Name: 생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 배우세요 복잡한 핵형을 가진 세포 주기 정지 세포를 분리하는 방법을 RPE-1 hTERT 세포를 사용하여. 이 기법은 비정수체 세포와 면역 체계의 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 연구소의 건강 그랜트 (CA206157-22와 GM118066) 커트 대리석 암 연구 기금 Angelika 아 몬에 의해 코흐 연구소 지원 (코어) 부여 P30-CA 14051 국립 암 연구소에서 의해 부분에서 지원 되었다. Angelika 아 몬 하 워드 휴즈 의학 연구소와 생물 의학 연구에 대 한 글렌 재단의 조사 이기도합니다. S. S. 여는 미국 이탈리아 암 재단 (AICF), 마리 퀴리 작업 및 이탈리아 협회 대 한 암 연구 (AIRC), 암 연구에 협력 하 여 그리고 기 사도좌 암 연구 장학금에 의해 지원 되었다. 전자기장 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 장학금에 의해 지원 되었다.

문화 조건
RPE 1 hTERT 셀 라인은 매체에 있는 Dulbecco의 수정이 글 (자료 테이블) 10% 보충 교양 소 태아 혈 청, 2 m L-글루타민, m 그리고 100 U/ml 페니실린/스. 셀 5% CO2 습도 환경에서 37 ° C에서 incubated 했다. 10 cm 요리를 사용 하 여 개발 되었습니다 아래에 설명 된 프로토콜을 모든 기술적인 세부 사항 보고 그 요리를 합니다. 다른 요리를 사용 하는 경우 확장 또는 그에 따라 아래로.
1입니다. RPE-1 셀의 동기화
<ol><li>모든 실험에 대 한 15 개 이상의 구절 하지 받은 갓 해 동된 셀을 사용 합니다. 1 일에 해 동 하 고 분배 ~2.5-10 cm 조직 문화 접시에 105 RPE 1 hTERT 셀 x 5.0. 표준 성장 매체의 8 mL을 추가 하 고 밤새 품 어. (예: hemocytometer) 표준 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다. 참고: 셀 밀도 RPE-1 세포의 성장 상태를 말합니다. 성장 조건이 다른 셀 라인; 사이에서 다를 수 있습니다. 그에 따라 그들을 조정 하십시오.</li>
	<li>하루에 2, g 1/S 테두리에서 셀 일반 성장 매체를 발음 5mm 티 미 딘을 포함 하는 8 mL 매체를 추가 하 여 동기화 합니다. 참고: 티 미 딘 농도 치료의 길이 다른 세포 라인에 걸쳐 달라질 수 있습니다. 그것은 셀 라인 테스트를 위한 최상의 조건을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>당일 3, 티 미 딘 매체 (1.2 단계)를 추가한 후 24 h, 매체를 발음 하 고 세 번 1 x PBS로 세포 세척 하 여 티 미 딘 블록에서 놓습니다. 일반 성장 매체의 8 mL을 추가 하 고 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
</ol>2.이 세대 Mitotic 키 Mps1의 활동을 방해 하 여 세포
<ol><li>에 티 미 딘 블록에서 하루 3, 출시 후 6 h (1.3; 단계 세포 유사 분열을 입력 하기 전에이 약 3-6 h는), 중간 발음, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 500 nM reversine (Mps1 억제제)를 포함 하는 매체를 바꿉니다. 참고: RPE-1 세포는 유사 분열 9-12 h를 입력 후에 티 미 딘 워시 아웃10,11. 그러나, 세포 주기 론 다른 셀 라인 마다 다릅니다. 따라서, 그것은 (예를 들어, 콘텐츠를 통해 FACS DNA 분석 측정 하 여) 설립된 방법으로 세포 주기 분석을 수행 하 여 파일럿 실험에서 그 속도 결정 하는 중요 한. 또한, Mps1 억제제의 최적의 작업 농도 세포 사이 달라질 수 있습니다. 이전 실험 RPE1 셀을 사용 하 여 reversine를 사용 하 여 500 nM10,,1112의 작업 집중에 성공 했습니다. 그것은 셀 라인 테스트를 위한 최적의 농도 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>하루에 4, reversine 처리 (후 세포 유사 분열에 약 6 h) 후 12 h, reversine 매체를 발음 하 고 세 번 1 x PBS 가진 세포를 씻어. 접시에 8 mL 일반 성장 매체를 추가 하 고 인큐베이터에 셀을 반환 합니다.</li>
</ol>3. Aneuploid 자전거 셀 및 ArCK 인구의 농축 제거
<ol><li>하루 6, 셀 입력 첫 번째 유사 분열 후 약 72 h에 (2.2; 단계 약 66 h reversine 워시 아웃 후, 해당 약 하는 이것이 2-3 세포 주기), 중간 발음, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 300 nM nocodazole를 포함 하는 매체를 바꿉니다. 참고: 최근 작품 aneuploid karyotypes를 은닉 하는 RPE-1 셀 genomically 불안정 하 고 그들의 확산에 대 한 체포를 보이고 있다 2-3 세포 주기 후 첫 번째 잘못 된 유사 분열10. 그러나,이 활동은 다른 세포 사이에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 aneuploid 순환 세포의 제거를 위한 적절 한 타이밍을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 중요 한입니다.</li>
	<li>하루 7, nocodazole 처리 후 12 h 매체를 발음 하 고 플레이트 1 x PBS의 3 개 mL를 추가 합니다. 접시의 측면을 눌러 mitotic 세포를 흔들어. Mitotic 세포도 제거를 허용 하도록 각 탭 사이의 접시를 회전 합니다.</li>
	<li>Mitotic 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해, 여러 라운드 (3-5 회 권장), 발음 및 각 라운드 사이 1 x PBS의 3 mL를 추가 쉐이크-오프 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>쉐이크-오프, 부드럽게 액체는 뚜껑이 나 접시의 가장자리에 고착 하는 발음. 간단히, 10 배 확대에 현미경 플레이트를 확인 하십시오. 몇 mitotic 세포 관찰 된다 확인 합니다. 5 개 이상의 mitotic 세포 10 X 목표 아래 볼 수 있습니다, 쉐이크-오프의 또 다른 라운드를 반복 합니다. 참고: Mitotic 세포는 둥근 나타나고 쉐이크-오프 후 부분적으로 분리 될 수 있습니다. 그것은 nocodazole 치료의 다음 라운드에 세포를 노출 하기 전에 mitotic 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 중요 합니다. 이렇게 하지 않으면 mitotic 세포 죽음으로 이어질 및 tetraploid 세포의 생성 될 수 있습니다.</li>
	<li>마지막 악수-오프 후, 셀 1 x PBS의 5 mL로 한 번 씻는 다. 8 mL 매체 330 nM nocodazole를 포함 하는 접시에 추가 하 고 12 h에 품 어.</li>
	<li>아니 mitotic 세포 배양 후 관찰 하는 때까지 모든 12 h nocodazole 치료/동요-오프 (3.1-3.5 단계) 반복 합니다. 일반적으로, 치료/동요-오프의 4-5 라운드는 것이 좋습니다. 참고: 여기에 제공 된 정보는 RPE-1 셀에 참조 하십시오. 치료/동요-오프 라운드의 수는 다른 세포 사이에서 달라질 수 있습니다. Nocodazole 연장 하 고 불필요 한 노출을 피하기 위해 신중 하 게 결정, 파일럿 실험에서 aneuploid 자전거 셀의 효율적이 고 완전 한 제거에 필요한 라운드 수에 결정적 이다.</li>
	<li>4-5 라운드 후의 nocodazole 치료/쉐이크-(3.1-3.6 단계), 일반 성장 매체의 10 mL을 추가 하 고 품 어. 세포 조작 또는 분석 결과 장차 전에 12-24 h 동안 휴식을 하실 수 있습니다. 참고: 마지막 악수-오프 후, 접시에 남은 세포 세포 주기 검거 그리고, 같이 최근10, 항구의 복잡 한 karyotypes. 이 세포를 ArCK (복잡 한 Karyotype와 체포) 세포 라고 합니다. 그것은 격리 1 주일 이내 ArCK 인구에 분석 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>필요에 따라 복잡 한 karyotypes 체포 셀의 비율을 평가 하기 위해 수집 하 고 각 쉐이크-오프 표준 셀 카운터를 사용 하 여에서 셀 키를 누릅니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> 그림 1: 생성 하 고 복잡 한 karyotype (ArCK)와 대표 이미지 aneuploid 세포를 분리 하는 데 사용 하는 방법의 전체 회로도. (A) 회로도의 ArCK 세포 생성 및 격리 프로토콜. (B) RPE 1 hTERT 세포 치료의 각 단계에서의 대표 이미지. 마지막 패널 (빨간색으로 설명 된) 격리 ArCK 셀을 나타냅니다. 눈금 막대 100 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
4입니다. ArCK 인구의 특성
<ol><li>다음 분석을 수행 하 여 ArCK 인구의 성공적인 분리를 확인 합니다.<ol>
<li>엉덩이 베타-galactosidase 얼룩 (노화의 마커)를 상업적으로 사용할 수를 사용 하 여 키트 (재료의 표 참조).</li>
		<li>상용 장비 (재료의 표 참조)를 채용 하 여 CCL2, 같은 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 측정 합니다.</li>
		<li>세포 주기 억제제 p53, p21, 서쪽 오 점, p16의 증가 수준을 확인 합니다. 참고: 이러한 분석을 제대로 제어 하려면 ArCK 인구는 euploid와 aneuploid 자전거 셀에 비교할 수 한다. 전자는 낮은 통로, 야생-타입 RPE 1 hTERT 기 하 급수적으로 성장 하는 세포. 후자의 RPE 1 hTERT에 염색체 미 분리를 유도 하 고 수확 하는 첫 번째 탈 선 유사 분열 후 세포 72 h에 의해 얻어질 수 있다. 이렇게 하려면 단계 1.1 수확 셀 및 첫 번째 nocodazole 치료 (3.1 단계) 앞에서 설명한 프로토콜을 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>체포 셀의 karyotype를 평가 하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 수행 합니다. 참고: 단일 셀 연속13단일 셀 수준 셀 인구에서 염색체 및 하위 염색체 변화를 확인 하려면 잘 설립 방법 이다. 단일 셀 시퀀싱을 수행 하는 방법에 대 한 자세한 절차 다른10을찾을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li>
<li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer%3A+from+yeast+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li>
<li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li>
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<li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).</li>
<li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li>
<li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li>
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<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li>
<li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

생성 하 고 복잡 한 karyotypes (ArCK) 체포 된 셀에 대 한 풍부이 소설 메서드는 여러 염색체 이익 또는 손실이 있고 분할 중단 셀의 연구에 대 한 수 있습니다. 방법은 설치는 신속 하 고 안정적인 방식으로 ArCK 셀의 분리를 촉진 하기 위하여 설계 되었습니다.
이 분석 결과에서 가장 중요 한 단계는 약물 치료의 타임 라인 및, 가장 중요 한 것은, aneuploid 자전거 세포의 제거를 엄격 하 게 통제 하 고. 최적의 결과 얻으려면 nocodazole 치료와 쉐이크-오프 타이밍은 특정 중요 그들은 여전히 둥근 mitotic, g 1에 mitotic 세포 죽음 또는 지연의 가능성을 방지 하는 동안 자전거 셀 접시에서 제거 되도록 잠재적으로 만드는 tetraploid 인구. 동요-오프 타이밍 권장된 12 h nocodazole 외피에서 2 시간 이상 일탈 하지는 것이 좋습니다.
세포는 어떻게 복잡 한 karyotypes의 깊은 이해를 촉진 가능성이 ArCK 미래 연구 세포 생리학을 영향을 줍니다. 특히, 최근 연구는 면역 체계의 세포와 상호 작용 수 있습니다 및 ArCK의 트리거 면역 클리어런스 셀10설명 했다. 여기 설명 하는 방법을 기본 현상은 세포와 어떻게 종양 변화의 연구에서 면역 클리어런스 분자 메커니즘의 정화를 포함 하 여 ArCK 셀의 추가 특성에 대 한 훌륭한 출발점을 제공 이 감시 메커니즘, 필드14,15에서 중요 한 질문을 무시할 수 있습니다.

이수성, 단일 보완1,2,,34의 배수가 염색체 수에 의해 특징 조건이 염색체 분리 과정에서 오류가 발생할. 이 게놈 불안정성5,를 추가 생성 하는 트리거 복제 스트레스 karyotypes6,7,8,,910증가 karyotype 복잡도 및 궁극적으로 리드 셀10의 부분 모집단의 세포 주기 검거를. 여기에 제시 된 방법의 목적은 생성 및 세포 사이클 같은 부분 모집단을 별도 것입니다. 저렴 한 조직 배양 기법을 채용 하 여이 프로토콜 격리 및 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀 세포 주기 검거의 특성화를 촉진 한다. 이러한 셀 ArCK (복잡 한 Karyotype와 체포) 세포와 컨트롤로 euploid 자전거 들을 이라고 합니다.
이 프로토콜은이 목적을 위해 설립 하는 첫 번째를 격리 허용 하 고 포함, 그들의 유도 노화 및 노화 관련 분 비 형 (SASP), 하 되이 국한 되지 않고 그들의 프로-염증 성 ArCK 라인의 진학 기능과 면역 세포와 함께 참여 하는 능력. 여기에 제시 된 방법 보내지고, 불멸 하 게 인간의 세포에서 개발 되었습니다 하지만 암 라인에서 아직 테스트 되지 않았습니다. 일부 변환 된 셀 하나 또는 여러 개의 경로;의 억제로 인해 세포 주기 검거에 민감한 있을 수 있습니다. 따라서, 추가 유효성 검사 다른 셀 라인에서 수행 되어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM (둘베코' s Modified Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p21 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p16 항체</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>노화 b-갈락토시다제 염색 키트</td><td>세포 신호 기술&nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>프로테옴 프로파일러 인간 사이토카인 어레이 키트&nbsp;</td><td>R& D 시스템</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

생성 및 복잡 한 karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

염색체 미 분리 이수성, 조건이 있는 셀 항구 불균형 염색체 수를 이끌어 낸다. 여러 줄의 증거는 강하게 그 이수성 게놈 불안정성, 궁극적으로 그들의 확산을 체포 하는 복잡 한 karyotypes와 세포 생성을 유발 나타냅니다. 격리 및 복잡 한 karyotypes를 은닉 하는 세포의 세포 생리학에 불균형 염색체 수의 영향을 연구 하는 중요 한 있습니다. 날짜 하려면, 아무 방법 같은 aneuploid 셀을 안정적으로 설립 되었습니다. 이 문서 표준, 저렴 한 조직 배양 기법을 활용 하 여 복잡 한 karyotypes 농축 및 aneuploid 세포의 분석을 위한 프로토콜을 제공 한다. 이 프로토콜 등 그들의 유도 노화 관련 분 비 형, 프로-염증 성 속성, 능력을 면역 세포와 상호 작용 하는 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀의 여러 가지 기능을 분석을 사용할 수 있습니다. 때문에 암 세포는 종종 불균형 염색체 수에 항구, 이수성 두는 pro 및 안티 tumorigenic 효과 잠복의 궁극적인 목표와 정상 세포에서 세포 생리학에 미치는 해독 결정적 이다.

이 메서드는 생체 외에서 조직 문화 시스템 그들의 확산을 체포 하는 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀을 사용 합니다. 이 인구 (복잡 한 Karyotypes와 체포) ArCK 셀 이라고 합니다. 그림 1A 는 실험의 계획을 보여 줍니다. 야생-타입 자전거 RPE 1 hTERT 셀 티 미 딘 G1/S 국경에 동기화 되며 염색체 미 분리를 유도 하는 Mps1 억제제로 치료. 스핀 들 독 nocodazole 염색체 미 분리의 유도 후 72 h에 있는 셀에 추가 됩니다. nocodazole 치료, 증식 수 aneuploid 셀 후 12 h 유사 분열을 입력 하 고이 세포 주기 단계 microtubule 합 방해 때문에 갇혀 있다. 갇혀 이러한 셀은 다음 부드러운 쉐이크-오프에 의해 쉽게 제거. 동요-오프 과정이 반복된 3-5 회 순환 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해입니다. 그림 1B 는 처리의 각 단계에서 RPE-1 셀의 대표 이미지를 보여 줍니다.
ArCK 셀 세포 주기 억제제, p53, p21, p16 그림 2A와 같이 euploid와이 셀, 자전거에 비해 등의 증가 수준을 표시 합니다. 또한, 그림 2B 긍정적인 β-galactosidase ArCK euploid 제어 세포에 비해 세포에서 세포 노화에 대 한 확고 마커 얼룩을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> 그림 2: ArCK 셀을 활용 하는 대표적인 결과. ((A)) 서쪽 오 점 euploid,이 순환, 및 ArCK 세포에서 세포 주기 억제제 수준 평가. P53, p21, p16의 레벨은 서쪽 오 점 분석에 의해 결정 되었다. 말라 로드 제어로 제공. (B) β-galactosidase ArCK 세포에서 노화의 수준 평가 얼룩. 노화 관련 된 β-galactosidase (β-Gal) 활동 euploid 셀과 ArCK 셀에서 결정 되었다. 눈금 막대 100 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 세포 주기 검거 대표 karyotype 분석 단일 셀 임의의 염색체 이득과 손실을 그림 3ArCK 셀 표시 여러, 시퀀싱에서 같이 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀의 눈에 띄는 기능입니다. 이 발견 이전 보고서10완전 한 합의에 있다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> 그림 3: ArCK 셀의 대표 단일 셀 시퀀싱. 세그먼트화 6 대표 ArCK 셀의 karyotype를 보여주는 플롯 합니다. 세그먼트화 플롯 (야생 유형 RPE-1은 여성 근원의 2 중 셀 라인) 로그2 규모로 euploid 참조를 기준으로 x 1에서 모든 염색체의 복사본 수를 표시 합니다. 염색체 이득 녹색에서 빨간색, 염색체 손실에 강조 표시 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이수성 게놈 불안정성, 결국 복잡 한 karyotypes 셀 세포 주기 검거를 이끌어 낸다. 이 문서 분할 중단 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀을 간단 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 복잡한 핵형을 가진 세포주기 정지 세포를 생성하고 분리하는 간단한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 면역 체계와 이수성 세포의 상호 작용과 같은 이수성 연구 분야의 주요 질문에 대한 답변을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복잡한 핵형만 있는 세포 집단을 생성한다는 것입니다.RPE-1 hTERT 세포의 동기화를 시작하려면 갓 해동한 세포를 사용하고 8ml의 표준 성장 배지를 사용하여 10cm 조직 배양 접시에 분배합니다. 다음으로, 혈구계를 사용하여 세포 수를 확인합니다. 그런 다음 밤새 세포를 배양합니다.다음 날, 표준 성장 배지를 5 밀리몰 티미딘을 함유 한 배지로 교체하십시오. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 G1S 경계에서 세포를 동기화합니다. 24시간 후 PBS로 세포를 세 번 씻습니다.그런 다음 세척된 세포에 표준 성장 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 6시간 동안 배양합니다. 먼저 10ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 500 나노몰 Mps1 억제제 리버신을 함유한 배지를 추가합니다.섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 세포를 세 번 씻는다. 그런 다음 표준 성장 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.첫 번째 비정상적인 유사분열 후 약 72시간 후에 10ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 330 나노 몰 노코다졸을 함유 한 배지를 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다.다음날, 노코다졸 배지를 흡인합니다. 그런 다음 접시에 PBS 3ml를 넣고 접시 측면을 두드려 유사분열 세포를 털어냅니다. 각 탭 사이에 플레이트를 회전하여 유사 분열 세포를 균일하게 제거 할 수 있습니다.처음 흔든 후 접시의 뚜껑과 가장자리에 부착된 액체를 흡입합니다. 그런 다음 10X 배율로 현미경 아래의 플레이트를 확인합니다. 그런 다음 5ml의 PBS로 세포를 씻습니다.다음으로, 330 나노 몰 노코다졸을 함유 한 배지를 첨가한다. 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다. 마지막 쉐이크 오프 후 10ml의 표준 성장 배지를 추가합니다.분석을 수행하기 전에 섭씨 37도에서 12-24시간 동안 세포를 배양합니다. 플레이트에 남아 있는 세포는 복합 핵형 또는 ArCK 세포로 정지된 것으로 지칭됩니다. 이 프로토콜은 ArCK 셀을 분리하는 간단한 방법을 설명하며, ArCK 셀에 특이적인 여러 기능을 분석하여 분리를 확인합니다.ArCK 세포는 면역블롯 분석에서 세포주기 억제제 p53, p21 및 p16의 수치가 증가한 반면, 유배체 및 이수성 순환 세포는 그렇지 않습니다. 또한 ArCK 세포는 노화 관련 베타-갈락토시다아제에 양성이며, 이는 청록색으로 염색되지만 유배체 대조 세포는 그렇지 않습니다. 분할 플롯은 ArCK 세포가 이수성이며, 여러 개의 무작위 염색체 이득과 염색체 손실을 특징으로 한다는 것을 보여줍니다.분할 플롯은 염색체 1에서 X까지의 단일 세포의 복제 수를 보여주며, 이는 유배체 참조 로그 2 척도를 기준으로 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 쉐이크 오프 동안 모든 유사 분열 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 이 절차를 수행한 후, 사이토카인 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이러한 분석은 ArCK 세포가 면역 체계의 세포와 상호 작용하는 능력과 같은 추가 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 노코다졸이 위험하다는 것을 잊지 마십시오. 이 시약을 사용하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.이 기술을 마스터하면 in vitro에서 ArCK 세포를 효율적으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차는 올바르게 수행하면 7일 이내에 완료할 수 있습니다.

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연구

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암 연구

Karyotyping 널리 유전 변경을 검출에 사용되는 간단하고 유용한 기술입니다. 우리가 문화의 유지 이러한 세포의 염색체 상태를 감시하기위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 보급 준비 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다.

Karyotyping를위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 확산 준비

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

세포주기 단계의 진행과 속도론의 추적 미묘한 변화는 Propidium 요오드화물의를 통해 BrdU 및 전체 게놈의 DNA의 염색법과 핵산의 대사 라벨링의 조합을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 방법은이를 차례로 세포주기의 진행에 영향을 미치는가 아닌 특정의 DNA 손상의 도입을 방지, 자전거 전지의 화학 동기화의 필요성을 방지합니다.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

배양 세포에서 염색체 준비

다배체 세포의 염색체 불안정성을 분석하기 위해서는 증식 배수체 세포가 필요하지만, 변형되지 않은 인간 세포에서 이러한 세포를 만드는 것은 쉽지 않습니다. 본 보고서는 정상적인 인간 섬유아세포로부터 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 확립하기 위한 비교적 간단한 절차를 설명합니다.

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

우리는 세포주기의 특정 단계와 관련된 사건을 연구하기위한 배경 정보를 제공하는 두 가지 세포 동기화 프로토콜을보고합니다. 우리는이 접근법이 교란되지 않은 세포주기 또는 세포주기에 영향을 미치는 약물에 노출되었을 때 특정 유전자의 조절을 분석하는데 유용하다는 것을 보여준다.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

배우세요 복잡한 핵형을 가진 세포 주기 정지 세포를 분리하는 방법을 RPE-1 hTERT 세포를 사용하여. 이 기법은 비정수체 세포와 면역 체계의 상호작용 연구에 활용됩니다.

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