인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

이 전기화학발광 분석법의 전반적인 목표는 자가면역 제1형 당뇨병에서 높은 감도와 높은 특이도로 섬 아투항체를 검출하는 것입니다. 이 방법은 제1형 당뇨병 분야의 주요 질문, 예를 들어 섬 자가면역 시작 시간 및 제1형 당뇨병에 대한 고위험 예측과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 현재 표준 방사성 분석법에 비해 더 민감하고 질병 특이적이며 방사성이 없다는 것입니다.

이 기술의 의미는 제1형 당뇨병을 예측하고 진단하는 데까지 확장되는데, 이는 이러한 섬 자가항체가 증상이 있는 임상 질병이 나타나기 몇 달에서 몇 년 전에 나타나기 때문입니다. 이 방법은 제1형 당뇨병의 원인에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 셀리악병에 대한 트랜스글루타미나제에 대한 자가항체, TPO에 대한 트랜스글루타미나제, 자가면역 갑상선 질환에 대한 티로글로불린 및 기타 여러 가지 자가면역 질환을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 우리는 이 기술이 고감도와 비방사능을 기반으로 한다는 것을 알았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

기존의 ELISA 방법은 모든 섬 자가항체 검출에 잘 작동하지 않습니다. 이 방법의 시각적 시연은 혈청산 치료를 통한 인슐린 자가항체 분석이 텍스트로 설명하기 어렵기 때문에 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Yong Gu입니다.

먼저, 튜브에서 인간 섬 자가항원과 비오틴 또는 SULFO-TAG를 1-5몰 비율로 혼합합니다. 그리고 두 태그 모두 빛에 민감하기 때문에 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 그런 다음 실온에서 한 시간 동안 튜브를 배양합니다.

한편, 배양이 진행될 때 스핀 컬럼을 2중 인산염 완충 식염수로 프라이밍합니다. 그런 다음, 1, 000배 중력에 컬럼을 매번 2분 동안 원심분리하십시오. 다음으로, 스핀 컬럼에서 자가항원 태그 혼합물을 1, 000배 중력에서 2분 동안 원심분리한다.

그런 다음 표시된 항원을 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 다음으로, 항원 완충액에 대한 체커보드 분석을 기반으로 비오틴 SULFO-TAG 표지 항원의 합리적인 농도를 사용하여 96웰 플레이트당 3ml의 항원 용액을 준비합니다. 그런 다음 각 웰에 4마이크로리터의 혈청을 추가하고 1겹 인산염 완충 식염수로 최종 부피를 20마이크로리터로 조정합니다.

그런 다음 각 웰에 20마이크로리터의 라벨이 부착된 항원 용액을 추가합니다. 그리고 밀봉 호일로 접시를 덮고 빛을 방지합니다. 그런 다음 접시를 실온에서 2시간 동안 셰이커에 옮깁니다.

셰이커가 멈추면 접시를 섭씨 4도로 냉장고에 18-24시간 동안 두십시오. 이제 각 샘플에 대해 15마이크로리터의 혈청과 18마이크로리터의 0.5몰 아세트산을 혼합하고 실온에서 45분 동안 동일한 것을 배양합니다. 바둑판 분석을 기반으로 비오틴 SULFO-TAG 표지 항원의 합리적인 농도를 사용하여 항원 용액을 준비합니다.

그런 다음 새 PCR 플레이트의 각 웰에 35마이크로리터의 항원 완충액을 분취합니다. 혈청 혼합물의 배양 과정이 완료되기 직전에 항원 플레이트의 각 웰 옆에 PH 9에서 3.8 마이크로 리터의 1 몰 트리스 완충액을 첨가합니다. 배양이 끝나면 항원 플레이트의 각 웰에 25마이크로리터의 아세트산 처리 혈청을 빠르게 옮기고 용액을 교반합니다.

그런 다음 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮어 빛을 피하고 실온에서 2시간 동안 셰이커에 올려 놓습니다. 완료되면 접시를 섭씨 4도의 냉장고에 옮기고 18-24시간 동안 배양합니다. 섭씨 4도의 냉장고에서 스트렙타비딘 플레이트를 꺼내 실온에 도달시킵니다.

스트렙타비딘 플레이트가 실온에 도달한 후 각 웰에 150마이크로리터의 3% 차단제 A를 넣고 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮고 냉장고에서 밤새 배양합니다. 다음날 냉장고에서 스트렙타비딘 플레이트를 제거하고 우물에서 완충액을 배출합니다. 그런 다음 남은 버퍼가 담글 수 있도록 종이 타월 위에 접시를 거꾸로 놓아 접시를 건조시킵니다.

그런 다음 150마이크로리터의 1겹 PBST 버퍼를 추가하여 웰을 3회 연속 세척합니다. 다음으로, 스트렙타비딘 플레이트의 각 웰에 30마이크로리터의 혈청 항원 배양을 옮기고 빛을 피하기 위해 플레이트를 호일로 덮습니다. 그런 다음 접시를 실온에서 한 시간 동안 셰이커에 옮깁니다.

1시간 후 플레이트에서 배양된 혈청 항원을 버리고 150마이크로리터의 1배 PBST 완충액을 추가하여 웰을 3회 세척합니다. 세척이 끝나면 각 웰에 150마이크로리터의 판독 버퍼를 추가하여 플레이트 리더에서 판독합니다. 미확인 샘플을 분석하기 전에 약 100명의 1형 당뇨병 환자와 약 100명의 건강한 대조군을 테스트하여 각 자가항체 분석에 대한 분석 컷오프를 설정했습니다.

그런 다음 최상의 민감도와 특이도를 얻기 위해 GADA 분석에 대한 정상 상한의 최적 지수인 0.023을 결정하기 위해 ROC 곡선을 표시했습니다. 그런 다음, 미지의 샘플의 결과를 높은 양성, 낮은 양성 및 음성 통제 표준에서 파생된 방정식을 사용하여 계산했습니다. 다음으로, 산성 처리의 유무에서 인슐린 단일클론 항체를 정상 인간 혈청과 배양할 때 islet autoatibody assay에서 얻은 신호를 결정하기 위해 그래프를 표시했습니다.

플롯은 산 처리가 없는 상태에서 일반 혈청을 추가할 때 신호가 현저하게 차단됨을 보여줍니다. 반대로, 얻어진 신호는 인슐린 단클론 항체와 함께 배양하기 전에 혈청이 산성 처리를 받을 때 비교적 높습니다. 또한 산성 처리의 유무에서 외국인 환자 Sera를 사용하여 얻은 신호를 결정하기 위해 유사한 그래프를 표시했습니다.

항체를 배양하기 전에 환자 혈청을 산으로 치료하면 치료가 없는 경우와 비교할 때 섬 자가항체 분석에서 신호가 크게 증가합니다. 일단 숙달되면 이 기술은 적절하게 형성된다면 하루에 수백 개의 샘플에 대해 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 분석 상태를 최적화하기 위해 각 자가항체 분석에 대해 바둑판 분석을 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후, 이 기술은 자가면역 제1형 당뇨병 분야의 연구자들이 예측하고 예방할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 이 분석을 얼마나 쉽게 수행할 수 있는지 잘 이해하게 될 것입니다. 혈청 검체를 사용한 작업은 위험하고 전염성이 있을 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안 항상 직접적인 피부 접촉을 피하기 위한 예방 조치를 취해야 합니다.