Name: 인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 학습하세요 인간 섬 자가항체를 전기화학발광 분석으로 검출하는 방법을 통해 제1형 당뇨병을 조기 예측하고 진단하는 기술을. 이 비방사성 고감도 기법은 다른 자가면역 질환 연구에도 적용 가능합니다.

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이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 DK32083, JDRF 그랜트 2-SRA-2015-51-Q-R를 부여.

1. 버퍼 준비
<ol><li>버퍼 (2 x PBS, pH 7.9) 라벨: 이온된 (DD) 증류수의 400 Ml에서 100 mL 10 x PBS의 추가, NaOH와 7.9에 pH를 조정.</li>
	<li>Biotin의 3 m m: 버퍼 라벨의 588 µ L에서 1mg Biotin의 해산.</li>
	<li>3mm Sulfo 태그: 버퍼 라벨의 50 µ L에 Sulfo 태그의 해산 150 nmol.</li>
	<li>항 원 버퍼 (5 %BSA): 1 x PBS의 500 Ml, 25 g 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 추가.</li>
	<li>0.5 M 초 산 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>Tris HCl 버퍼 pH 9.0의 1.0 M: 준비 1 M Tris-HCl 9.0 HCl로 pH를 조정 하 고, 버퍼.</li>
	<li>코팅 버퍼 (3% 차단 A): 1 x PBS의 500 Ml, 추가 차단 A. 15 g</li>
	<li>세척 버퍼 (0.05% 트윈 20, PBST): 1 x PBS의 5000 Ml에서 2.5 mL 트윈 20의 추가.</li>
	<li>읽기 버퍼 (계면 활성 제와 읽기 버퍼 T x 2): DD 물 500 Ml, 500 mL 계면 활성 제 (자료 테이블)와 읽기 버퍼 T x 4의 추가.</li>
	<li>-20 ° C 냉장고에 Biotin과 Sulfo 태그를 저장 합니다. 참고: 모두 Biotin과 Sulfo 태그 솔루션 항상 갓 준비 해야 레이블 프로시저의 바로 전에.</li>
</ol>2. 인간의 섬 Autoantigen Biotin과 Sulfo 태그 라벨
참고: 높은 농도의 항 원, 이들 mg/mL, 보다 효율적인 라벨 반응 좋습니다.
<ol><li>Biotin과 Sulfo 태그에 대 한 인간의 섬 autoantigen의 어 금 니 비율을 결정 합니다.<ol>
<li>분자 무게에 의해 항 원 무게를 분할 하 여 항 원 어 금 니 번호를 가져올.</li>
		<li>작은 분자량 (≤ 10 kd)와 항 원에 대 한 1: 5의 어 금 니 비율을 사용 하 여 더 큰 분자량과 항 원에 대 한 1시 20분의 어 금 니 비율 (> 50 kd).</li>
		<li>농도 의해 몰 수를 나누어 Biotin 또는 Sulfo 태그에 대 한 볼륨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인간의 섬 autoantigen Biotin 또는 Sulfo 태그와 어 금 니 비율 1: 5의 믹스. 참고: ph 7.9 크기 조정 스핀을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 2로 교환 한다 tris 또는 글리신 버퍼 시스템 단백질 열.</li>
	<li>Biotin과 Sulfo 태그 빛에 민감한 때문에, 알루미늄 호 일로 반응 튜브 커버. 상 온 (RT) 1 시간에 대 한 반응을 품 어.</li>
	<li>부 화, 동안 프라임 스핀 열 PBS 버퍼 x 디스 2 열에 3 번. 원심 2 분 1000 x g에서 솔루션 각 시간. 참고: 현재 라벨 반응, 브리징, 통해 여전히 발생 하 고 중지 해야 합니다.</li>
	<li>레이블이 지정 된 인간의 섬 autoantigen 정화 하 여 라벨 반응을 중지 합니다. 정화, 스핀 열 통해 autoantigen를 통과 하 고 2 분 1000 x g 열 원심.</li>
	<li>항 원 단백질 및 최종 볼륨을 사용 하 여 레이블이 지정 된 항 원 농도 (µ g / µ L)를 결정 합니다. 참고: 약, 있을 것입니다 분류 항 원의 90-95% 보존 후 모든 스핀 열 전달.</li>
	<li>약-80 ° c.에 레이블이 지정 된 항 원 및 저장소 분류 항 수</li>
</ol>3. 정의 최고의 농도 및 비율 두 분류 항 원에 대 한 분석 결과 (검사기 보드 분석 결과)에 대 한
<ol><li>2 혈 청 샘플, 높은 긍정 및 1 네거티브, 각 200 µ L의 총 볼륨 하나를 준비 합니다.</li>
	<li>혈 청의 aliquot 4 µ L까지 최종 볼륨은 잘 PCR 96 잘 접시 당 20 µ L 1 x PBS를 추가. 그림 2A와 같이 높은 긍정적인 샘플 및 부정적인 샘플에 대 한 나머지 절반에 대 한 접시의 절반을 사용 합니다.</li>
	<li>10 µ L 비타민 b 복합체의 Sulfo 태그에 표시 된 그림 2A로 두 다르게 분류 항 원에 대 한 항 원 및 행위 직렬 희석 분류의 10 µ L를 추가 합니다. 한 분류 항에 대 한 수평 직렬 희석 및 다른 분류 항 원에 대 한 수직 직렬 희석 실행 합니다.</li>
	<li>5.3 9.1에서 설명 하는 분석 결과 단계의 나머지 부분을 계속.</li>
	<li>그림 2B에 부정적인 샘플에서 해당 신호 각각에 대 한 높은 긍정적인 샘플에서 신호의 비율을 계산 합니다.</li>
	<li>Biotin에 최고의 농도 식별 하 고 Sulfo 태그 최고 또는 네거티브 긍정적인의 높은 비율에 가까운 지점을 선택 하 여 항 원 표시. 비율을 식별 하는 부정적인 샘플에서 낮은 배경 신호를 고려 하십시오. 참고: 분석 결과 하루 1 단계 6 단계 4 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>4. 준비 Biotin/Sulfo-태그 항 원 표시의 정확한 농도 사용 하 여 항 원 버퍼
<ol><li>검사기 보드 분석 결과에 따라 각 항의 합리적인 농도 선택 합니다.</li>
	<li>3 mL 접시, 합리적인 Biotin/Sulfo-태그 분류 항 버퍼에 대 한 항 원 농도 사용 하 여 당 항 원 솔루션의 준비.</li>
</ol>5. 분류 항 원과 혈 청 샘플을 품 어
참고:이 섹션에서 두 프로토콜, 혈 청 산 성 치료를 하지 않고과 혈 청 산 치료 하나 있습니다. IAA 분석 결과 제외한 모든 섬 autoantibody 분석 IAA 분석 결과 이러한 단계를 생략 하 고 단계 5.6 5.9에서에서 혈 청 산 치료 프로토콜을 사용 하 여 단계 5.1-5.5에서에서 산 치료 혈 청 하지 않고 일반 프로토콜을 사용 합니다.
<ol><li>혈 청의 aliquot 4 µ L까지 최종 볼륨은 잘 PCR 96 잘 접시 당 20 µ L 1 x PBS를 추가.</li>
	<li>잘 당 분류 항 원 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>빛을 피하기 위해 호 일 씰링과 PCR 플레이트 커버.</li>
	<li>2 시간에 대 한 실시간에 (저속) 통에 접시를 넣어.</li>
	<li>4 ° C 냉장고에 접시를 넣고 품 어 하룻밤 (18-24 h). 참고: 5.9 5.6에서 단계의 다음 프로토콜은만 위해 IAA 분석 결과 및 다른 autoantibody 분석 실험이이 단계를 건너뜁니다.</li>
	<li>혼합 15 µ L의 혈 청 0.5 M 초 산 각 혈 청 샘플의 18 µ L로. 45 분 RT에이 혼합물을 품 어.</li>
	<li>비타민 b 복합체의 Sulfo-태그 레이블이 검사기 보드 분석 결과에 따라 항 원 antigen 버퍼를 사용 하 여 합리적인 농도와 항 원 솔루션을 준비 합니다. 각 잘, Biotin Sulfo 태그를 포함 하는 항 원 버퍼의 aliquot 35 µ L 분류 항 원, 새로운 PCR 격판덮개로.</li>
	<li>45 분 인큐베이션 (5.6 단계) 단계를 완료 하기 전에 항 원 접시 (단계 5.6)에 각 측에 1 M Tris 버퍼 pH 9.0의 8.3 µ L를 추가 합니다. 그것은 Tris 버퍼와 항 원 간의 혼합을 제한 해야 합니다. 즉시 단계 5.6, 각 우물에서에서 산 처리는 혈 청의 25 µ L를 전송 하 고 솔루션을 선동. 빛을 피하기 위해 호 일 씰링과 PCR 플레이트 커버.</li>
	<li>2 헤 4 ℃ 냉장고에 접시를 넣어에 대 한 실시간에 셰이 커 (저속)에 접시를 넣어 고 품 어 접시 하룻밤 (18-24 h).</li>
</ol>6. 준비 Streptavidin 플레이트
<ol><li>4 ℃ 냉장고에서 streptavidin 접시 하 고 실시간에와 서 접시를 허용</li>
	<li>Streptavidin 접시 RT에 일단 각 잘을 3% 차단 A의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>커버 호 일 씰링과 PCR 접시.</li>
	<li>4 ℃ 냉장고에서 플레이트를 밤새 품 어. 참고: 분석 결과 주 2 단계 9 단계 7 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>7. 전송 혈 청/항 Streptavidin 플레이트에 잠복
<ol><li>다음 날, 냉장고에서 streptavidin 접시를 꺼내 고 접시에서 버퍼를 삭제. 테이블에 몇 가지 마른 종이 수건 밖으로 설정 하 고 우물 안에 없다 더 많은 버퍼 때까지 접시를 거꾸로 누릅니다.</li>
	<li>잘 당 PBST의 150 µ L로 빈 streptavidin 접시를 총 세 세척 접시에서 PBST을 삭제.</li>
	<li>전송 30 µ L의 혈 청/항 streptavidin 접시에 잘 당 잠복.</li>
	<li>빛을 피하기 위해 호 일 접시 커버. 1 시간에 대 한 실시간에 낮은 설정에서 접시, 흔들.</li>
</ol>8. 세척 접시 및 읽기 버퍼를 추가
<ol><li>삭제는 접시에서 잠복. 잘 당 PBST의 150 µ L을 추가 하 고 총 세 세척 접시에서 PBST을 삭제.</li>
	<li>세척, 후 읽기 버퍼의 당 150 µ L를 추가 합니다. 참고:이 플레이트 판독기 컴퓨터에 격판덮개를 읽는 방법에 영향을 미칠 것입니다 때문에 솔루션에 기포를 방지 하기 위해 중요 하다.</li>
</ol>9. 접시 읽기 및 데이터 분석
<ol><li>플레이트 리더 기계에 접시를 계산 합니다. 항 체 값 (CPS) 초당 수로 표시 됩니다.</li>
	<li>상대 인덱스 플레이트 리더 기계 로부터 받은 항 체 수준을 전달 합니다. 다음 방정식에서 인덱스를 계산. 값을 인덱스 [CPS (샘플)-CPS (부정적인 제어)] = / [CPS (긍정적인 제어)-CPS (부정적인 제어)].</li>
	<li>긍정적이 고 부정적인 항 체 결과 100 건강 한 제어 과목 (어떤 알려진된 자가 면역 질환과 당뇨병의 가족 역사 없이 없이 비 당뇨병 개인) 99th 백분위 수에 따라 양성, 정의 대 한 커트 오프를 사용 하 여 식별 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+presymptomatic+type+1+diabetes%3A+a+scientific+statement+of+JDRF%2C+the+Endocrine+Society%2C+and+the+American+Diabetes+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li>
<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li>
<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(13)60591-7/abstract">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li>
<li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25665818">TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY).</a> Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).</li>
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<li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li>
<li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural history of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).</li>
<li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+of+islet+autoantibody+appearance+and+mean+levels+of+insulin%2C+but+not+GAD+or+IA-2+autoantibodies%2C+predict+age+of+diagnosis+of+type+1+diabetes%3A+diabetes+autoimmunity+study+in+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young.</a> Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).</li>
<li>Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+high-affinity+immune+responses+to+%28pro%29insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li>
<li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinsulin%2Finsulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li>
<li>Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk%3A+nonradioactive+bivalent+proinsulin%2Finsulin+autoantibody+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li>
<li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li>
<li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+%28ECL%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li>
<li>Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+PEG-hGH+detection+supporting+pharmacokinetic+evaluation+in+growth+hormone+deficient+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).</li>
<li>Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+inhibition+of+drug+target+interference+in+immunogenicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays.</a> J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).</li>
<li>Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+%22subspecificity%22+in+type+1+diabetes%3A+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li>
<li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+autoimmune+disease+found+in+33%25+of+patients+at+type+1+diabetes+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li>
<li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Neth+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

섬 신경은 타입-1 당뇨병의 면역에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 biomarkers 현재. 그들은 섬 특정 자가 면역의 개시를 표시 하 고 명백한 질병 위험을 결정 합니다. ECL 분석 결과 섬 신경에 대 한 광범위 하 게 여러 국가 및 국제 타입-1 당뇨병 임상 시험에서 유효성이 검증 되었습니다. 분석 결과 보여주었다 증가 감도 특이성 전류 '골드'에 비해 표준 RBAs. ECL 분석 결과 차별 높은 선호도와 위험이 높은 섬 자가 RBA에 의해 발생 하는 낮은 위험, 낮은 선호도 신호에서 더 높은 질병 특이성에 대 한 그것의 우수한 장점을 보이고 있다. 이 과목만 단일 섬 autoantibody 긍정적인 사람에 특히 주의 하 고 제 1 형 당뇨병에 결코 진행. 이러한 낮은 친 화력 신경 동안 손실 될 것을 발견 했다의 대부분 테스트 년 개월 이내 '과도 긍정적인.'로 서 행동 후속 이전 가설, 이러한 낮은 선호도 '단일' 자가 가능성이 cross-reactive 분자 면역에서 결과. 높은 선호도, 동안 높은 위험 섬 자가 스스로 섬 항 원 가진 면역에서 유래 했다. 또한, ECL 분석 년 출생에서 임상 당뇨병을 미행 했다 사전 당뇨병을 가진 아이 들에 의해 현재 표준 라디오 바인딩 분석 실험 (RBA)에서 '혈'의 시간을 antedate 수 설명 했다. 지속적인 국제 임상 시험는 환경 결정 요인의 당뇨병에는 영 (테 디), 타이밍 및 첫 번째 섬 autoantibody 섬의 처음을 표시 하는 ' 혈'의 모양을 정확 하 게 정확한 감지에 따라 달라 집니다. 면역 및 환경 트리거를 식별. ECL 분석 결과에 감도 증가 대 한 가능한 이유는 그 분석 결과 캡처 모든 면역 글로불린 클래스: IgG, IgM, IgA, ige의 보다는 오히려 전통적인 RBA 또는 ELISA IgG의 탐지에만 의존 하는.
ECL 분석 실험, IAA, 같은 일부 특정 신경에 대 한 자가 항 원에의 바인딩 정상적인 인간 혈 청에 있는 일부 구성 요소에 의해 저해 될 것으로 보인다. 제거 하거나이 저해를 해제, 혈 청 샘플의 산 성 치료 전에 혈 청은 항 원과 인 큐베이 팅 할 필요 했다. [그림 5]에 표시 된 ECL IAA 분석 결과로 마우스 인슐린 단일 클론 항 체와 항 원 가진 환자의 혈 청 신경의 바인딩 활동은 크게 향상 되었습니다. 항 체 분석 실험에서 사용 하는 혈 청 샘플의 산성화 끊을 기존 바운드 단지에 일반적으로 적용 됩니다. IAA 신호는 인간의 혈 청 샘플에 저해 방법과 혈 청의 산성화에 의해 발표 뒤에 메커니즘은 알려져 있지, 하지만이 방법은 다른 ECL 기반 분석14,15에 사용 되었습니다.
몇 가지 경우, 분자 라벨, 비오 틴 또는 항 원 단백질 분자의 라벨 positionsinside Sulfo 태그에는, 또는 항 체 바인딩을 항 체 바인딩 활동을 방해할 수 있는 주요 epitopes 가깝습니다. 이 분석 결과 감도 감소 시킬 것 이다 하 고 완전히 분석 결과 아래로 찢을 수 있다. 루틴 절차를 라벨에 대 한 극대화 또는 채도 모든 가능한 라벨 위치 라벨 용량을 극대화 하 여 최대 활동 또는 레이블이 분자 당 신호를 생성 하기 위해 각 항 원 단백질 분자에 대 한 원한다. 불포화 라벨 (Biotin과 Sulfo 태그) 분자 항 원 단백질에 항 체 바인딩 활동의 중단에 대 한 가능한 이유 되는 항 원에 라벨 라벨의 어 금 니 비율을 감소 시켜 수행 되어야 한다. 주요 epitopes 예약 더 수 있으며 항 체 바인딩 작업의 중단 불포화 라벨 전략을 사용 하 여 대부분의 경우에서 출시 될 수 있습니다.
각 분석 결과 내부 표준 높은 긍정 및 부정적인 제어 알 수 없는 샘플의 인덱스 계산에 포함 되어야 합니다. 일반 컨트롤의 분석 결과 상한 근처 낮은 긍정적인 통제 분석 결과 감도의 모니터링에 대 한 포함 하도록 중요 하다. 실험실 장기 사용에 대 한 표준 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 충분 한 aliquots를 유지 해야 하 고 모든 aliquots는-20 ° c.에 저장 되어야 한다 분석 결과 품질 보증, 각 샘플에 대 한 중복에서 분석 실험을 실행 해야 합니다 및 별도 분석 결과에 샘플을 반복 하 여 모든 긍정적인 결과 확인 해야 합니다. 세 번째 분석 결과 두 번째 확인 분석 결과 첫 번째 분석 결과 동의 하는 2 개의 분석 실험의 결과와 동의 하지 않는 경우 필요 (예:., +, + 또는-,-), 긍정적 이거나 부정적인 결과의 최종 결정 될 것입니다.
플랫폼으로 단일 ECL 분석 실험에 대 한 설정, 다중화 된 분석 결과 이들에서 시 확장 수 있습니다. 그것은 동시에 최대 10 다른 신경에 혈 청의 작은 금액으로 한 단일 잘 확인할 수 있습니다. 현재, 4 개의 섬 자가 IAA를 포함 하 여, 4 월, IA-2A, 및 ZnT8A가 T1D와 일반 인구 환자의 두 친척에서 T1D 진행의 위험 예측에 대 한 중요성. 현재 단일 autoantibody 측정을 사용 하 여 이러한 4 자가 검사에 대 한 활용 방법을 힘들고 비효율적이 고, 특히 대규모 인구 심사에 대 한 있습니다. 중요 한 것은, 최대 T1D 환자의 40% 있다 추가 면역 상태16,,1718. 불행히도, 이러한 조건에 대 한 화면을 간단 하 고 저렴 한 도구가입니다. 멀티플렉스 ECL 분석 결과 오직 하나, 4 현재 주요 섬 autoantibody 분석 실험 결합 가능 하지만 또한 더욱 다른 관련 자가 면역 질환에서 더 많은 autoantibody 분석을 결합 하 여 수 있습니다. 이 효율적으로 대규모 인구에서 동시에 여러 자가 면역 질환에 대 한 심사는 높은 처리량을 가능 하 게. 멀티플렉스 ECL 분석 결과에서 [그림 6]와 같이 액체 단계에서 형성 된 각 항 체 항 원 복합물 것 이다 수 제 지 같은 특정 링커 소스 자리에 잘. 플레이트 리더 기계에 신호 수신기는 관광 명소의 10 다른 소스 로부터 신호를 인식할 수 있습니다. 그러나, 매우 높은 신호 명소 높은 분석 결과 배경 생성 하 고 크로스 토크를 통해 인접 장소에 간섭을 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 각 autoantibody 분석 결과 대 한 상한 신호 미만 20000 카운트에 제한 되어야 합니다. 우리의 경험에서는, 더 낮은 배경 가진 자가 높은 카운트 자리 지도 설계 하는 데 그 장소에서 상대적으로 멀리 배치 되어야 합니다. 장기 연구 멀티플렉스 ECL 분석 실험을 사용 하 여, 같은 링커 같은 autoantibody 분석 결과 대 한 분석 결과 일관성 유지를 사용할 수 것이 좋습니다.

최근 준비 분류 체계는 환자에서 T1D의 초기 단계의 진단을 지원 하기 위해 만들어졌습니다. 인간의 섬 신경의 정확한 탐지 식별에 중요 한 역할 그리고 presymptomatic 준비 제 1 형 당뇨병, 섬 자가 존재 β-세포 면역의 존재를 나타냅니다. 당뇨병에 징후 질병에 β-세포 면역의 초기 발생에서 영향을 미치는 환자 수와 섬 신경의 종류와 관련 된 속도가 변수2,3.
Autoantibody 혈, titer, 그리고 섬 신경의 선호도의 시대 증상 타입-1 당뇨병4,5,6,7,8 진행의 속도 영향을 미칠 수 있습니다. ,910. 최근에, 개발된 ECL 분석 실험, 광범위 하 게 검증 된 감도 증가 증명 하고있다 그리고 더 많은 질병-특정10,11,,1213. 이 분석 실험 강화 섬 신경의 이전 검색을 통해 당뇨병 위험의 준비와 예측. 그들은 더 정확 하 게 섬 autoimmunity의 개시를 표시 하 고 당뇨병 관련이 없는 낮은 친 화력과 낮은 위험 신호를 무시 한다.
ECL 분석 결과, 혈 청에 있는 자가 있으면, 액체 단계에서 Sulfo 태그 활용 된 항 원 biotinylated 캡처 항 원에 다리. 브리징, 후 Biotin 링커 단단한 단계에 고 ECL 통해 Sulfo 태그 streptavidin 입히는 격판덮개 (그림 1)에 의해 감지.
이 리뷰에서 인간의 섬 자가 함께 단일 항 체 ECL 분석을 주로 활용 하 고 있습니다. 간단히, 다중화 항 체 분석 실험 단일 ECL 분석에 따라 논의 될 것입니다. 멀티플렉스 분석 결과 15 µ L의 혈 청을 사용 하 여 잘, 10, 하나의 내 신경까지 여러를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 높은 처리량 분석 결과 화면, 동시에, 일반 인구에서 여러 관련 자가 면역 질환에 대 한 여러 신경에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인간 재조합 프로인슐린 단백질(PINS)</td><td>AmideBio</td><td>인간 프로인슐린, Rec</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 GAD65 단백질</td><td>Diamyd</td><td>rhGAD65</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 IA-2 단백질</td><td>Creative BioMart</td><td>IA2</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR 플레이트&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 코팅 플레이트</td><td>MSD</td><td>L15SA</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 사이징 스핀 컬럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td></td></tr><tr><td>Twen-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link 비오틴</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-tag</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>차단제 A</td><td>MSD</td><td>R93AA-1</td><td></td></tr><tr>계면활성제 <td>MSD</td><td>R92TC-1</td><td></td>EZ-Link가<td>있는 4x 읽기 버퍼 T</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotin</td><td>ThermoScience</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>96웰 중합효소 연쇄 반응(PCR) 플레이트</td><td>Fisher 브랜드</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96웰 스트렙타비딘 플레이트</td><td>MSD GOLD</td><td>L 15SA-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼</td><td>ThermoScience</td><td>PL208984</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 셰이커</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>MSD</td><td>QuickPlex SQ120</td><td></td></tr><tr><td>회전식 버킷이 있는 탁상용 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 섬 신경에 대 한 electrochemiluminescence 분석 실험

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

1 형 당뇨병과 관련 된 섬 자가 정확히 파악 (T1D) 리드 프로젝트 및 일반 인구에 있는이 질병을 억제 하는 방법. 새로운 ECL 분석 결과 높은 감도와 특이성 현재 '골드' 표준 라디오 바인딩 분석 결과 (RBA) 보다 섬 신경에 대 한 nonradioactive 액체 단계 분석 결과가 이다. ECL 분석 보다 정확 하 게 RBAs, 그리고 기존의 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA에 생성 된 낮은 위험, 낮은 친 화력 신경에서 위험, 높은 선호도 자가 구분 하 여 presymptomatic T1D의 발병을 정의할 수 있습니다. ). ECL 분석 결과이에 사용 되는 항 원 단백질 Sulfo 태그와 Biotin, 각각 표시 됩니다. 특정 항 원 단백질을 사용 하 여 각 ECL autoantibody 분석 결과 실험실 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 최적화 단계를 필요 합니다. 이 단계는 혈 청 산 성 트리 트 먼 트, 농도, 및 Sulfo 태그와 Biotin 표시 된 두 개의 서로 다른 항 원의 비율에 대 한 요구 사항을 결정 하는 데 특히 중요 합니다. 분석 결과 수행 하기 위해 혈 청 샘플은 혼합 Sulfo 태그 활용 및 biotinylated 캡처 항 원 단백질에 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS), 5%를 포함 하 소 혈 청 알 부 민 (BSA). 나중에, 예제는 인 큐베이 팅 하룻밤 4 ° c.에 같은 날 streptavidin 입히는 격판덮개 차단기 버퍼와 함께 준비 되 고 하룻밤에 4 ° c. 인 큐베이 팅 둘째 날에는 streptavidin 접시를 세척 하 고 접시에 혈 청 항 원 혼합물을 전송 합니다. 판 통에 접시를 놓고 낮은 속도로 그것을 설정 하 고 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어. 그 후, 접시를 다시 세척 하 고 리더 버퍼 추가 됩니다. 접시는 접시 리더 기계에 다음 계산 됩니다. 결과 내부의 양수와 음수를 제어 하는 표준 혈 청 샘플에서 생성 되는 인덱스를 통해 전달 됩니다.

그림 2 는 검사기 보드를 표시합니다. 그것은 Biotin의 그 250 ng/mL 및 250 ng/mL Sulfo 태그 분류 항은 분석 결과 배경, 그리고의 비율으로 높은 긍정적인 컨트롤 샘플, 부정적인 컨트롤 샘플에서 신호를 고려 하는 분석 결과에 사용 하는 가장 합리적인 농도의 표시 긍정 부정적인 신호. 을 최적화 된이 두 분류 항 원 농도 분석 결과 T1D와 건강 한 컨트롤 100 100 새롭게 진단된 된 환자에서 혈 청 샘플 수행 했다. 0.023의 인덱스 값은 양성의 분석 결과 컷오프로 정의 했다. 이 특성 (ROC) 곡선 그림 3A에서 운영 하는 수신기를 사용 하 여 건강 한 컨트롤에서 환자와 99% 특이성 85% 감도를 나타냅니다. 알 수 없는 샘플에 대 한 분석 결과 내부 표준 높은 반응, 낮은 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플 실시 됐다. CPS의 결과에 표시 됩니다 표 2A. 높고 낮은 긍정적인 컨트롤의 CPS 17903 [(19940+15866)/2 빨간색으로 강조 표시 됩니다 의미] 839 [(857+820)/2], 그리고 부정적인 컨트롤 168 [(170+165)/2 녹색으로 강조 표시 됩니다]. 알 수 없는 샘플에 대 한 인덱스 계산 "(CPS샘플-168)/(17903-168)." 표 2B 모든 샘플에 대 한 계산 된 인덱스 값을 보여 줍니다. 0.023는 또한 표 2A에 빨간색으로 작성 된 CPS 값에 해당 하는 빨간색으로 작성 하는 보다 큰 인덱스 값입니다. 이러한 값은 긍정적인 결과 보다 건강 한 제어 인구 99번째 백분위 수로 정의 됩니다. 표 2 c에서와 같이 분석 결과 높은 배경을 해야한다 불합리 한 항 원 농도 사용 하는 경우 긍정적인 항 체의 저급은 A2, A5, D1, 및 H4 테이블 2D에 회색으로 강조 표시 값 처럼 그리울 것 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> 그림 1 : 단일 ECL IAA 분석 결과 대가 판 캡처의 그림. 섬 autoantibody Sulfo 태그 활용 streptavidin 입히는 격판덮개에 단단한 단계에 있는 biotinylated 캡처 항 원에 항 원 혈 청 다리에. 플레이트 캡처 Sulfo 태그 활용된 항 원의 검출 ECL 통해 수행 됩니다. 이 그림에서 유, 수정 된 외. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> 그림 2 : 결정 분석 결과 양성의 컷오프가 ROC 곡선. 감도 85%에 해당 하는 특이성의 99번째 백분위 수 선정 되었다 고 0.023의 인덱스 값으로 표시 됩니다. 분석 결과의이 상한 100 건강 한 컨트롤에서 찍은. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> 그림 3 : ECL IAA 신호를 차단 하는 정상적인 인간 혈 청의 그림. A: 인슐린 단일 클론 항 체 (모 압)으로 ECL IAA 분석 실험에서 신호 과감 하 게 정상적인 인간 혈 청의 추가 의해 차단 되었습니다. 비교할 때 PBS에서 모 압, 인간의 혈 청은 산으로 대우 될 때 신호 복원 부분적으로 되었다. B: 4 환자 세라와 ECL IAA 분석 결과에서 신호 산 성 치료 크게 향상 했다. 이 그림에서 유, 수정 된 외. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> 그림 4 : 의 Mutiplex ECL 분석 결과 그림. 항 체 항 원 복합물은 특정 링커와 액체 단계에서 형성 된다. 특정 항 체-항 원-링커 단지는 잘 같은 특정 링커 관광 명소의 각 제 지. 플레이트 리더 기계 관광 명소의 다른 소스에서 신호를 구별할 수 이며 각각 10 다른 채널에 CPS 카운트를 제공 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> 표 1: 농도 및 Biotin의 비율을 결정 하는 검사기 보드 분석 결과 Sulfo 태그 표시 항. A: 원시 CPS 접시 및 다른 반쪽에 부정적인 혈 청의 절반에 높은 긍정적인 혈 청 검사기 보드 판에 대 한 건의. Biotinylated 항 원 농도 시리즈에서 가로로 희석 했다 고 Sulfo 태그 분류 항 원 농도 시리즈에서 수직으로 희석 되었다. B:는 CPS의 비율 값 부정적인 혈 청에서 그들의 해당 CPS의 각각에 대하여 높은 긍정적인 혈 청에서 계산 됩니다. 노란색 강조 표시 된 웰 스 대표 패널 b에서 네거티브 긍정적인의 최고의 비율 이 비율은 250 ng/mL Biotin에 해당 하며 250 ng/mL Sulfo 태그 표시 패널 A 부정적인 혈 청에 대 한 수락 가능 하 게 낮은 CPS 수 있는 항 원 농도. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> 표 2: 시험 결과의 분석. A: 원시 CPS 시험 접시에서 빨간색과 녹색으로 강조 표시 하는 표준 부정적인 컨트롤에서 강조 표시 표준 및 로우 긍정적인 컨트롤과 계산 합니다. 각 샘플 분석 결과에서 중복 되었다. B: 분석 결과 프로토콜에 설명 된 대로 인덱스 값 계산 했다. 0.023 보다 큰 모든 인덱스 값은 빨간색으로 강조 표시, 긍정적인 결과로 정의 했다. C: 원시 CPS는 불합리 한 항 원 농도 사용 된 샘플의 동일한 집합을 가진 시험 접시에서 계산 합니다. 이 높은 배경 귀착되 고 일반적으로 검색, 일부 낮은 반응 패널 B와 같이 패널 디에 회색으로 강조 하는 네거티브에 개조 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리는 인간의 섬 자가 electrochemiluminescence (ECL) 분석 실험을 사용 하 여 검색 하는 방법을 제시. 타입 1 당뇨병을 예측 하는 데 사용 되는 프로토콜 자가 다른 자가 면역 질환에 대 한 검색에 따라 확장할 수 있습니다.

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

이 전기화학발광 분석법의 전반적인 목표는 자가면역 제1형 당뇨병에서 높은 감도와 높은 특이도로 섬 아투항체를 검출하는 것입니다. 이 방법은 제1형 당뇨병 분야의 주요 질문, 예를 들어 섬 자가면역 시작 시간 및 제1형 당뇨병에 대한 고위험 예측과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 현재 표준 방사성 분석법에 비해 더 민감하고 질병 특이적이며 방사성이 없다는 것입니다.이 기술의 의미는 제1형 당뇨병을 예측하고 진단하는 데까지 확장되는데, 이는 이러한 섬 자가항체가 증상이 있는 임상 질병이 나타나기 몇 달에서 몇 년 전에 나타나기 때문입니다. 이 방법은 제1형 당뇨병의 원인에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 셀리악병에 대한 트랜스글루타미나제에 대한 자가항체, TPO에 대한 트랜스글루타미나제, 자가면역 갑상선 질환에 대한 티로글로불린 및 기타 여러 가지 자가면역 질환을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 우리는 이 기술이 고감도와 비방사능을 기반으로 한다는 것을 알았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.기존의 ELISA 방법은 모든 섬 자가항체 검출에 잘 작동하지 않습니다. 이 방법의 시각적 시연은 혈청산 치료를 통한 인슐린 자가항체 분석이 텍스트로 설명하기 어렵기 때문에 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Yong Gu입니다.먼저, 튜브에서 인간 섬 자가항원과 비오틴 또는 SULFO-TAG를 1-5몰 비율로 혼합합니다. 그리고 두 태그 모두 빛에 민감하기 때문에 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 그런 다음 실온에서 한 시간 동안 튜브를 배양합니다.한편, 배양이 진행될 때 스핀 컬럼을 2중 인산염 완충 식염수로 프라이밍합니다. 그런 다음, 1, 000배 중력에 컬럼을 매번 2분 동안 원심분리하십시오. 다음으로, 스핀 컬럼에서 자가항원 태그 혼합물을 1, 000배 중력에서 2분 동안 원심분리한다.그런 다음 표시된 항원을 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 다음으로, 항원 완충액에 대한 체커보드 분석을 기반으로 비오틴 SULFO-TAG 표지 항원의 합리적인 농도를 사용하여 96웰 플레이트당 3ml의 항원 용액을 준비합니다. 그런 다음 각 웰에 4마이크로리터의 혈청을 추가하고 1겹 인산염 완충 식염수로 최종 부피를 20마이크로리터로 조정합니다.그런 다음 각 웰에 20마이크로리터의 라벨이 부착된 항원 용액을 추가합니다. 그리고 밀봉 호일로 접시를 덮고 빛을 방지합니다. 그런 다음 접시를 실온에서 2시간 동안 셰이커에 옮깁니다.셰이커가 멈추면 접시를 섭씨 4도로 냉장고에 18-24시간 동안 두십시오. 이제 각 샘플에 대해 15마이크로리터의 혈청과 18마이크로리터의 0.5몰 아세트산을 혼합하고 실온에서 45분 동안 동일한 것을 배양합니다. 바둑판 분석을 기반으로 비오틴 SULFO-TAG 표지 항원의 합리적인 농도를 사용하여 항원 용액을 준비합니다.그런 다음 새 PCR 플레이트의 각 웰에 35마이크로리터의 항원 완충액을 분취합니다. 혈청 혼합물의 배양 과정이 완료되기 직전에 항원 플레이트의 각 웰 옆에 PH 9에서 3.8 마이크로 리터의 1 몰 트리스 완충액을 첨가합니다. 배양이 끝나면 항원 플레이트의 각 웰에 25마이크로리터의 아세트산 처리 혈청을 빠르게 옮기고 용액을 교반합니다.그런 다음 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮어 빛을 피하고 실온에서 2시간 동안 셰이커에 올려 놓습니다. 완료되면 접시를 섭씨 4도의 냉장고에 옮기고 18-24시간 동안 배양합니다. 섭씨 4도의 냉장고에서 스트렙타비딘 플레이트를 꺼내 실온에 도달시킵니다.스트렙타비딘 플레이트가 실온에 도달한 후 각 웰에 150마이크로리터의 3% 차단제 A를 넣고 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮고 냉장고에서 밤새 배양합니다. 다음날 냉장고에서 스트렙타비딘 플레이트를 제거하고 우물에서 완충액을 배출합니다. 그런 다음 남은 버퍼가 담글 수 있도록 종이 타월 위에 접시를 거꾸로 놓아 접시를 건조시킵니다.그런 다음 150마이크로리터의 1겹 PBST 버퍼를 추가하여 웰을 3회 연속 세척합니다. 다음으로, 스트렙타비딘 플레이트의 각 웰에 30마이크로리터의 혈청 항원 배양을 옮기고 빛을 피하기 위해 플레이트를 호일로 덮습니다. 그런 다음 접시를 실온에서 한 시간 동안 셰이커에 옮깁니다.1시간 후 플레이트에서 배양된 혈청 항원을 버리고 150마이크로리터의 1배 PBST 완충액을 추가하여 웰을 3회 세척합니다. 세척이 끝나면 각 웰에 150마이크로리터의 판독 버퍼를 추가하여 플레이트 리더에서 판독합니다. 미확인 샘플을 분석하기 전에 약 100명의 1형 당뇨병 환자와 약 100명의 건강한 대조군을 테스트하여 각 자가항체 분석에 대한 분석 컷오프를 설정했습니다.그런 다음 최상의 민감도와 특이도를 얻기 위해 GADA 분석에 대한 정상 상한의 최적 지수인 0.023을 결정하기 위해 ROC 곡선을 표시했습니다. 그런 다음, 미지의 샘플의 결과를 높은 양성, 낮은 양성 및 음성 통제 표준에서 파생된 방정식을 사용하여 계산했습니다. 다음으로, 산성 처리의 유무에서 인슐린 단일클론 항체를 정상 인간 혈청과 배양할 때 islet autoatibody assay에서 얻은 신호를 결정하기 위해 그래프를 표시했습니다.플롯은 산 처리가 없는 상태에서 일반 혈청을 추가할 때 신호가 현저하게 차단됨을 보여줍니다. 반대로, 얻어진 신호는 인슐린 단클론 항체와 함께 배양하기 전에 혈청이 산성 처리를 받을 때 비교적 높습니다. 또한 산성 처리의 유무에서 외국인 환자 Sera를 사용하여 얻은 신호를 결정하기 위해 유사한 그래프를 표시했습니다.항체를 배양하기 전에 환자 혈청을 산으로 치료하면 치료가 없는 경우와 비교할 때 섬 자가항체 분석에서 신호가 크게 증가합니다. 일단 숙달되면 이 기술은 적절하게 형성된다면 하루에 수백 개의 샘플에 대해 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 분석 상태를 최적화하기 위해 각 자가항체 분석에 대해 바둑판 분석을 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후, 이 기술은 자가면역 제1형 당뇨병 분야의 연구자들이 예측하고 예방할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 이 분석을 얼마나 쉽게 수행할 수 있는지 잘 이해하게 될 것입니다. 혈청 검체를 사용한 작업은 위험하고 전염성이 있을 수 있다는 점을 잊지 마십시오.이 절차를 수행하는 동안 항상 직접적인 피부 접촉을 피하기 위한 예방 조치를 취해야 합니다.

electrochemiluminescence-assays-for-human-islet-autoantibodies

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

기능 T-세포 assays에서 항원의 소스로 사용되는 인체 조직의 추출물을 준비하기위한 간단한 프로토콜은 설명되어 있습니다. 이 방법은 조직 유래 항원에 대한 T 세포 반응을 측정 할 수...

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DFS70 자가 기존의 형 간염-2 기질을 사용 하는 경우 정확한 해석을 도전 만드는 일반적인 반핵 항 체 질병 관련 된 패턴을 모방. 프로토콜에서는 기존의 형 간염-2 검사 및 monospecific 및 혼합된 아나 긍정적인 경우에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 아나 소설 조작된 형 간염 2 기판의 이점을 설명 합니다.

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여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

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본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

7개의 자가항체 분석을 함께 결합하는 간단한 멀티플렉스 ECL 분석을 모델링합니다. 이 분석은 체강 질병,자가 면역 갑상선 질환 및자가 면역 다선 증후군 1을 포함하여 T1D 및 여러 다른자가 면역 질환을 동시에 스크리닝 할 수 있습니다.

고처리량 전기화학발광 7-Plex 분석으로 제1형 당뇨병 및 다발성 자가면역질환 동시 스크리닝

제1형 당뇨병, 체강 질병 및 코로나바이러스 질병 2019에 대한 스크리닝의 시급한 필요성에 따라 당사는 4개의 췌도 자가항체, 조직 트랜스글루타미나제 자가항체 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2의 수용체 결합 도메인에 대한 항체를 동시에 검출하기 위해 고처리량 6-Plex 전기화학 발광 분석을 개발했습니다.

제1형 당뇨병, 체강 질병 및 COVID-19에 대한 고처리량 멀티플렉스 스크리닝

학습하세요 인간 섬 자가항체를 전기화학발광 분석으로 검출하는 방법을 통해 제1형 당뇨병을 조기 예측하고 진단하는 기술을. 이 비방사성 고감도 기법은 다른 자가면역 질환 연구에도 적용 가능합니다.

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

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