연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

인공 microRNA 매개 RNA 간섭을 광유전학과 결합하는 전반적인 목표는 온전한 신경 회로 내에서 시냅스전 기능에 대한 유전자 녹다운의 영향을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 온전한 뇌 회로에서 시냅스전 단백질의 생리학적 역할을 다루는 것과 같은 시냅스 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조사 중인 시냅스전 단백질의 발현이 감소된 뉴런에서 시냅스 전달을 선택적으로 모니터링할 수 있다는 것입니다.

또한, 우리는 이 방법을 사용하여 급성 뇌 절편에서 시냅스전 기능을 조사했습니다. 또한 생체 내에서 신경 세포의 보안을 조작하고 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 대학원생인 Carmela Vitale입니다.

microRNA를 설계하고 microRNA와 광유전학적 프로브를 발현하기 위한 재조합 벡터를 구축한 후, 관심 뇌 영역에서 1차 신경 세포 배양을 준비합니다. 이를 위해 L.A.Cingolani and Company의 확립된 피질 배양 프로토콜을 따라 다음과 같은 수정 사항을 따르십시오. 먼저 6웰 플레이트를 사용하고, 웰당 50만 개의 뉴런을 플레이트하고, 웰당 2.5ml의 부착 매체를 사용합니다.

플레이트를 4시간 동안 배양한 후 웰당 3.3ml의 유지 배지로 전환하고 성상세포의 과증식이 관찰되면 3-4개의 DIV에서 7.5마이크로몰의 AraC가 보충된 0.5ml의 유지 배지를 추가합니다. 5-6개의 DIV에서 각 microRNA에 대해 3개의 웰을 감염시켜 테스트합니다. 뉴런의 99% 이상을 감염시킬 수 있는 가장 낮은 감염량을 사용하십시오.

바이러스를 뉴런에 직접 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 넣습니다. 17-18 DIVs에서 RNA 추출을 위해 뉴런을 용해합니다. 플레이트를 기울이고 유리 피펫을 사용하여 각 웰에서 모든 매체를 제거합니다.

그런 다음 즉시 각 웰에 700마이크로리터의 용해 시약을 추가합니다. 잠시 혼합한 후 세포 용해물을 각 웰 밖으로 별도의 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 각 용해물에 140마이크로리터의 클로로포름을 추가합니다.

튜브를 빠르게 뚜껑을 닫고 15초 동안 세게 흔들어 내용물을 유화시킵니다. 다음으로, 12, 000 번 G에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 그런 다음 RNA를 포함하는 상부 수성상을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

피펫 팁이 유기상에 닿지 않도록 하십시오. 수성상에 1.5 부피의 100 % 에탄올을 첨가하고 용액을 천천히 3 회 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 시판되는 키트를 사용하여 RNA를 정제하고 수율을 정량화합니다.

샘플당 최소 3.5마이크로그램을 예상하십시오. 단백질과 유기 화합물에 대한 순도의 비율은 둘 다 1.9 이상이어야 합니다. 다음으로, 키트를 사용하여 250, 500 또는 1, 000 나노그램의 RNA를 역전사합니다.

그런 다음 정량적 RTPCR에 의해 관심 내인성 유전자에 대한 knockdown efficiency를 정량화합니다. 최소 60%의 녹다운 효율을 목표로 합니다.이 프로토콜의 경우 A.Cetin and Company가 이전에 발표한 프로토콜에 따라 15일 전에 RAAV12를 뇌에 주입한 동물을 사용합니다. 뇌를 분리하고 진동과 가스를 주입한 얼음처럼 차가운 ACFF로 급성 뇌 절편을 만듭니다.

관심 영역의 슬라이스를 수집하고 광유전학 프로브의 활성화를 피하기 위해 빛에 대한 노출을 최소화합니다. 동일한 ACFF에서 섭씨 30도에서 37분 동안 슬라이스를 회복시킵니다. 뇌 조각을 보관하기 위해 특별히 설계된 챔버를 사용하십시오.

그런 다음 슬라이스를 실온으로 되돌려 6-8시간 동안 건강하게 유지합니다. 계속 진행하려면 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 분당 2밀리리터의 ACFF로 슈퍼퓨징합니다. 다음으로, 발현된 형광 리포터의 신호를 간략하게 확인하여 감염의 위치와 강도를 확인합니다.

그런 다음 패치 전극에 세포 내 용액을 채웁니다. 이제 적외선 조명 아래에서 감염된 뉴런으로부터 시냅스 입력을 받는 뉴런에 대한 tight-seal 도매 구성을 얻습니다. 직렬 저항은 보상되지 않은 상태로 둘 수 있지만 일정하고 낮아야 합니다.

예를 들어, CA3 피라미드 뉴런이 감염된 경우, CA1 영역의 근위부에서 내측에 있는 피라미드 뉴런을 패치합니다. 세포가 쭈글쭈글하거나 부풀어 오르기 시작하거나, 패치가 어려워지거나, 배치가 불안정한 경우, 선택한 슬라이스가 더 이상 기록할 수 있을 만큼 건강하지 않은 것입니다. 다음으로, 약리학을 사용하여 조사 중인 시냅스 전류를 분리합니다.

예를 들어, 흥분성 시냅스 전달을 조사하는 것이 목표인 경우 욕조에 bicuculline을 추가하여 억제성 시냅스 전달을 차단하십시오. 그런 다음 감염된 뉴런의 소마타에 위치한 광섬유에 연결된 473나노미터의 청색 레이저를 사용하여 흥분성 시냅스후 전류와 같은 시냅스 전류를 유발합니다. 레이저를 뉴런의 축삭돌기에 직접 대지 마십시오.

예를 들어, Shaffer 담보에 빛을 비추지 마십시오. 축삭돌기의 직접적인 탈분극은 바람직하지 않습니다. 그런 다음 자극 길이를 최소로 조정하여 광 펄스당 두 개 이상의 활동 전위를 유발할 가능성을 줄입니다.

다음으로, 작지만 명확하게 감지할 수 있는 시냅스 전류를 유발하도록 레이저의 강도를 미세 조정합니다. 예를 들어, CA3와 CA1 피라미드 뉴런 사이의 흥분성 시냅스 전달의 경우 20-50 피코암프의 시냅스 전류를 유발하도록 레이저의 강도를 조정합니다. 실험이 끝나면 0.5마이크로몰에 테트로도톡신을 도포하여 나트륨 채널을 차단합니다.

테트로도톡신에 대한 광학적으로 유발된 전류의 민감도는 그것들이 활동 전위에 의해 구동됨을 나타냅니다. 최소 3개의 서로 다른 동물로부터 주어진 상태에 대해 최소 8개의 뉴런이 패치될 때까지 데이터를 계속 수집합니다. 결과를 분석하는 데 필요한 최소 데이터입니다.

기술된 방법을 사용하여, 시냅스전 P/Q-유형 전위-의존성 칼슘 채널의 대안적인 스플라이스 이소폼을 knockdown하였다. 이 채널은 CA3에서 CA1 흥분성 시냅스에서 단기 시냅스 가소성을 조절하는 것으로 생각됩니다. 동형-특이적 microRNA를 발현하는 4개의 서로 다른 구조체가 만들어졌습니다. 각각은 형광 단백질 Td-Tomato와 함께 초고속 채널 로돕신과 함께 발현되었습니다.

첫째, 각 구조체는 동형 특이적 정량적 RTPCR을 사용하여 1차 랫트 신경 배양에서 충분한 녹다운 효율과 선택성을 갖는 것으로 확인되었습니다. 다음으로, 각 구조체를 P18 쥐의 해마에 주입했습니다. 궁극적으로, CA3 시냅스에서 CA1 시냅스로의 단기 시냅스 가소성에 대한 구조체의 효과는 473나노미터 빛의 짧은 펄스로 감염된 CA3 피라미드 뉴런을 자극하고 CA1 영역의 피라미드 뉴런에서 생성된 EPSC를 도매 구성으로 기록하여 조사되었습니다.

서로 다른 스플라이스 이소형의 녹다운은 반대 방향의 쌍을 이루는 펄스 자극에 대한 반응에 영향을 미쳤습니다. A 동형의 넉다운(Knockdown)은 쌍을 이룬 펄스 촉진을 촉진했습니다. B 동형의 넉다운은 그것을 폐지했습니다. RNA 간섭과 광유전학을 결합하면 시냅스 생리학 분야의 연구를 통해 시냅스 이전 단백질이 온전한 회로에서 단기 시냅스 가소성을 조절하는 방법을 탐구할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 RNA 간섭에 대해 microRNA를 검증하는 방법과 이를 광유전학과 결합하여 급성 뇌 절편에서 시냅스 전달을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.