쥐 모델에 부분 Colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식

조직 치유에 긍정적 인 효과를 가정하기 때문에 ASC 시트는 심근 경색과 같은 많은 질병 모델에서 테스트되었습니다. 이 실험은 ASC 시트가 복강 내에서 사용될 수 있으며 장에 적용될 수 있음을 보여줍니다. ASC 시트의 주요 장점은 합성 재료가 필요하지 않다는 것입니다.

또한 ASC 시트 이식은 적은 양의 연습만으로 비교적 쉽게 수행할 수 있습니다. ASC 시트 이식의 이 새로운 응용 프로그램은 장 절제 후 누출을 방지하기 위해 개발되었으며 새로운 치료 전략의 첫 번째 단계를 제공합니다. 장 문합에 적용되는 ASC 시트는 누출 방지에 유망한 것으로 나타났습니다.

ASC 시트는 요로와 같은 다른 복강 내 장기에도 적용될 수 있습니다. 먼저 10 사이즈의 멸균 수술용 칼날, Adson-Brown 조직 겸자 및 Metzenbaum 가위를 사용하여 인간의 피하 복부 지방 조직을 0.5cm 조각으로 해부합니다. 멸균된 유리병에 담긴 절개된 조직의 총량을 계량합니다.

병당 30ml의 분리 배지를 추가합니다. 그리고 절개된 지방 조직을 쉐이커 인큐베이터에서 150rpm 및 섭씨 37도의 온도에서 1시간 동안 소화합니다. 한 시간 후에 소화된 조직 해결책을 50 ml 관으로 나누고, 390 G.Following 원심분리에 의하여 제거한다 상등액에 10 분 동안 관을 분리기를 분리하십시오.

배지를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁시키고 최대 45ml의 배양 배지를 더 추가합니다. 결합된 세포를 390G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 10ml의 배양 배지로 재현탁시킵니다.

그리고 100 미크론 필터를 통해 셀 현탁액을 필터링합니다. 3% 산산 메틸렌 블루 용액 50l를 세포 현탁액 50l에 첨가하여 적혈구를 이가 만듭니다. 용액을 혼합한 후 혈구계에 10l를 피펫팅하고 세포를 계수합니다.

배양 배지가 포함된 T175 플라스크에 제곱 cm당 40000 세포의 밀도로 세포를 플레이트화합니다. 그리고 섭씨 37도의 습한 분위기에서 24시간 동안 5%CO2로 세포를 배양합니다. 다음날, 따뜻한 인산염 완충 식염수로 세포를 세척하여 세포 파편을 제거합니다.

그런 다음 배지를 10% FBS 배양 배지와 새로 첨가된 아스코르브산-2-인산염 및 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자 2로 교체합니다. 세포가 90% confluence에 도달할 때까지 배양합니다. 표준 0.25% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 90% 합류점에서 지방 줄기 세포를 계대배양합니다.

3-5분 후 0.25%Trypsin-EDTA 용액을 10ml의 배양 배지로 중화합니다. 분리기 관에 옮기고, 250 G.Remove에 8 분 동안 세포를 분리기를 분리하고, 배양 배지의 1개 ml에 있는 세포를 refuse. 혈구계로 세포를 계수한 후 T175 배양 플라스크에 제곱센티미터당 8000개의 세포 밀도로 세포를 플레이트

더 사용하기 전에 배양 배지에 10%dimethyl sulfoxide와 함께 나머지 ASC를 액체 질소에 동결합니다. 직경 3.5cm의 열 반응성 배양 접시에 소 태아 혈청 1ml를 프리코팅합니다. 그런 다음 파종하기 전에 최소 30분 동안 섭씨 37도의 인큐베이터에 접시를 넣습니다.

열에 반응하는 접시에 대한 ASC 접착을 돕고 배양에서 ASC 시트가 조기에 박리되는 위험을 줄이기 위해 열 반응성 접시는 세포 파종 전에 소 태아 혈청으로 사전 코팅되어야 합니다. 이전과 같이 Trypsinize ASC를 사용하고, Trypsinization 후 세포 덩어리가 있으면 계수하기 전에 100미크론 필터를 통해 세포를 필터링합니다. 인큐베이터에서 접시를 꺼내 섭씨 37도의 보온 플레이트로 옮깁니다.

접시에서 FBS를 꺼냅니다. 세포 펠렛을 LG DMEM에 10%FBS로 재현탁시키고 세포를 계수한 후 접시당 배양액 2ml에 6번째 ASCs에 3.52배를 희석하여 각 3.5cm 접시에 평방 cm당 400000개의 세포를 파종합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 세포를 가능한 한 고르게 조심스럽게 분배합니다.

그런 다음 5%CO2의 습한 분위기에서 섭씨 37도에서 48시간 동안 ASC 시트를 배양합니다. 이식 당일에는 생체 내 이식 40분 전에 배양 접시를 실온으로 식혀 ASC 시트 박리를 용이하게 합니다. 냉각되면 배양 배지를 제거하고 무혈청 LG DMEM 1ml로 교체합니다.

이식하려면 세포 시트를 외상성 겸자로 ASC 시트의 가장자리를 부드럽게 잡고 ASC 시트의 접시 면을 문합 라인 위에 놓습니다. 부드러운 시트 취급과 올바른 시트 배치는 성공적인 온전한 시트 이식을 보장하는 데 필수적입니다. ASC 시트를 문합선 위아래로 약 0.25cm 조심스럽게 늘립니다.

결장 주위를 시트로 감싸고 결장을 들어 올려 ASC 시트를 등쪽으로 감쌉니다. 이식된 ASC 시트를 받지 않은 대조 동물은 수술 후 3일째에 흰색 화살표로 표시된 문합선 근처에서 대변 누출을 보입니다. 검은색 화살표로 표시된 ASC 시트를 이식한 동물은 수술 후 3일째에 배설물 누출 및 농양 형성이 감소한 것으로 나타났습니다.

수술 7일 후에도 동일한 결과가 관찰되었습니다. 이 이미지는 H와 E로 염색된 이식된 동물에서 결장 문합 부위의 대표적인 단면을 보여줍니다. 시트 구조는 수술 후 최대 7일까지 문합 부위에서 확인할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 몇 분 안에 완료할 수 있습니다.

ASC 시트는 결장의 제로 세포 표면에 자발적으로 부착되며 ASC 시트에 맞도록 접착제나 봉합사를 사용할 필요가 없습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 부분 결장 절제술 후 누출을 방지하기 위해 쥐의 결장 문합에 ASC 시트를 준비하고 이식하는 방법을 잘 이해해야 합니다.