Name: 연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 인공 microRNA와 옵토제네틱스를 결합하여 완전한 신경 회로 내에서 유전자 최저 효과가 있는 시냅스 전 기능을 특성화하는 방법을. 이 기술은 시냅스 생리학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 데모와 도움에 대 한 지원 및 카멜 Vitale F. Benfenati (Istituto 이탈리아 디 기술, IIT)을 감사 합니다. 이 작품은 IIT와 Compagnia 산 파올로 (부여 번호 9734 락)에 의해 투자 되었다.

<ol><li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther-Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).</li>
<li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+loss+of+P%2FQ-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li>
<li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+postnatal+loss+of+P%2FQ-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy%2C+dyskinesia%2C+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li>
<li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+P%2FQ-Type+Ca2%2B+Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC%2FmiR-155%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53(2006).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li>
<li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845(2014).</li>
<li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li>
<li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+facilitation+of+P%2FQ-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li>
<li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P%2FQ-type+channel+alpha1%282.1%29+subunits%3A+implications+for+current+density+and+Ca2%2B-dependent+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone%3A+a+designer%27s+guide+to+potent+multi-target+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48(2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Optogenetic 프로브와 관심의 연 접 유전자에 대 한 미르의 공동 식 연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저의 효과 하 강력한 방식을 제공 합니다. 이 실험적인 접근에 대 한 확인 하 고는 매우 효율적이 고 선택적 네이티브 시스템에 관심사의 유전자를 노크에 미르의 특성 중요 하다. 가능 하면 최종 대상에서 효과 대 한 관심의 동일한 mRNA에 대해 두 개 이상의 독립적인 미르 제어에 사용 되어야 한다. 구조 실험, 미르 저항 유전자는 시스템에 재는 특이성에 대 한 제어로 사용할 수 있습니다.
optogenetic 표현 하 동일한 구문을 사용 하 여 프로브와 한 미르 광학 조작 되어 연 접 신경만을 자극에 대 한 수 있습니다. 이건 전기 stimulations 가능 때문에 그들은 감염 되 고 감염 되지 않은 신경, 따라서 생산 하는 혼합과 희석 결과 구분 하지 않습니다. 광 stimulations 여러 활동 전위15일으킬 수 있다, 때문에 가장 빠른 optogenetic 프로브는 확장 팔레트15,19,,2021중에서 선택 하는 것 중요 하다. 또한, 광 자극 연 접 boutons의 직접 도발은 유도 하지 않습니다, 하나22를 조사 하고자 하는 시 냅 시스 전송의 단계 중 일부를 무시 하지 않으려면를 위해 필수적입니다.
우리가 여기, 설명 실험적인 접근 (4-6 개월) 제한 된 기간 내 동시에 관심의 여러 연 접 유전자의 생리 적인 관련성을 평가 하 가능 하 게. 그러나, 그것은 명심 knockdowns 거의 100% 도달 하는 것이 중요입니다. 또한, rAAVs 초기 발달 과정을 조사 하는 경우 시간 제약 조건을 나타내는 optogenetic 조사의 최대 최저의 전체 표현에 대 한 수 있도록 최소한 2 주 동안 표현 될 필요가 있다. 비록 더 많은 시간이 소요, 조건부 녹아웃 쥐 연 접 신경에 제한 일반적으로 결과 관심사의 유전자의 제거를 완료 하 고 따라서 유효한 상호 보완적인 접근 방식을 제공.
미르 기술의 특정 장점은 같은 발기인에서 여러 미르의 식을 것 이다. 주로이 속성 같은 미르 또는 동일한 대상 유전자에 대 한 다른 미르의 여러 복사본을 삽입 하 여 최저 효율을 높이기 위해 사용 되었습니다. 그러나 그것은 수 하는 데 사용 또한 최저 여러 유전자 표현에 대 한 다른 대상 유전자7,23미르. 이 속성은 여러 연 접 단백질 신호 통로 연 접 부에 침묵 하 사용할 수 있습니다.
여기, 우리는 급성 hippocampal 조각에 연 접 기능에 유전자 최저의 효과 특성 인공 미르와 optogenetics를 결합 했다. 비슷한 접근 방식은 조작 하 고 신경 회로 vivo에서조사 또한 사용 될 수 있습니다. 또한, chemogenetic 인공 미르 결합 접근 것 가능 하나가 더 긴 시간의 척도에 신경 회로

이 프로토콜에는 연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저의 효과 특성화 하는 새로운 접근 방식을 설명 합니다. 그대로 신경 회로에 연 접 기능을 조사 하는 것은 많은 연 접 boutons 너무 작기 때문에 및 멀리 결합된 분자와 electrophysiological 개입 있도록 소마에서 도전적 이다. RNA 간섭 최저의 시 냅 스 단백질1을 강력 하 고 유연한 방법을 제공 합니다, 하지만이 방법은 사용 되었습니다 아껴 서 최저 전통적인 사용의 효과 검출 하기 어렵기 때문에 연 접 기능을 조사 하 구분 하지 않는 전기 stimulations 조작 및 순진한 연 접 boutons2. 여기, 우리가 인공 예측에 관한 (미르)를 결합 하는 방법에 설명-급성 뇌 조각에 조작된 연 접 boutons의 선택적 자극을 달성 하기 위해 최근에 개발 된 optogenetic 기술로 RNA 간섭 중재.
전기 생리학 함께에서 조건부 녹아웃 쥐 연 접 단백질3,4의 기능을 조사 하기 위해 사용 될 수도, 하는 동안 우리의 전략 필요 하지 않은 개발 및 유지 보수의 유전자 마우스 라인을 수정 하 고 유전자의 특정 isoforms를 허물고 또한 쉽게 채택 될 수 있다. 더 일반적으로 상대적 사용된 짧은 헤어핀 RNAs (shRNAs), 우리 여기 사용 하 고, 인공 미르 뉴런에 최저에 대 한 주요 이점을 제공 합니다. ShRNAs, 달리는 중 합 효소 II 발기인1의 제어에서 표현할 수 있습니다. 따라서, 단일 발기인 미르의 형광 기자와 함께 optogenetic 프로브 식 드라이브를 사용할 수 있습니다. 이 방법에서는, 포장의 한계 내에서 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV, 그림 1A)는 구조물의 크기를 보관할 수 있습니다. 또한, 단일 구조와 단일 발기인의 사용은 미르, optogenetic 프로브 및 고정된 비율에 형광 리포터의 표현에 대 한 허용 하기 때문에 실험적인 변화를 감소.
우리는 최근 마5연 접 칼슘 채널의 양자 택일로 접합된 isoforms의 역할을 검토 하는이 기술을 적용 했습니다. 이러한 전략의 어떤 두뇌 회로에 다른 presynaptically 표현한 단백질의 생리 적인 관련성을 공부에 일반적으로 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>아크릴아미드</td><td>시그마</td><td>아크릴아미드/비스-아크릴아미드, 30% 용액</td><td></td></tr><tr><td>독성 동물 온도 컨트롤러(열 패드 포함</td>) <td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi 발현 벡터 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Brain slices Prechamber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라 기반 이미저</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade; MP</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 시약</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>화학 발광 기질</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL 웨스턴 블로팅 시약, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>C2432</td><td>독성</td></tr><tr><td>시토신 &베타;-D-아라비노푸라노사이드</td><td>시그마</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 연고</td><td>지역 약국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>주사 마이크로피펫</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>무기염 및 세제</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2- 크레아틴 인산</td>염 <td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconate</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membrane</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade; 0.2 &micro; m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 홀더</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>안구 윤활제</td><td>지역 약국</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>인산염 억제제</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td></td></tr><tr><td>단백질 젤 전기영동 및 블로팅 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III 세포</td><td></td></tr><tr><td>프로비돈 요오드</td><td>지역 약국</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol 용해 시약</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>독성</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse 전사 키트</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>정위 장치</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>테트로도톡신</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>독성</td></tr><tr><td>비브라톰</td><td>라이카</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 micrornas optogenetics 결합

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

이 프로토콜의 목적은 그대로 신경 회로 내에서 연 접 기능에 유전자 최저의 효과 특성 이다. 우리 인공 예측에 관한 (미르)를 결합 하는 방법에 대 한 워크플로 설명-급성 뇌 조각에 조작된 연 접 boutons의 선택적 자극을 달성 하기 위해 optogenetics RNA 간섭 중재. 실험 방법은 단일 바이러스 성 구조 및 드라이브는 optogenetic 프로브 및 연 접 gene(s)에 대 한 인공 miR(s)의 식 단일 신경 특정 발기인의 사용을 포함. Stereotactically 관심 뇌 영역에 주입 때 표현된 구문 수 있습니다 빛 조사 gene(s)의 감소 식이 독점적으로 뉴런을 자극 하. 이 전략 개발 및 유전자 변형된 마우스 라인의 유지 관리를 필요로 하지 않습니다 하 고 적용할 수 있는 원리에 다른 유기 체 및 선택의 모든 신경 진. 우리는 최근 연 접 P/Q 유형 전압 개폐 칼슘 채널 (VGCCs)의 대체 스플라이스 isoforms의 최저 급성 hippocampal 조각에서 CA1 흥분 성의 시 냅 스에 CA3에서 단기 시 냅 스가 소성을 조절 하는 방법을 조사를 적용 했습니다. 비슷한 접근 방식은 조작 하 고 신경 회로 비보프로브 사용 될 수 있습니다.

위에서 설명한 절차 평가 방법 시 냅 스 전송 하는 강력한 방법을 연 접 신경에서 시 냅 스 단백질의 분해에 의해 영향을 제공 합니다. 대안의 최저 연 접 Cav2.1의 isoforms를 결합 하는 방법에 대 한 대표적인 결과 (P/Q 타입) VGCCs CA3 CA1 흥분 성의 시 냅 스는 예를 들어 아래에 주어진 하에서 단기 시 냅 스가 소성을 조절.
Cav2.1 (P/Q 유형) 채널은 중앙 신 경계에서 가장 빠른 시 냅 스에서 우세 연 접 VGCCs. 대체 상호 배타적인 exons의 접합 37a와 37b는 기 공 형성 α1 소 단위 Cav2.1 (α1A)의, 생산 하 고 2 개의 주요 이체 Cav2.1 [EFa] Cav2.1 [EFb]16,17 18. 확인 하려면 여부 Cav2.1 [EFa] 및 Cav2.1 [EFb] 차동 조절 시 냅 스 전송 및 쥐 hippocampal 피라미드 신경이 소성, 우리가 먼저 개발 isoform 특정 미르 최저를 선택적으로 Cav 2.1 [EFa] 또는 Cav2.1 [EFb]5. 짧은 크기에도 불구 하 고 (97 bp)와 높은 유사성 (뉴클레오티드 수준에서 61.86% 정체성) exons 사이 37a와 37b, 우리에 대 한 세 미르 시퀀스 디자인 수 Cav2.1 [EFa] 쥐 (미르 EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; 미르 EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; 미르 EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) 2 쥐 Cav2.1 [EFb]에 대 한 (미르 EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; 미르 EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) 예측 높은 최저 효율. 부정적인 제어 (미르 제어), 우리는 어떤 알려진된 척 추가 있는 유전자를 대상 하지 않는 시퀀스를 포함 하는 pcDNA6.2-GW/EmGFP-미르-neg 플라스 미드를 사용 합니다. 우리 미르 EFa1 EFa3 미르, 미르 EFb2 선택 하 고 그들의 식 카세트에는 3' UTR rAAVs의 생산을 위해 설계 된 pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, 벡터의 복제 HEK 293 세포 분리 채널에 대 한 첫 번째 화면을 바탕으로, 어디에 synapsin 모터 드라이브 초고속 channelrhodopsin ChETA, 빨간색 형광 단백질 TdTomato 및 삽입 된 미르 (그림 1)의 표현. 우리는 또한 미르가이 미르의 때 려 눕 힘 효율성을 증가 하는 EFb2의 식 카세트를 중복.
다음으로, 우리 위의 4 구문에 대 한 rAAV1/2를 준비 하 고 계량 그들의 최저 효율 및 기본 쥐 신경 문화 isoform 특정 qRT-PCR를 사용 하 여 선택. EFa1 미르와 미르 EFa3 감소 기본 Cav2.1 [EFa] ~ 70%의 mRNA만 하지의 Cav2.1 [EFb] 미르 EFb 네이티브 캘리포니아v2.1 [EFb] ~ 60%의 mRNA만 하지 Cav2.1 [EFa] (그림 2)의 감소 하는 동안.
우리 다음 stereotactically 4 rAAV1/2의 각에 주입 (그림 3A-C), P18 쥐의 해 마의 CA3 영역 (A P/M-L/D-V Bregma에서) −2.6의 좌표 / ± 2.9 / −2.9. 15 ~ 20-4 일 후 주입, 우리 rAAV1/2 주입 쥐에서 급성 hippocampal 슬라이스를 준비 하 고 식 (그림 3B) rAAVs의 지역화를 확인 하려면 TdTomato 형광을 사용. CA1 시 냅 스에 CA3에서 단기 시 냅 스가 소성 연 접 최저 Cav2.1 [EFa] 또는 Cav2.1의 [EFb]에 영향을 받는지 조사, 우리 간단한 473 nm 레이저 광 펄스 (2 ms 동안에와 함께 선택적으로 감염된 CA3 신경 자극 ; 그림 3C) 패치 피라미드 뉴런 (그림 3C) CA1 영역의 중간 지 대에 인접 하 여 결과 EPSCs를 기록 했다. 우리는 Cav2.1 스플라이스 isoforms의 최저 영향 반대 방향으로 결합 펄스 자극에 응답을 발견: 최저 Cav2.1의 [EFa] 미르 EFa1 (미르 EFa3) 쌍 펄스 촉진 (PPF) 증가 반면 Ca의 최저 v2.1 [EFb] (미르 EFb2) 그것은 (그림 3D, E) 폐지.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> 그림 1: 체계는 초고속 optogenetic 프로브 ChETA 및 Cav2.1 [EFa] 및 Cav2.1 [EFb]에 대 한 isoform 특정 미르의 결합 된 표현에 대 한 구문입니다. (A) 는 rAAV의 지도 구성 pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, synapsin 발기인 (Syn)을 포함, 초고속 channelrhodopsin ChETA 융합 TdTomato 하 고에 근 3' UTR, Cav2.1 스플라이스 isoform 특정 미르. 표시 된 제한 효소는 단일 커터. (B) 식 카세트의 상단, 체계. Synapsin 모터 드라이브 ChETA TdTomato와 isoform 특정 미르의 표정. 하단, 미르 카세트의 일부를 구성 하는 21-뉴클레오티드 대상 시퀀스의 반전 보수. 미르 EFb2에 대 한 두 개의 동일한 미르 카세트는 다른 후 하나에 표현 되었다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> 그림 2입니다. 최저 효율 및 Cav2.1 [EFa] 및 Cav2.1 [EFb] isoform 특정 미르의 선택의 평가. 17-18 DIV 기본 문화 중 Cav2.1 [EFa] (EFa1 미르와 미르 EFa3)을 대상으로 하는 미르를 표현 하는 rAAVs 6 DIV에 감염에서 분리 된 RNA에 Isoform 특정 qRT-PCR 분석 또는 Cav2.1 [EFb] (미르 EFb2). 데이터는 부정적인 제어 (미르 제어)로 정규화 됩니다. EFa1 미르와 미르 EFa3 크게 하 고 선택적으로 mRNA Cav2.1의 [EFa] 감소 (n = 8 및 7 문화, 각각), 미르 EFb 크게 하 고 선택적으로 감소 [EFb] 캘리포니아v2.1의 mRNA (n = 4 문화; * * * p &lt; 0.001; 단방향의 분석 분산 테스트 테스트 후 Tukey Kramer에 의해 다음). 데이터는 ± SEM.를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 이 그림에서 Thalhammer, A. 외 적응 되었습니다. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> 그림 3입니다. Optogenetics와 노크 다운 신경의 자극을 대상으로 평가의 역할 Cav2.1 [EFa] 및 Cav2.1 [EFb] 여 기본 마. (A) 체계의 vivo에서 감염에 사용 되는 rAAV 구문 식 카세트입니다. ((B)) Hippocampal 섹션 TdTomato 형광 CA3 영역 및 그것의 계획을 보여주는. (C) 실험 구성: 레이저 빔 CA3 somata에 지시 했다 및 패치 클램프 기록 CA1 피라미드 뉴런에서 수행 했다. (D) 2 ms 동안 블루 (473 nm) 레이저 광 펄스 20 Hz에서 났는 데 연상 EPSCs 누구의 PPF 미르 Cav2.1 [EFa]을 대상으로 하 여 증가 하며 Cav2.1에 대 한 미르 [EFb]에 의해 폐지. (E) 요약 (D)에서 실험에 대 한 대응 펄스 비율의 증가에서 보여주는 PPF 미르 EFa1 EFa3 미르와 미르 EFb2에 대 한 감소에 대 한 미르 컨트롤에 상대적인 (n = 9-11 녹음; * p = 0.02; * * p = 0.01; * * * p &lt; 0.0004, 공분산 분석). 데이터는 ± SEM.를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 이 그림에서 Thalhammer, A. 외 적응 되었습니다. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜은 인공 예측에 관한 중재 RNA 간섭 그대로 신경 회로 내에서 선택적 gene(s)의 감소 식이 구체적으로 연 접 boutons를 자극 하는 optogenetics와 결합 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 합니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

인공 microRNA 매개 RNA 간섭을 광유전학과 결합하는 전반적인 목표는 온전한 신경 회로 내에서 시냅스전 기능에 대한 유전자 녹다운의 영향을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 온전한 뇌 회로에서 시냅스전 단백질의 생리학적 역할을 다루는 것과 같은 시냅스 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조사 중인 시냅스전 단백질의 발현이 감소된 뉴런에서 시냅스 전달을 선택적으로 모니터링할 수 있다는 것입니다.또한, 우리는 이 방법을 사용하여 급성 뇌 절편에서 시냅스전 기능을 조사했습니다. 또한 생체 내에서 신경 세포의 보안을 조작하고 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 대학원생인 Carmela Vitale입니다.microRNA를 설계하고 microRNA와 광유전학적 프로브를 발현하기 위한 재조합 벡터를 구축한 후, 관심 뇌 영역에서 1차 신경 세포 배양을 준비합니다. 이를 위해 L.A.Cingolani and Company의 확립된 피질 배양 프로토콜을 따라 다음과 같은 수정 사항을 따르십시오. 먼저 6웰 플레이트를 사용하고, 웰당 50만 개의 뉴런을 플레이트하고, 웰당 2.5ml의 부착 매체를 사용합니다.플레이트를 4시간 동안 배양한 후 웰당 3.3ml의 유지 배지로 전환하고 성상세포의 과증식이 관찰되면 3-4개의 DIV에서 7.5마이크로몰의 AraC가 보충된 0.5ml의 유지 배지를 추가합니다. 5-6개의 DIV에서 각 microRNA에 대해 3개의 웰을 감염시켜 테스트합니다. 뉴런의 99% 이상을 감염시킬 수 있는 가장 낮은 감염량을 사용하십시오.바이러스를 뉴런에 직접 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 넣습니다. 17-18 DIVs에서 RNA 추출을 위해 뉴런을 용해합니다. 플레이트를 기울이고 유리 피펫을 사용하여 각 웰에서 모든 매체를 제거합니다.그런 다음 즉시 각 웰에 700마이크로리터의 용해 시약을 추가합니다. 잠시 혼합한 후 세포 용해물을 각 웰 밖으로 별도의 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 각 용해물에 140마이크로리터의 클로로포름을 추가합니다.튜브를 빠르게 뚜껑을 닫고 15초 동안 세게 흔들어 내용물을 유화시킵니다. 다음으로, 12, 000 번 G에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 그런 다음 RNA를 포함하는 상부 수성상을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.피펫 팁이 유기상에 닿지 않도록 하십시오. 수성상에 1.5 부피의 100 % 에탄올을 첨가하고 용액을 천천히 3 회 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 시판되는 키트를 사용하여 RNA를 정제하고 수율을 정량화합니다.샘플당 최소 3.5마이크로그램을 예상하십시오. 단백질과 유기 화합물에 대한 순도의 비율은 둘 다 1.9 이상이어야 합니다. 다음으로, 키트를 사용하여 250, 500 또는 1, 000 나노그램의 RNA를 역전사합니다.그런 다음 정량적 RTPCR에 의해 관심 내인성 유전자에 대한 knockdown efficiency를 정량화합니다. 최소 60%의 녹다운 효율을 목표로 합니다.이 프로토콜의 경우 A.Cetin and Company가 이전에 발표한 프로토콜에 따라 15일 전에 RAAV12를 뇌에 주입한 동물을 사용합니다. 뇌를 분리하고 진동과 가스를 주입한 얼음처럼 차가운 ACFF로 급성 뇌 절편을 만듭니다.관심 영역의 슬라이스를 수집하고 광유전학 프로브의 활성화를 피하기 위해 빛에 대한 노출을 최소화합니다. 동일한 ACFF에서 섭씨 30도에서 37분 동안 슬라이스를 회복시킵니다. 뇌 조각을 보관하기 위해 특별히 설계된 챔버를 사용하십시오.그런 다음 슬라이스를 실온으로 되돌려 6-8시간 동안 건강하게 유지합니다. 계속 진행하려면 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 분당 2밀리리터의 ACFF로 슈퍼퓨징합니다. 다음으로, 발현된 형광 리포터의 신호를 간략하게 확인하여 감염의 위치와 강도를 확인합니다.그런 다음 패치 전극에 세포 내 용액을 채웁니다. 이제 적외선 조명 아래에서 감염된 뉴런으로부터 시냅스 입력을 받는 뉴런에 대한 tight-seal 도매 구성을 얻습니다. 직렬 저항은 보상되지 않은 상태로 둘 수 있지만 일정하고 낮아야 합니다.예를 들어, CA3 피라미드 뉴런이 감염된 경우, CA1 영역의 근위부에서 내측에 있는 피라미드 뉴런을 패치합니다. 세포가 쭈글쭈글하거나 부풀어 오르기 시작하거나, 패치가 어려워지거나, 배치가 불안정한 경우, 선택한 슬라이스가 더 이상 기록할 수 있을 만큼 건강하지 않은 것입니다. 다음으로, 약리학을 사용하여 조사 중인 시냅스 전류를 분리합니다.예를 들어, 흥분성 시냅스 전달을 조사하는 것이 목표인 경우 욕조에 bicuculline을 추가하여 억제성 시냅스 전달을 차단하십시오. 그런 다음 감염된 뉴런의 소마타에 위치한 광섬유에 연결된 473나노미터의 청색 레이저를 사용하여 흥분성 시냅스후 전류와 같은 시냅스 전류를 유발합니다. 레이저를 뉴런의 축삭돌기에 직접 대지 마십시오.예를 들어, Shaffer 담보에 빛을 비추지 마십시오. 축삭돌기의 직접적인 탈분극은 바람직하지 않습니다. 그런 다음 자극 길이를 최소로 조정하여 광 펄스당 두 개 이상의 활동 전위를 유발할 가능성을 줄입니다.다음으로, 작지만 명확하게 감지할 수 있는 시냅스 전류를 유발하도록 레이저의 강도를 미세 조정합니다. 예를 들어, CA3와 CA1 피라미드 뉴런 사이의 흥분성 시냅스 전달의 경우 20-50 피코암프의 시냅스 전류를 유발하도록 레이저의 강도를 조정합니다. 실험이 끝나면 0.5마이크로몰에 테트로도톡신을 도포하여 나트륨 채널을 차단합니다.테트로도톡신에 대한 광학적으로 유발된 전류의 민감도는 그것들이 활동 전위에 의해 구동됨을 나타냅니다. 최소 3개의 서로 다른 동물로부터 주어진 상태에 대해 최소 8개의 뉴런이 패치될 때까지 데이터를 계속 수집합니다. 결과를 분석하는 데 필요한 최소 데이터입니다.기술된 방법을 사용하여, 시냅스전 P/Q-유형 전위-의존성 칼슘 채널의 대안적인 스플라이스 이소폼을 knockdown하였다. 이 채널은 CA3에서 CA1 흥분성 시냅스에서 단기 시냅스 가소성을 조절하는 것으로 생각됩니다. 동형-특이적 microRNA를 발현하는 4개의 서로 다른 구조체가 만들어졌습니다. 각각은 형광 단백질 Td-Tomato와 함께 초고속 채널 로돕신과 함께 발현되었습니다.첫째, 각 구조체는 동형 특이적 정량적 RTPCR을 사용하여 1차 랫트 신경 배양에서 충분한 녹다운 효율과 선택성을 갖는 것으로 확인되었습니다. 다음으로, 각 구조체를 P18 쥐의 해마에 주입했습니다. 궁극적으로, CA3 시냅스에서 CA1 시냅스로의 단기 시냅스 가소성에 대한 구조체의 효과는 473나노미터 빛의 짧은 펄스로 감염된 CA3 피라미드 뉴런을 자극하고 CA1 영역의 피라미드 뉴런에서 생성된 EPSC를 도매 구성으로 기록하여 조사되었습니다.서로 다른 스플라이스 이소형의 녹다운은 반대 방향의 쌍을 이루는 펄스 자극에 대한 반응에 영향을 미쳤습니다. A 동형의 넉다운(Knockdown)은 쌍을 이룬 펄스 촉진을 촉진했습니다. B 동형의 넉다운은 그것을 폐지했습니다. RNA 간섭과 광유전학을 결합하면 시냅스 생리학 분야의 연구를 통해 시냅스 이전 단백질이 온전한 회로에서 단기 시냅스 가소성을 조절하는 방법을 탐구할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 RNA 간섭에 대해 microRNA를 검증하는 방법과 이를 광유전학과 결합하여 급성 뇌 절편에서 시냅스 전달을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

combining-optogenetics-with-artificial-micrornas-to-characterize

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐 해마 뇌 절편에서 흥분성 시냅스 전류의 microRNA 매개 억제를 보여줍니다. CA3 뉴런은 형광 리포터, 광 활성화 막 채널 및 전위의존성 칼슘 채널의 발현을 하향 조절하는 microRNA를 발현하기 위한 구조를 품고 있는 재조합 바이러스 벡터에 감염되었습니다. 기록 챔버에 슬라이스를 배치하고 기록 피펫으로 CA1 뉴런을 패치하면 광 펄스를 사용하여 광 활성화 채널을 자극하여 이온 유입을 일으키고 활동 전위를 생성했습니다. CA3 뉴런에 전위의존성 칼슘 채널이 없으면 신경전달물질 방출이 억제되어 시냅스로 연결된 CA1 뉴런에서 흥분성 시냅스후 전류가 억제됩니다.

마우스 해마 절편에서 흥분성 시냅스후 전류의 MicroRNA 매개 억제

마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수...

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

배우세요 인공 microRNA와 옵토제네틱스를 결합하여 완전한 신경 회로 내에서 유전자 최저 효과가 있는 시냅스 전 기능을 특성화하는 방법을. 이 기술은 시냅스 생리학 연구에 활용됩니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

더 많은 동영상 탐색