생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

이 프로토콜의 전반적인 목표는 복잡한 핵형을 가진 세포주기 정지 세포를 생성하고 분리하는 간단한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 면역 체계와 이수성 세포의 상호 작용과 같은 이수성 연구 분야의 주요 질문에 대한 답변을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복잡한 핵형만 있는 세포 집단을 생성한다는 것입니다.

RPE-1 hTERT 세포의 동기화를 시작하려면 갓 해동한 세포를 사용하고 8ml의 표준 성장 배지를 사용하여 10cm 조직 배양 접시에 분배합니다. 다음으로, 혈구계를 사용하여 세포 수를 확인합니다. 그런 다음 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날, 표준 성장 배지를 5 밀리몰 티미딘을 함유 한 배지로 교체하십시오. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 G1S 경계에서 세포를 동기화합니다. 24시간 후 PBS로 세포를 세 번 씻습니다.

그런 다음 세척된 세포에 표준 성장 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 6시간 동안 배양합니다. 먼저 10ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 500 나노몰 Mps1 억제제 리버신을 함유한 배지를 추가합니다.

섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 세포를 세 번 씻는다. 그런 다음 표준 성장 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.

첫 번째 비정상적인 유사분열 후 약 72시간 후에 10ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 330 나노 몰 노코다졸을 함유 한 배지를 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다.

다음날, 노코다졸 배지를 흡인합니다. 그런 다음 접시에 PBS 3ml를 넣고 접시 측면을 두드려 유사분열 세포를 털어냅니다. 각 탭 사이에 플레이트를 회전하여 유사 분열 세포를 균일하게 제거 할 수 있습니다.

처음 흔든 후 접시의 뚜껑과 가장자리에 부착된 액체를 흡입합니다. 그런 다음 10X 배율로 현미경 아래의 플레이트를 확인합니다. 그런 다음 5ml의 PBS로 세포를 씻습니다.

다음으로, 330 나노 몰 노코다졸을 함유 한 배지를 첨가한다. 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다. 마지막 쉐이크 오프 후 10ml의 표준 성장 배지를 추가합니다.

분석을 수행하기 전에 섭씨 37도에서 12-24시간 동안 세포를 배양합니다. 플레이트에 남아 있는 세포는 복합 핵형 또는 ArCK 세포로 정지된 것으로 지칭됩니다. 이 프로토콜은 ArCK 셀을 분리하는 간단한 방법을 설명하며, ArCK 셀에 특이적인 여러 기능을 분석하여 분리를 확인합니다.

ArCK 세포는 면역블롯 분석에서 세포주기 억제제 p53, p21 및 p16의 수치가 증가한 반면, 유배체 및 이수성 순환 세포는 그렇지 않습니다. 또한 ArCK 세포는 노화 관련 베타-갈락토시다아제에 양성이며, 이는 청록색으로 염색되지만 유배체 대조 세포는 그렇지 않습니다. 분할 플롯은 ArCK 세포가 이수성이며, 여러 개의 무작위 염색체 이득과 염색체 손실을 특징으로 한다는 것을 보여줍니다.

분할 플롯은 염색체 1에서 X까지의 단일 세포의 복제 수를 보여주며, 이는 유배체 참조 로그 2 척도를 기준으로 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 쉐이크 오프 동안 모든 유사 분열 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 이 절차를 수행한 후, 사이토카인 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이러한 분석은 ArCK 세포가 면역 체계의 세포와 상호 작용하는 능력과 같은 추가 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 노코다졸이 위험하다는 것을 잊지 마십시오. 이 시약을 사용하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.

이 기술을 마스터하면 in vitro에서 ArCK 세포를 효율적으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차는 올바르게 수행하면 7일 이내에 완료할 수 있습니다.