설정에서 0.25 ± 0.06 nN / µ m2 의 압력에서 주사기 높이 유일한 결정 요인이 아니다. 다른 요인 뿐만 아니라, 신경에 피 펫 열기, 위치 (거리 및 각도)의 세포, 및 튜브4,10의 유연성도 피 펫 팁을 포함 하 여 정확한 압력 값 영향.</li>
</ol>5. 피 Varicosities 유도 하
<ol><li>일단 피펫으로 위치에 현미경 관심 영역을 포함 하는 비행기에 초점. 오른쪽은 피 영역 외부 puffing 영역 내에서 이미지 필드 (카메라의 라이브 캡처 볼)의 왼쪽된 절반에 셀, 프로세스를 배치 합니다. 참고: axons의 광범위 한 파생물과 뉴런의 dendrites, 그것 아니다 신경의 모든 프로세스 영역 내에서 동일한 puffing 가능성이. 이것은 실제로 피의 현지 효력의 검사를 수 있는이 시스템의 장점 중 하나 이다. 거기 두 가지 유형의 피 varicosities 유도를 활용할 수 있는: 오랜 기간 피 고 펄스 피.</li>
	<li>
피
	<ol>
<li>오랜 기간 피<ol>
<li>교양된 신경4를 포함 하는 coverslip 위에 190 m m 높이에 주사기를 놓습니다. 분명 신경 형태학을 계시 하는 최적화 된 노출 시간 시간 경과 영상 관심 분야의 시작. 기준으로 2 s 간격 (30 s 총)에서 적어도 15 프레임을 캡처하십시오. 간격 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 16 프레임에서 주사기의 턴 수 스톱 밸브 열고 75 프레임에 대 한 흐름을 액체 허용 (150 s). 프레임 75, 해제 밸브는 유체 흐름을 중지 합니다. 비디오 캡처를 중지 합니다. 참고:이 한다 유도 신경 axonal varicosities 이내 5-10 s, 7-9 DIV 반면 오래 된 뉴런 양식 varicosities 데 시간이 걸릴.</li>
		</ol>
</li>
		<li>펄스 (2 s 기간) 피<ol>
<li>적절 한 높이 (190 m m)에 주사기를 놓습니다. 시간 경과 화상 진 찰을 시작 하 고 적어도 15 프레임 (30 s) 2 s 간격에. 16 프레임, 주사기의 밸브 및 유체 흐름, 허용 열고 밸브를 다시 열기 전에 (테스트 주파수)에 따라 2 s. 대기 5-20 s 후 밸브를 닫습니다. 유체 펄스를 만들고 150-300 미 계속 시간 20 분에 대 한 이미징 복구 단계를 캡처의 전체 기간에 대 한 계속 밸브의 개폐를 반복 합니다. 참고: 때 간격 보다 깁니다 10 s, 펄스 유도 크게 덜 varicosities. 20 s 간격에 아무 varicosities 펄스4에 의해 유도 될 수 있다. 안정적이 고 일관 된 varicosity 형성을 얻기 위해 주사기 높이 이어야 한다 약 190 m m. 주사기 높이 및 유체 압력 해야 어디 셀 coverslip 표면에서 분리 시작 지점에 발생 하지 것이 좋습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>사용 일 하기 전에 흐르는 10 mL 70%에 대 한 설정 (피 펫, 튜빙, 및 주사기) 청소 설정 통해 에탄올. 에탄올에 따라 세척, 행 크의 버퍼 (또는 원하는 버퍼) 10 mL를 그 날의 사용에 대 한 시스템 설정 통해 흐름. 하루 마무리 실험 청소로 설정 후 하룻밤 오염 물질의 성장을 방지 하기 위해 에탄올 기술 이전.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 칭찬 방법
참고: puffing 분석 결과 소개 섹션에서 설명 하는 다른 기술의 다양 한 결합 될 수 있다. 여기, 초점 puffing 분석 결과, 고해상도 형광 timelapse 이미징, 칼슘 이미징 및 복구 분석을 포함 하 여 함께 가장 자주 사용 되는 핵심 기술입니다. 이러한 아래에 설명 됩니다.
<ol><li>
프로토콜 아래에 따라 고해상도 형광 시간 경과 화상 진 찰을 실시
	<ol>
<li>오일 렌즈 X 100 뉴런 내 단백질 붙일 태그의 움직임을 추적 합니다. 신경 세포는 적절 한 cDNA 구조물과 페. 150 프레임 캡처 (총 300 s) 2 s 간격으로. 참고: 때때로, 다중 색상 시간 경과 영상 동시에 하나 이상의 붙일 태그가 단백질의 움직임을 이미지를 수행 됩니다.</li>
		<li>비디오 캡처 소프트웨어를 통해 또는 ImageJ (NIH)를 통해 kymograph를 생성 합니다. 참고: 속도 여행의 방향을 결정할 수 있습니다는 kymograph를 사용 하 여. * 물론 soma 지역에서 속 인 다 방향 참고 캡처됩니다. Soma 향해 여행 axonal 끝에 soma 멀리 여행 참가자는 역행, 이다.</li>
		<li>Puffing 분석 결과 중 이미지 캡처를 사용 하 여 만들 수 피, 또는 kymograph에 따라이 프로세스를 반복 합니다. 참고: 미토 콘 드리 아와 시 냅 스 단백질의 axonal 전송에 피의 효과 최근 종이4에 표시 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
칼슘 이미징
	<ol>
<li>(24-잘 접시)에 대 한 1 µ L 또는 5mm Fluo-4 (6-잘 접시)에 대 한 3 µ L 추가 미디어에서 잘 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 문화에 오전.</li>
		<li>1 mL 행 크의 버퍼와 두 번 셀을 씻어. 참고: 로드 된 뉴런 FITC 필터 집합을 통해 녹색 형광을 방출 한다. Loci 셀 내에 감지할 칼슘의 영역을 나타냅니다. 피와 결합 하면, 강도 (내부 칼슘 수준에 증가) 증가 볼 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Varicosity 복구 참고: 즉시 puffing 실험 다음 20 분 복구 실험 수행할 수 있습니다.<ol>
<li>300 프레임에 대 한 이미지를 캡처 (1200 s) 4 s 간격으로. 참고: 가용성 YFP/mCherry/GFP와 페 셀 표시 합니다 적당 한 수준 (50% 미만) 복구의 이미징 세션의 끝에 의해. Axonal 복구는 등 여러 가지 요인, 교양된 신경4의 발달 단계에 따라 달라 집니다. 이 또한 고해상도 형광 이미징 및 칼슘 이미징 위에서 설명한와 결합 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 microbiomechanical 분석 결과의 절차는 똑 바른 앞으로 이다. 그것은 그것의 모든 단계는 신중 하 게 실시 하는 경우 신뢰할 수 있는 결과 생산할 예정 이다. 잘못 수행 하는 경우 성공적인 데이터 수집을 방해 것입니다 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 중요 한 단계 시작 상류 puffing 자극의 실제 응용 프로그램의. 조심 해 부, 경작, 및 관리의 기본 신경 문화는 답해야 합니다. 교양된 신경 건강 한 있다면, 그들은 것입니다 반응 하지 않을 일관 되 게, 이후 그들은 수도 이미 되어 액 스트레스에 대 한. 문화, 초기 설정 및 varicosities 유발 한다 하지만 coverslip 표면에서 세포의 분리를 일으키지 것입니다, 인내심을가지고 수행 해야 일관 된 압력을 제공 하기 위해 puffing 기구의 교정의 다운스트림. 설정의 정확한 구경 측정 피 펫 막힘, 배관, 또는 밸브 문제 1 시간을 걸릴 수 있습니다. 그것은 액체 접시에 셀 배치 및 피 펫 팁 위치 앞으로 이동 하기 전에 최소한의 저항으로...

Varicosity 형성, 또는 붓기/구슬, 축 삭을 따라 neurodegeneration 많은 장애 또는 다 발성 경화 증, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병를 포함 하 여 중앙 신경의 상해에서 관찰의 눈에 띄는 기능입니다 그리고 충격 뇌 부상1,2. 활동 전위 전파와 시 냅 스 전송3axonal varicosities의 중요 한 생리 적 영향에도 불구 하 고는 varicosities는 생성 하는 방법을 알 수 없는 남아 있습니다. 최근, 설치류에서 교양된 hippocampal 신경에 새로 설립 된 microbiomechanical 분석 결과 사용 하 여, 우리 기계적 자극에 매우 흥미로운 기능으로 이러한 뉴런 varicosities 일으킬 수 발견. 첫째, varicosity 유도 급속 하다 (< 10 s) 고이 프로세스는 예기치 않게 뒤집을 수. 둘째, varicosity 개시 압력 피 강도 따라 달라 집니다: 높은 압력, 빨리 개시. 셋째, varicosity 개시 신경 연령에 따라 달라 집니다. 젊은 신경의 축 삭 이전 뉴런의 그에 비해 기계적 스트레스에 더 반응이 나타납니다. 넷째, dendrites 이러한 뉴런의 초기 축 삭 세그먼트 동안 hippocampal 신경의 축 삭을 따라 varicosities 폼 같은 puffing 조건 변경을 표시 합니다. 따라서, 우리의 연구는 신경 극성의 새로운 기능을 공개 했다. 생체 외에서 시스템으로 이러한 결과 생리 적으로 관련. 우리 axonal varicosities 가까이 두개골 영향, 우리의 생체 외에서 일치 직후 쥐의 somatosensory 피 질에서 다중 초점 방식에서 개발 했다 온화한 외상 성 뇌 손상 (mTBI)에 대 한 vivo에서 모델을 사용 하 여, 결과4. 그것은 중요 한 우리의 얼룩 및 이미징 mTBI 쥐의 신경 형태학 변화의 스냅 샷 제공, vivo에서 수행 이후 기계적 영향 동안 신경 형태학의 시간 경과 이미징이 가능 하지.
이 액체 피 시스템 수 있었습니다 관련 기계적 스트레스 유발 varicosity 형성 된 독특한 기능을 잡으려고 뿐만 아니라 기본 메커니즘을 확인 하. 테스트 함으로써 다른 세포 외 솔루션, 차단제와 mechanosensitive 이온 채널, 세포 생리학의 다른 후보자의 오프너, 우리는 일시적인 수용 체 잠재력 양이온 채널 인도의 V 회원 4 (TRPV4) 확인 채널을 캘리포니아2 + 그리고 Na+ 에 침투성 피 활성화는 주로 axonal varicosity 형성4초기 기계적 스트레스를 감지 합니다. 이 추가 siRNA 녹아웃 방식으로 확인 되었다. 함께,이 새로운 분석 결과 시스템 hippocampal 신경 문화 개발 했습니다 찍은, 다른 기술을 조합에 특히 중앙 신경의 micromechanical 속성을 공부에 대 한 매우 귀중 한입니다.
우리는 설립이 micromechanical 시스템와 독특한 몇 가지 주요 측면에서 이전 기존 시스템에서 다릅니다. 첫째,이 시스템에는 신경 압축 및 전단의 형태로 비행기 밖으로 기계적 스트레스 경험. 기계적 충격, 동안 신경 프로세스 coverslip 표면에 부착 된 유지 하 고 이동 하지 않습니다. 이 다른 실험 주로 절곡 하 고 비행기에서 스트레칭 관련 시스템 (또는 긴장)와 다른, 예를 들어, 번들된 axons의 편향 같은 문자열5,6 이동 또는 micropatterned에 성장 축 삭 기지개 채널 고 stretchable 막7,8. 또한, 비록 axonal varicosities 또한에서 유도 될 수 있다 액체 피 시스템 이러한 설정 과정에서에서 같은이 분석 실험 (몇 시간6,,7810 분)에서 훨씬 더 많은 시간이 나타나고 돌이킬 수 없는. 마지막으로, 우리의 시스템 로컬 유체 피를 사용 하 여 수 varicosity 형성의 공간 기능 시험 (예., 모 수석, 모 수석 등뼈, 소마, axonal 초기 세그먼트, axonal 터미널), 그것의 일시적인 기능 외. 이 시스템을 사용 하 여, 우리는 여러 예상치 못한 독특한 기능과를 axonal varicosity 형성, 특히 급속 한 발병, 느린 가역 및 축 삭 모 수석 극성을 발견 했다.
우리가이 문서에서 설명 하는 시스템은 분자의 많은 기술과 호환 되 고 세포 생물학. 예를 들어, 신경 형태와 기능에 기계적 스트레스의 효과 연구, 그것은 함께 사용할 수 있습니다 myelin coculture, 형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 및 총 내부 반사 형광 (TIRF), 이미징 시간 경과 칼슘 이미징, 그리고 패치 클램프 기록입니다. 이 문서에서 우리는 시스템의 핵심 구성 요소에 초점. Hippocampal 신경 문화, 액체 피 설정, axonal 전송에 대 한 고해상도 시간 경과 영상 및 칼슘 이미징 아래 단계별 설명 됩니다.

<table><tbody><tr><td>12mm 커버슬립&nbsp;</td><td>워너 인스트루먼트&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>24웰 플레이트&nbsp;</td></tr><tr><td>25mm 커버슬립&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>12-545-102&nbsp;</td><td>6웰 플레이트용&nbsp;</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>쥐꼬리 콜라겐&nbsp;</td><td>로슈&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&nbsp;</td><td>국가진단&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>헤페스&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 효소&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>기코&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100x (P/S)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM Earle's Salts&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>뉴로베이스&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>아라비노실시토신(Ara-C)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 미디어&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>인비트로겐&nbsp;</td><td>1854313</td><td>트랜스펙션 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>붕규산 막대&nbsp;</td><td>월드 프리시젼 인스트루먼트 Inc.&nbsp;</td><td>퍼핑 피펫용</td> <td>PG52151-4</td>&nbsp;</tr><tr><td>고무 튜브&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10cc 플라스틱 주사기 및 플런저</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터&nbsp;</td><td>셔터 인스트루먼트&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나클&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 (35mm x 10mm)</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>분자 프로브</td><td>F14201</td><td>칼슘 이미징&nbsp;</td></tr><tr><td>Mito-YFP 구조&nbsp;</td><td>주식회사 타카라 바이오&nbsp;</td><td></td><td>세포 transfection&nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1 구성&nbsp;</td><td>주식회사 타카라 바이오&nbsp;</td><td></td><td>세포 transfection&nbsp;</td></tr><tr><td>모델 P-1000 Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러&nbsp;</td><td>셔터 인스트루먼트&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이클립스 TE2000-U Mcroscope&nbsp;</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플랜 플루어 ELWD 20x 렌즈&nbsp; &nbsp;</td><td>니콘</td><td>062933</td><td>목표&nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 오일 렌즈&nbsp;</td><td>니콘</td><td>MRD01991</td><td>목표&nbsp;</td></tr></tbody></table>

공부 varicosity 형성 및 중앙 신경 축 삭에서 복구 하기 위한 microbiomechanical 시스템

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Axonal varicosities는이 성분의 높은 학위를 가진 축 삭의 샤프트 따라 확대 구조. 그들은 신경 퇴행 성 질병 또는 부상, 두뇌에 뿐만 아니라 정상적인 두뇌에서 존재 한다입니다. 여기, 빠르게, 안정적으로, 그리고 역 유도 axonal varicosities 새로 설립 micromechanical 시스템 varicosity 형성 및 이종 단백질 구성에 적용 하는 메커니즘을 이해 하 고 우리 수 있도록 설명 합니다. 이 시스템은 스트레칭의 효과에 주로 집중 하는 다른 체 외에 시스템에서 다른 뉴런의 다른 subcellular 구획에 압축 및 전단 스트레스의 효과 평가 하는 새로운 수단을 나타냅니다. 중요 한 것은, 우리의 시스템의 고유한 기능 때문에 우리는 최근 그 가압 유체 응용 프로그램 수 있습니다 신속 하 고 역 유도 axonal varicosities 일시적인 수용 체 잠재력 채널의 활성화를 통해 보여주는 새로운 발견을 했다. 우리의 biomechanical 시스템 마약 관류, 라이브 세포 이미징, 칼슘 이미징 및 패치 클램프 기록 함께 편리 하 게 이용하실 수 있습니다. 따라서,이 방법은 공부 mechanosensitive 이온 채널, axonal 수송, axonal 골격 역학, 칼슘 신호, 규정과 형태학 변화와 관련 된 외상 성 뇌 손상에 대 한 채택 될 수 있다.

피, 이전 축 삭은 일반적으로 작은 varicosity 형성 표시. 다음 우리의 표준 압력 (mmH2O 높이 190), 많은 구슬 모양의 varicosities 개발 축 삭 시작으로 피. 그들의 사전 부풀어 상태로 10 분 회복 기간 (그림 2A-B)를 반환 하는 축 삭의 지역 같이 varicosities의 대형은 부분적으로 가역. 회복의 긴 기간 후 (&gt; 20 분), 일부 축 삭 완전히 복구. 피 피 펫으로 무대 위에 190 m m에서 주사기의 정확한 포지셔닝의 차선 위치 수 있습니다 생성 하지 varicosities 빠르게. 최적의 조건 약 5 s4에 (약 7 DIV) 젊은 신경의 축 삭에 varicosity 형성 될 해야 합니다.
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이 프로토콜 varicosities 뉴런에서의 빠르고 가역 유도 순수 관련, 압력 액체 접근 방식을 설명합니다.

공부 Varicosity 형성 및 중앙 신경 축 삭에서 복구 하기 위한 Microbiomechanical 시스템

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

이 가압 유체 설정의 전반적인 목표는 배양된 뉴런의 축삭을 따라 반복 가능하고 일관된 팽창을 생성하는 것입니다. 이 방법은 손상 후 뉴런의 세포 내 형태학적 변화의 메커니즘과 같은 뇌 손상 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 시간이 지남에 따라 복구되는 일관되고 반복 가능한 형태학적 변화를 생성한다는 것입니다.이것은 우리가 실험실에서 개발한 매우 중요한 기술입니다. 이는 기계-스트레스에 의한 축삭돌기 형태 변화를 관장하는 분자 메커니즘을 새로운 형태의 신경 가소성으로 규명하기 위해 이 시스템을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 경증 또는 외상성 뇌 손상에 대한 신약 및 치료 전략을 식별하기 위한 스크리닝 도구로 시스템을 사용할 수 있기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 12mm 또는 25mm 커버슬립 상자를 하나 이상 70%질산이 함유된 유리 비커에 넣고 실온에서 밤새 커버슬립을 배양합니다.다음 날, 모든 커버슬립을 2.5리터의 이중 증류수로 채워진 4리터 비커에 옮깁니다. 커버슬립이 들어 있는 비커를 100RPM으로 1시간 동안 흔들고, 흔드는 동안 고무줄을 사용하여 비커를 잡는 것을 잊지 마십시오. 그런 다음 청소한 커버 슬립을 금속 덮개가 있는 마른 플라스크로 옮깁니다.커버슬립을 섭씨 225도의 오븐에서 6시간 동안 굽습니다. 그런 다음 실온으로 식히고 사용할 때까지 멸균된 플라스틱 용기에 보관하십시오. 이제 24웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버슬립을 놓습니다.30mm 커버슬립에 12마이크로리터의 커버슬립 코팅 용액을 넣고 소용돌이칩니다. 그런 다음 각 웰에 1ml의 멸균 PBS를 추가합니다. 플레이트는 즉시 사용하거나 최대 1주일 동안 멸균 PBS에서 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.박리 당일에는 플레이트에서 PBS를 제거합니다. 자연 건조하고 플레이트를 자외선 아래에 2-4시간 동안 두십시오. 배양을 위해 해마 뉴런을 해리하려면 프로테아제 효소 용액을 해동하고 도금 매체를 섭씨 37도에서 예열합니다.다음으로 절개된 해마를 SLDS로 헹굽니다. 그런 다음 제거하고 프로테아제 효소 용액 2ml를 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 5-10 밀리리터의 도금 배지로 해마 외식물을 두 번 세척하고 5 밀리리터의 도금 배지를 첨가합니다.1 밀리리터 플라스틱 팁이있는 피펫을 사용하여 작은 소용돌이를 생성하여 해마 외식을 단일 세포로 해리합니다. 용액이 흐려지고 큰 외식 조각이 남지 않을 때까지 산소 기포의 형성을 피하면서 약 40 회 위아래로 피펫을 사용하십시오. 다음으로, 1, 125 배 중력에서 3 분 동안 세포를 원심 분리하십시오.세포가 배지에 잠긴 상층액을 제거하고 145ml의 도금 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 웰당 1ml의 세포 현탁액을 24웰 플레이트에 추가합니다. 도금 매체에서 세포를 섭씨 37도에서 2-4시간 동안 배양합니다.그런 다음 도금 매체를 제거하고 새 유지 보수 매체로 교체하십시오. 2일 후, 섬유아세포, 내피 및 신경교세포의 성장을 억제하기 위해 배지의 절반을 유지 배지에 용해된 2개의 마이크로몰 RSC로 교체합니다. 그런 다음 세포를 2일 동안 RSC에 노출시킨 후 배지를 새로운 유지 배지로 교체합니다.세포 형태학의 시각화를 위해 transfection하려면 Opti-MEM 배지 및 와류에서 마이크로리터당 1마이크로그램으로 스톡에서 구조체를 희석합니다. 그런 다음 Opti-MEM 배지 및 와류에서 리포좀 매개 transfection 시약을 희석합니다. 그 후, 각 웰에 대해 하나의 건설 희석액과 하나의 형질 주입 희석액을 준비합니다.다음으로, 구조체와 Opti-MEM 배지 및 트랜스펙션 시약과 Opti-MEM 배지 및 와류의 일대일 혼합물을 준비합니다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후 각 웰에서 배지의 절반을 제거하고 이 배지를 깨끗한 원뿔형 튜브로 옮깁니다.튜브를 인큐베이터에 보관한 다음 이전 단계에서 준비한 혼합물 100마이크로리터를 웰의 나머지 매체에 추가합니다. 세포가 섭씨 37도에서 20-30분 동안 배양하도록 합니다. 배양 중에 원뿔형 튜브의 배지에 한 부피의 신선한 유지 관리 배지를 추가하고 혼합물을 동일한 인큐베이터에 넣습니다.배양 후, 웰에서 transfection 용액이 포함된 배지를 제거하고 원뿔형 튜브에서 오래된 유지 배지와 새로운 유지 관리 배지의 일대일 혼합물로 교체합니다. 이 절차에서는 피펫을 마이크로 매니퓰레이터의 나사 상단에 삽입하여 제자리에 고정합니다. 마이크로 매니퓰레이터 암에 부착된 금속 플랫 탑 나사를 나사로 조여 고무 튜브가 부착된 바로 위에 있는 피펫의 당기지 않은 끝을 잡습니다.피펫을 커버슬립이 포함된 뉴런 표면과 45도 각도로 각도를 맞춥니다. 형광 필터를 켭니다. 조리개를 열고 대물렌즈를 통해 들어오는 형광 반점을 볼 수 있는지 확인합니다.micromanipulator를 사용하여 피펫을 팁과 형광 반점과 일치하는 위치로 이동하고 피펫을 세포 배양 접시 높이 바로 위의 위치로 내립니다. 제자리에 고정되면 투과광을 켜고 형광을 끕니다. 핀셋을 사용하여 세포가 세포 배양 플레이트에서 피펫을 향하도록 커버슬립 하나를 실온에서 2ml의 Hank's buffer가 들어 있는 세포 배양 접시로 옮깁니다.미세 초점 손잡이와 20 폴드 대물렌즈를 사용하여 셀 위로 약 4바퀴 회전하는 평면에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 micromanipulator를 사용하여 피펫 팁이 접안렌즈를 통해 볼 때 초점이 맞춰지고 평면의 중앙 왼쪽에 위치하도록 배치합니다. 피펫이 제자리에 놓이면 관심 영역이 포함된 평면에 현미경의 초점을 맞춥니다.7개의 div를 촬영한 결과, GFP로 transfection된 쥐 해마 뉴런은 퍼핑 전후의 축삭돌기를 보여주었으며, 이후 10분의 회복 기간을 보여주었습니다. 다음은 동일한 뉴런의 타임랩스 이미징의 Kymograph입니다. 빨간색 화살표는 30초부터 시작하여 190밀리리터 H2O 퍼핑 150초 후에 형성된 정맥류를 나타냅니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 전체 세포 기록, 타임 랩스 FRET 및 TIRF 이미징, 칼슘 이미징과 같은 다른 방법을 수행하여 기계적 스트레스가 신경 및 전기 및 칼슘 신호에 미치는 영향, 단백질 운송 및 상호 작용과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 사진 외상성 뇌 손상 연구자들이 살아있는 뉴런의 축삭 정맥류 형성의 기저에 있는 분자 메커니즘을 설명할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청하고 나면 중심 뉴런의 기계감각을 연구하기 위한 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

a-microbiomechanical-system-for-studying-varicosity-formation

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

라이브 그람 음성 및 그람 양성 세균은 젤라틴 코팅 운모에 고정화 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 액체에 몇 군데 있습니다.

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

이 비디오는 미세유체 챔버 시스템을 사용하여 운동 뉴런의 축삭 수송을 추적하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 축삭 성장을 유도하기 위해 영양 배지가 있는 폴리머로 코팅된 웰에서 마우스 배아 척수 조직을 배양하는 것이 포함됩니다. 라이브 이미징에서 형광 염료 염색 소기관의 움직임은 양방향 축삭 수송을 확인합니다.

Tracking Axonal Transport of Organelles in Motor Neurons Using a Microfluidic Device

이 비디오는 뉴런에 미세역학적 자극을 가하여 축삭 정맥류의 유도를 보여줍니다. 이 시스템은 튜브를 통해 완충액이 들어 있는 주사기에 부착된 마이크로피펫으로 구성됩니다. 마이크로매니퓰레이터(micromanipulator)를 사용하여 마이크로피펫을 뉴런 위에 위치시킵니다. 그런 다음 유체 압력이 가해져 축삭의 정맥류를 유도합니다.

Inducing Axonal Varicosities with a Micromechanical Stimulus on Neurons(뉴런에 대한 미세기계적 자극으로 축삭 정맥류 유도)

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

레이저 nanodissection 결합 이광자 이미징은, 세포 내 해상도 중추 신경계 퇴행성 및 재생 공정을 연구하는 유용한 도구이다. 이 프로토콜은, 라벨 이미지 및 생체 내에서 소뇌 피질에서 하나의 등반 섬유를 해부하는 방법을 보여줍니다.

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

우리는 축삭돌기 및 미엘린 손상의 역학을 실시간으로 동시에 시각화하기 위해 이광자 여기 타임 랩스 현미경을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 제안된 프로토콜은 손상 후 중심 수초화된 축삭돌기의 운명에 영향을 미치고 영구적인 임상적 장애에 기여할 수 있는 내적 및 외적 요인에 대한 연구를 가능하게 합니다.

전의 VIVO 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

여기에서 우리는 체외에서 propriospinal 연결 기능 재생을 연구하기 위해 다중 전극 배열에 배양 척수 조각을 기반으로하는 프로토콜을 제시한다.

다중 전극 배열에 성장의 Organotypic 척수 공동 문화 기능 재생 조사

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

축색 수송은 운동 신경 건강을 위한 중요한 기계장치입니다. 이 프로토콜에서 우리는 미세 유체 챔버를 사용하여 운동 뉴런 축축에서 산성 구획및 미토콘드리아의 축산 수송을 추적하기위한 상세한 방법을 제공합니다.

미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송

이 프로토콜은 축삭 손상 후 신경 대사 역학을 모델링하는 미세유체 시스템을 설명하여 내재 대사 리모델링의 이미징, 다중 오믹스 분석 및 기계론적 연구를 가능하게 합니다.

축삭 손상 모델 구성 및 다중 오믹스 분석 가능을 위한 미세유체 칩

배우세요 중추 신경 축삭에서 가소성 형성과 회복 메커니즘을 연구하는 가압 유체 기법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 뇌 손상 치료 및 신경 세포 형태 변화 연구에 활용됩니다.

공부 Varicosity 형성 및 중앙 신경 축 삭에서 복구 하기 위한 Microbiomechanical 시스템

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