Name: 쥐 모델에 부분 Colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 쥐 모델에서 지방 조직 유래 줄기 세포 시트를 이용한 결장 직장 문합부 이식술로 수술 후 누설을 효과적으로 감소시키는 방법. 이 기술은 합성 재료 없이 조직 치유를 촉진하여 대장 직장 수술의 새로운 치료 전략을 제시합니다.

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저자는 교수 박사 S.E.R. Hovius, 박사 M.A.M. Mureau 및 모든 외과 피하 지방이 많은 직물의 컬렉션에 대 한 성형 수술의 부의 감사. P. Sukho 연구의 행위 동안에 네덜란드 친목 프로그램 (NFP-12/435)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 사원 Bastiaansen Jenniskens 네덜란드 관절염 재단 (LP11)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.

복 부 피하 지방 조직 승인 의료 윤리 위원회 (#MEC-2014-092), 에라스무스 엠씨 대학 의료 센터, 로테르 담, 네덜란드의 인간 기증자 로부터 얻은 것입니다. 모든 동물 실험 윤리 위원회의 동물 실험, 에라스무스 엠씨 대학 의료 센터, 로테르 담, 네덜란드 (133-14-01)에 의해 승인 되었다.
1. 인간의 ASCs 격리와 문화
<ol><li>1g의 지방 조직에 대 한 절연 매체의 3 mL를 준비 합니다. 혼합 낮은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (LG-DMEM) 10 g/L 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 콜라 1 g/L 입력 1.</li>
	<li>인간의 피하 복 부 지방 조직 해 부 (n = 8, 모든 여성, 평균 나이 40 ± 9 살) 살 균 생물 SafetyCabinet의 메 마른 외과 블레이드 크기 10, Adson 브라운 조직 집게와 Metzenbaum가 위를 사용 하 여 작은 조각 (0.5 cm).</li>
	<li>메 마른 유리 미디어 저장 병에 해 부 조직을 저장 합니다. 해 부 조직 총 양의 무게 고 준비 절연 매체 병 당 절연 매체의 150 mL와 함께 지방 조직 (50 g)와 소화를 시작 합니다. 프로토콜 롤러 믹서에 하룻밤 해 부 지방 조직 및 4 ° C에서 절연 매체 병을 저장 하 여 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 그런 다음 다음 단계를 계속 하기 전에 15 분 동안 실내 온도 25 ° C에 다음 날 병 prewarm. 참고: 복 부 피하 지방 조직 기증자 승인 에라스무스 MC 의료 윤리 위원회 (# 멕-200)의 규범에 따라 유 방 재건 수술에서 남은 자료로 얻어 졌다: "적절 한 보조 사용 인간의 조직"의 (< http://www.federa.org>). 남은 지방 조직만 기증자 않았다 하지 탈퇴 보조 사용에서 사용 되었다.</li>
	<li>다이제스트 150 rpm에서 1 h 동안 37 ° C 배양 기 통에에서 멸 균 유리 미디어 저장 병에 해 부 지방 조직.</li>
	<li>50 mL 튜브로 소화 솔루션을 분할 하 고 튜브 390 x g에서 10 분 원심.</li>
	<li>문화 매체를 준비: LG DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B. 보충</li>
	<li>원심 분리, 다음은 상쾌한을 제거 하 고 배양 (LG-DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B 보충) 20 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 390 x g에 5 분 동안 다시 세포를 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>문화 매체 (LG-DMEM 10 %FBS, 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B 보충)의 10 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 세포 현 탁 액 100 µ m 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 50 µ L을 (적혈구 세포)에 대 한 3% 초 산/메 틸 렌 블루 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 솔루션을 섞어 10 µ L를 사용 하 여 셀을 계산. 세포는 hemocytometer와 계산을 수행 합니다. 다음 문화 매체 (LG-DMEM 30 %FBS, 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B 보완)에 40, 000 셀/c m2 의 조밀도에 세포 격판덮개.</li>
	<li>24 시간 5% CO2 와 다습 한 대기권에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>갓 부 화, 워시와 따뜻한 (37 ℃) 성 세포와 식 염 수 (PBS) 세포 파편을 제거 하 고 10 %FBS 문화 매체와 미디어를 대체 버퍼링을 다음 추가 ascorbic 산-2-인산 염 (25 µ g/mL)와 인간의 재조합 섬유 아 세포 성장 요인 2 (FGF2, 1 ng/mL).</li>
	<li>Subculture ASCs 표준 0.25% trypsin EDTA 솔루션 (3 mL T175 플라스 크에 대 한)를 사용 하 여 90% 합류에. 3-5 분 후 중화 문화 매체 (LG-DMEM 10 %FBS, 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B 보충)의 10 mL와 0.25% trypsin EDTA 솔루션. 참고: 일반적인 ASC 표면 마커 및 트라이-혈통 차별화 분석 수행 이전 그리고 발표 ASCs이 프로토콜 표시 ASC 특정 특성21,22를 사용 하 여 격리를 사용 하 여 cytometry 분석 흐름.</li>
	<li>T175 플라스 크에 대 한 문화 매체 (LG DMEM 보충 10 %FBS, 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B)의 10 mL로 세포 세척 하 고 원심 250 x g. 제거에서 8 분에 대 한 셀은 상쾌한 문화 매체의 1 mL에 셀 resuspend. hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>8, 000 셀/c m2의 조밀도에 T175 문화 플라스 크에 세포 격판덮개</li>
	<li>더 사용 하기 전에 문화 매체에서 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 액체 질소에 나머지 ASCs를 고정.</li>
</ol>2. ASC 시트 준비
<ol><li>FBS의 1 mL와 함께 온도 응답 문화 요리 (3.5 c m 직경)를 미리 coat 다음 셀 뿌리기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 요리를 놓습니다.</li>
	<li>3-5 분 (3 mL T175 문화 플라스 크에 대 한) 표준 0.25% trypsin EDTA 용액을 사용 하 여 ASCs trypsinize Trypsinization 후 어떤 셀 수 풀 경우 계산 전에 100 µ m 필터를 통해 셀을 필터링 합니다.</li>
	<li>트립 신 솔루션을 무력화 LG DMEM 10% 보충 FBS (T175 플라스 크에 10 mL) 250 x g. 8 분 대 세포 현 탁 액 분리기는 상쾌한 제거와 LG DMEM 10% 보충의 1 mL에 셀 resuspend FBS.</li>
	<li>FBS와 온도 응답 문화 요리 코팅, 후 37 ° C에서 지구 온난화 접시에 인큐베이터에서 요리를 이동 하 고 접시에서 FBS를 제거 합니다.</li>
	<li>씨앗 ASCs 400000 셀/cm2 (총, 3.52 × 106 세포 배양 접시 당 2 mL에 희석).</li>
	<li>신중 하 게 가능한 균등 하 게 요리를 부드럽게 스윙 하 여 세포를 배포 합니다.</li>
	<li>5% CO2와 다습 한 대기권에서 37 ° C에서 48 h에 대 한 문화 ASC 시트. 참고: 문을 여는 인큐베이터의 온도 강하를 ASC 시트 형성을 방해할 수 있습니다 또는 구성 된 ASC 시트의 조기 분리를 방지 하기 위해 ASCs 시드 후 최소화 하십시오.</li>
</ol>3. 부분 Colectomy 및 대 장 문 합
<ol><li>유발 하 고 남성 Wistar 쥐 (250-350 g 사이 무게) 1 L/min isoflurane의 유지 (1.5-5%)/oxygen 흡입 buprenorphine 0.05 mg/kg을 피하 주사 하 고.</li>
	<li>일단 동물 일반 마 취, 마 취 깊이 반사 테스트를 사용 하 여 평가 합니다. 건조를 방지 하기 위해 눈에 비타민 A 포함 눈 연 고를 적용 합니다. 마 취는 수술에 대 한 충분 한 것으로 간주, aseptically 머리를 면도 하 고 외과 영역 70% 에탄올으로 두 번 살포 하 여 복 부를 준비 합니다. 살 균 종이 커튼으로 복 부 드러 워 진. 무 균 기술을 사용 하 고 전체 수술 중 살 균 분야를 유지 합니다.</li>
	<li>메 마른 외과 블레이드 크기 10으로 5 cm의 중간 선 복 부 절 개를 만들고 Metzenbaum가 위 절 개를 확장. 확인 하 고 콜론 exteriorize 염 분 moistened gauzes와 복 부 구멍의 나머지에서 결 팩. 오른쪽, 중간, 식별 하 고 퉁 명 스럽게 Halsted 모기를 사용 하 여 각 선박 주위 해 부는 mesentery에서 산 통 동맥을 왼쪽, 고 흡수 비 꼰 실크 4/0 각 개별 선박 선.</li>
	<li>맹 하 aborally 1.0 cm 사이 꼬리 mesenteric 동맥 위에 0.5 cm 저 승 세그먼트를 격리 합니다. 건강 한 콜론 Metzenbaum가 위를 사용 하 여 통해 transect. 저 승 세그먼트의 절제술, 후 두 긴 면봉, 원심 결 통해 트랜스 anally 그리고 근 위 결 장 끝에 도입 하 여 콜론의 인접 하 고 원심 끝을 함께 가져.</li>
	<li>수술 현미경을 사용 하 여, 한 레이어 반전 5 중단된 봉합 (비 흡수 monofilament 폴 리아 미드 8/0)를 사용 하 여 봉합에 의해 부족 하 게 sutured 엔드-투-엔드 문 합을 만듭니다. 결 장 벽의 모든 레이어를 통해 중단된 봉합 놓고 노트 extraluminally 위치.</li>
	<li>컨트롤 또는 ASC 시트 그룹으로 무작위로 쥐를 나눕니다.</li>
</ol>4. ASC 시트 이식
<ol><li>40 분 비보에 이식, ASC 시트 분리를 촉진 하기 전에 실내 온도에 아래로 냉각 하기 위하여 문화 요리를 하실 수 있습니다. 참고:는 초연 후 약 2 cm 직경에서 축소 ASC 시트. ASC 시트 생존 분리20후 최소한 3-6 h에 대 한 높은 남아 있습니다.</li>
	<li>문화 매체와 혈 청 1 mL와 함께 그것은 lg 전자 DMEM 무료 교체를 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 atraumatic 집게와 ASC 시트의 테두리를 잡아 고 anastomotic 라인 위에 ASC 시트의 요리 측을 두십시오.</li>
	<li>신중 하 게 ASC에 밖으로 스트레칭 약 0.25 cm 위와 아래 anastomotic 라인 atraumatic 집게 랩 콜론 주위 시트를 사용 하 여 시트. 랩 등 측면 주위 ASC 시트까지 콜론을 들어올립니다. 참고: ASC 시트는 anastomotic 라인을 자발적으로 준수, 조직 접착제를 사용 하는 필요 또는 다른 소재. 제어 그룹 추가 치료에 영향을 받지 않습니다.</li>
	<li>목화 면봉을 제거 하 고 장갑과 악기를 변경. 복 부에 콜론을 바꿉니다. 흡수 되기 쉬운 봉합을 사용 하 여 실행 한 레이어와 닫기 복 부-교육 알바 꼰 polyglycolic 산 5/0. 봉합은 subcutis와 함께 흡수 봉합을 사용 하 여 실행의 한 계층에서 커티스 꼰 polyglycolic 산 5/0.</li>
</ol>5. 수술 후 평가 및 후속
<ol><li>즉시 5 mL 따뜻한 식 염 수의 피하 주사로 동물 postoperatively rehydrate. 체온을 유지 하 고 동물을 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 생체 신호를 모니터링 하는 열 램프 아래에서 동물을 놓습니다. 참고: 수술을 받은 했다 동물 했다 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사에 반환 되지 않습니다. 복구, 후 물에 자유 접근 및 일반 쥐 차 수 있도록. 수술 후 통증 완화를 위해 관리 0.05 mg/kg buprenorphine 피하 모든 6-8 h 3 일 동안. 이 연구에서 언제 든 지 아무 항생제 관리 되었다.</li>
	<li>웰빙 무게의 일일 임상 평가 얻을. 매우 낮은 웰빙 점수 또는 심한 체중 감소, 동물 마 취 아래 심장 찔린 통해 exsanguination에 의해 안락사 해야 한다.</li>
	<li>수술 후 당일 또는 하루 3 7 anesthetize 1 L/min isoflurane의와 다시 쥐 (1.5-5%)/oxygen 흡입 buprenorphine, 없이 U 자 모양의 절 개를 다시 개복 술을 수행 하 고. 복 부 복 막 염만, 섬유 유착, 그리고 농의 존재의 표시를 확인 하십시오. 유착의 심각도 점수와 복 부와 anastomotic 지역에서 농 양.</li>
	<li>문 합을 포함 하 여 콜론의 닫힌된 세그먼트에 공기 insufflation에 의해 anastomotic 파열 압력을 결정 합니다. 첫 번째 공기 파열 압력으로 누설 하는 때 공기 압력과 파열의 장소를 기록 합니다.</li>
	<li>각 희생된 동물에서 콜론을 제거 하 고-장 문 합을 포함 하는-콜론의 컷된 세그먼트 버퍼링 4% 포름알데히드, 파라핀 포함 및 콜론 4 μ m 두꺼운 부분으로 절단에 의해 해결.</li>
	<li>심장 찔린 통해 exsanguination에 의해 직접 문 합 세그먼트의 컬렉션 후 마 취 동안 동물을 안락사. 호흡 운동과 심장 박동의 부재와 함께 동물 죽음을 확인 합니다.</li>
	<li>되며 & 오신 빨강, Picro 시리우스 등 조직화 학적인 stainings 및 인간 미토 콘 드리 아, 쥐 내 피 세포 (CD34 안티) 및 (CD3 +, CD163 +) 면역 체계의 세포에 대하여 항 체와 immunohistochemical stainings 수행 합니다.</li>
	<li>컴퓨터 분석에 대 한 슬라이드를 디지털화 하 고 동물 그룹을 비교.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

Anastomotic 누설은 기본 문 합으로 결 장 절제술을 다음과 같은 가장 심각한 불리 한 이벤트 이다. Anastomotic 장애 및 누설을 방지 하기 위해 최적의 기술을 여전히 부족 한. 다양 한 생체 재료의 로컬 응용 프로그램, 다양 한 결과25,,2627실시 되어 있다. 세포 치료의 목표는 조직 대체 하 여 조직 복구 또는 로컬 치유 통해 paracrine 분 비의 자극을 촉진 하기 위하여 이다.
이 쥐 모델에서 ASC 시트 이식 기술적으로 성공적 이었다. 임상 및 조직학 기본 문 합으로 결 장 절제술 후 누설을 감소에서 ASC 시트의 효과 설명 했다.
대 장 anastomoses에 ASC 시트 이식 대 장 수술에 새로운 접근 이다. 처음으로,이 연구에서...

기본 문 합으로 부분 colectomy는 대 장 암, 크 론 병, 계실 염1,2등 콜론에 영향을 미치는 많은 질병에 대 한 할 수 있는 일반적으로 수행된 수술입니다. 가장 후 대 장 문 합은 anastomotic 누설3합병증을 겁 나. 비록 anastomotic 누수와 관련 된 몇 가지 위험 요소 확인 되었습니다, 누설을 방지 하기 위한 솔루션 알4,5남아 있습니다.
지방 조직 유래 stromal 세포 (ASCs) 염증 및 영양 특성6,7, 이러한 세포 재생 요법8에 대 한 후보를 유망 하 게 연결 되어 있습니다. 조직 치유를 촉진 하는 ASCs의 효과 심장 근육, 피부, 식도9,,1011,,1213등 다양 한 조직에 표시 했다. 그러나, 장 치유를 촉진 하는 ASCs 사용 하 여에 몇 가지 보고 있다. ASC 코팅 biosutures 통해 실험 대 장 anastomoses에 ASCs의 지방 이식 또는 ASCs serosal 주사14 치유 하거나 개선 보였다 anastomotic 더 유리한도 불구 하 고 anastomotic 누설을 방지 하지 않았다 치유15.
정지에서 ASCs의 지방 이식 함께 또는 생체 부족 세포 보존 또는 이식된 세포11의 부적 절 한 배포에 연관 될 수도 있습니다. 셀 시트 기술16,17 ASC 배달18,19의 혁신적인 방법을 제공합니다. 따라서, 이전 연구에 새로운 접근 방식은 어느 ASCs 셀에 시트 실험 대 장 문 합20에 적용 수 있는 제안 했다. 이 연구는 ASC 시트 이식 쥐 모델에서 부분 colectomy 후 대 장 문 합 누출을 감소 시키기에서 성공적 증명. 이 기사 보고 ASC 시트 준비 및 외과 이식 기술 합니다.

<table><tbody><tr><td>LG DMEM</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>22320022</td><td>ASC 분리 및 배양</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 I형</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>17100-01</td><td>ASC 절연</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9418</td><td>ASC 절연</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS, ASC 분리 및 배양</td></tr><tr><td>3% 아세트산 메틸렌 블루를 사용한 산</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>ASC 절연</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>15750-037</td><td>ASC 분리 및 배양</td></tr><tr><td>Ampothericin B</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>15290-018</td><td>ASC 분리 및 배양</td></tr><tr><td>Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker 모델 10X 400)</td><td>Akribis Scientific</td><td>F240</td><td>ASC 절연</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Hettichlab</td><td>Rotina380</td><td>ASC 분리 및 배양</td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>14190-094</td><td>PBS, ASC 분리 및 배양</td></tr><tr><td>아스코르브산-2-인산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>ASC 분리 및 배양</td></tr><tr><td>인간 재조합 섬유아세포 성장 인자 2</td><td>AbD Serotec</td><td>AF-100-15</td><td>FGF2, ASC 분리 및 배양</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>25200-056</td><td>ASC 배양</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5x</td><td>DMSO, ASC 동결</td></tr><tr><td>열 반응성 배양 접시</td><td>Nunc Thermo scientific</td><td>174904</td><td>ASC 시트 준비</td></tr><tr><td>Non-absorbable braided silk 4/0</td><td>B Braun</td><td>21151042</td><td>surgery</td></tr><tr><td>Non-absorbable monofilament 폴리 아미드 8/0</td><td>B 브라운</td><td>G1118170</td><td>수술</td></tr><tr><td>흡수성 꼰 폴리 글리콜 산 5/0</td><td>B 브라운</td><td>C1048207</td><td>수술</td></tr></tbody></table>

쥐 모델에 부분 colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Anastomotic 누설 대 장 수술 후 비참 한 합병증은 이다. 누출 방지에 대 한 현재 메서드는 임상 효능의 다른 수준, 그들은 지금 불완전 한 솔루션까지 있습니다. 줄기 세포 치료 ASC 시트를 사용 하 여이 문제에 대 한 솔루션을 제공할 수 있습니다. ASCs 조직 그들의 영양 및 immunomodulatory 속성 때문에 치유를 승진 시키기를 위한 유망 후보자 이라고 여겨진다. 여기, 우리는 누설을 줄이기 위해 쥐 모델에서 대 장 문 합에 이식 하는 고밀도 ASC 시트를 생산 하는 방법을 제공 합니다. ASCs 셀 시트 쉽게 분리 될 수 있는 온도 응답 문화 요리에 형성. 이식의 날, 5 봉합 대 장 문 합으로 부분 colectomy 수행 되었다. 동물 쥐 당 1 ASC 시트와 함께 즉시 이식 했다. ASC 시트 없이 어떤 접착제, 봉합 사, 또는 어떤 소재 문 합을 자발적으로 준수 됩니다. 동물 그룹 3 ~ 7 일을 희생 했다 postoperatively. 이식된 동물에 비해, anastomotic 농 양 및 누설의 부각 더 높았다 제어 동물. 우리의 모델에서 대 장 문 합 후 ASC 시트 이식 성공적이 고 낮은 누설 율으로 연결 했다.

ASC 시트 문화 및 결 장 절제술 및 문 합 절차를 묘사 하는이 연구의 흐름 차트는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 2 는 ASC 시트 현미경 형태학 및 중 고 분리 후 ASC 시트의 거시적인 외관. 그림 3 ASC 시트 분리 및 이식의 다른 단계를 보여 줍니다. 그림 4 는 anastomotic 선 및 누설 방지에 ASC 시트의 존재 3 일 postoperatively.
후속 기간 대 장 문 합 평가 대 한 허용입니다. 다른 평가 수치와 테이블에 표시 됩니다. 제어 동물에 비해, 이식된 동물 그룹 덜 자주 anastomotic dehiscence과 수...

준비와 쥐 모델에서 부족 하 게 봉합 대 장 anastomoses에 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC) 시트의 이식 제공 됩니다. 이 새로운 응용 프로그램은 ASC 시트 대 장 문 합 누출을 줄일 수 있습니다 보여줍니다.

쥐 모델에 부분 Colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

조직 치유에 긍정적 인 효과를 가정하기 때문에 ASC 시트는 심근 경색과 같은 많은 질병 모델에서 테스트되었습니다. 이 실험은 ASC 시트가 복강 내에서 사용될 수 있으며 장에 적용될 수 있음을 보여줍니다. ASC 시트의 주요 장점은 합성 재료가 필요하지 않다는 것입니다.또한 ASC 시트 이식은 적은 양의 연습만으로 비교적 쉽게 수행할 수 있습니다. ASC 시트 이식의 이 새로운 응용 프로그램은 장 절제 후 누출을 방지하기 위해 개발되었으며 새로운 치료 전략의 첫 번째 단계를 제공합니다. 장 문합에 적용되는 ASC 시트는 누출 방지에 유망한 것으로 나타났습니다.ASC 시트는 요로와 같은 다른 복강 내 장기에도 적용될 수 있습니다. 먼저 10 사이즈의 멸균 수술용 칼날, Adson-Brown 조직 겸자 및 Metzenbaum 가위를 사용하여 인간의 피하 복부 지방 조직을 0.5cm 조각으로 해부합니다. 멸균된 유리병에 담긴 절개된 조직의 총량을 계량합니다.병당 30ml의 분리 배지를 추가합니다. 그리고 절개된 지방 조직을 쉐이커 인큐베이터에서 150rpm 및 섭씨 37도의 온도에서 1시간 동안 소화합니다. 한 시간 후에 소화된 조직 해결책을 50 ml 관으로 나누고, 390 G.Following 원심분리에 의하여 제거한다 상등액에 10 분 동안 관을 분리기를 분리하십시오.배지를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁시키고 최대 45ml의 배양 배지를 더 추가합니다. 결합된 세포를 390G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 10ml의 배양 배지로 재현탁시킵니다.그리고 100 미크론 필터를 통해 셀 현탁액을 필터링합니다. 3% 산산 메틸렌 블루 용액 50l를 세포 현탁액 50l에 첨가하여 적혈구를 이가 만듭니다. 용액을 혼합한 후 혈구계에 10l를 피펫팅하고 세포를 계수합니다.배양 배지가 포함된 T175 플라스크에 제곱 cm당 40000 세포의 밀도로 세포를 플레이트화합니다. 그리고 섭씨 37도의 습한 분위기에서 24시간 동안 5%CO2로 세포를 배양합니다. 다음날, 따뜻한 인산염 완충 식염수로 세포를 세척하여 세포 파편을 제거합니다.그런 다음 배지를 10% FBS 배양 배지와 새로 첨가된 아스코르브산-2-인산염 및 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자 2로 교체합니다. 세포가 90% confluence에 도달할 때까지 배양합니다. 표준 0.25% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 90% 합류점에서 지방 줄기 세포를 계대배양합니다.3-5분 후 0.25%Trypsin-EDTA 용액을 10ml의 배양 배지로 중화합니다. 분리기 관에 옮기고, 250 G.Remove에 8 분 동안 세포를 분리기를 분리하고, 배양 배지의 1개 ml에 있는 세포를 refuse. 혈구계로 세포를 계수한 후 T175 배양 플라스크에 제곱센티미터당 8000개의 세포 밀도로 세포를 플레이트화합니다.더 사용하기 전에 배양 배지에 10%dimethyl sulfoxide와 함께 나머지 ASC를 액체 질소에 동결합니다. 직경 3.5cm의 열 반응성 배양 접시에 소 태아 혈청 1ml를 프리코팅합니다. 그런 다음 파종하기 전에 최소 30분 동안 섭씨 37도의 인큐베이터에 접시를 넣습니다.열에 반응하는 접시에 대한 ASC 접착을 돕고 배양에서 ASC 시트가 조기에 박리되는 위험을 줄이기 위해 열 반응성 접시는 세포 파종 전에 소 태아 혈청으로 사전 코팅되어야 합니다. 이전과 같이 Trypsinize ASC를 사용하고, Trypsinization 후 세포 덩어리가 있으면 계수하기 전에 100미크론 필터를 통해 세포를 필터링합니다. 인큐베이터에서 접시를 꺼내 섭씨 37도의 보온 플레이트로 옮깁니다.접시에서 FBS를 꺼냅니다. 세포 펠렛을 LG DMEM에 10%FBS로 재현탁시키고 세포를 계수한 후 접시당 배양액 2ml에 6번째 ASCs에 3.52배를 희석하여 각 3.5cm 접시에 평방 cm당 400000개의 세포를 파종합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 세포를 가능한 한 고르게 조심스럽게 분배합니다.그런 다음 5%CO2의 습한 분위기에서 섭씨 37도에서 48시간 동안 ASC 시트를 배양합니다. 이식 당일에는 생체 내 이식 40분 전에 배양 접시를 실온으로 식혀 ASC 시트 박리를 용이하게 합니다. 냉각되면 배양 배지를 제거하고 무혈청 LG DMEM 1ml로 교체합니다.이식하려면 세포 시트를 외상성 겸자로 ASC 시트의 가장자리를 부드럽게 잡고 ASC 시트의 접시 면을 문합 라인 위에 놓습니다. 부드러운 시트 취급과 올바른 시트 배치는 성공적인 온전한 시트 이식을 보장하는 데 필수적입니다. ASC 시트를 문합선 위아래로 약 0.25cm 조심스럽게 늘립니다.결장 주위를 시트로 감싸고 결장을 들어 올려 ASC 시트를 등쪽으로 감쌉니다. 이식된 ASC 시트를 받지 않은 대조 동물은 수술 후 3일째에 흰색 화살표로 표시된 문합선 근처에서 대변 누출을 보입니다. 검은색 화살표로 표시된 ASC 시트를 이식한 동물은 수술 후 3일째에 배설물 누출 및 농양 형성이 감소한 것으로 나타났습니다.수술 7일 후에도 동일한 결과가 관찰되었습니다. 이 이미지는 H와 E로 염색된 이식된 동물에서 결장 문합 부위의 대표적인 단면을 보여줍니다. 시트 구조는 수술 후 최대 7일까지 문합 부위에서 확인할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 몇 분 안에 완료할 수 있습니다.ASC 시트는 결장의 제로 세포 표면에 자발적으로 부착되며 ASC 시트에 맞도록 접착제나 봉합사를 사용할 필요가 없습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 부분 결장 절제술 후 누출을 방지하기 위해 쥐의 결장 문합에 ASC 시트를 준비하고 이식하는 방법을 잘 이해해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

지방 유래 줄기 세포 (ASCs) 쉽게 격리 하 고 정상 쥐의 지방에서 수확. ASC 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 주 커 전체 두께 전시 하는 당뇨 지방 쥐 결함 노출 된 뼈와 피부와 다음 인공 피부의 bilayer 덮여에 이식 될 수 있다.

생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

이 연구는 내시경 지방 조직 유래 기질 세포 (ADSC)의 성공적인 방법을보고하는 돼지 모델의 확장 내시경 점막하 절제술 (ESD) 후 식도 협착 방지를위한 - 시트 이식.

ADSC 매 이식은 확장 식도 내시경 점막하 절개 후 협착을 방지하는

여기, 우리는 vivo에서 암 모델 셀 시트 기술을 사용 하 여 개발 하는 프로토콜을 제시. 이러한 모델은 항 암 치료제의 평가 위한 매우 유용할 수 있었다.

Vivo에서 간세포 암 종 개발에 중간 엽 줄기 세포의 잠재력을 탐험

본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

이 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 복강 내 이식 된 섬의 검출에 적합합니다. 특히, 생체 결합제의 사용 또는 봉합이 필요하지 않습니다.

부고환 백색 지방 조직을 이용한 지방으로 덮인 췌도 이식

이 프로토콜은 낭염의 쥐 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 회장낭 모델은 미세수술 기법을 사용하여 회장낭-항문 문합(IPAA) 수술을 수행하여 만들어졌습니다. 수술 후, 쥐는 4 일 동안 4 % 덱스트란 설페이트 나트륨 (DSS)으로 치료되었습니다.

덱스트란 설페이트 나트륨을 사용한 직장결장절제술 및 회장낭-항문 문합술 후 낭염의 쥐 모델

여기에서 우리는 당뇨병 및 비만 BTBR 마우스의 신장 기능을 개선하면서 난임, 비만 및 고혈당증을 역전시키는 유망한 전략을 제공하는 흰색 및 갈색 지방 조직 이식 프로토콜을 제시합니다.

백색 및 갈색 지방 이식편: 흑색 및 황갈색 완장(BTBR) 비만 마우스의 생식, 대사 및 신장 결핍을 교정하기 위한 접근 방식

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

학습하세요 쥐 모델에서 지방 조직 유래 줄기 세포 시트를 이용한 결장 직장 문합부 이식술로 수술 후 누설을 효과적으로 감소시키는 방법. 이 기술은 합성 재료 없이 조직 치유를 촉진하여 대장 직장 수술의 새로운 치료 전략을 제시합니다.

쥐 모델에 부분 Colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식

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