Name: 재구성 가능한 미세 채널 핀 분할 측 벽 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 학습하세요 핀 배열로 제작된 변형 가능한 측벽을 갖춘 재구성 가능한 미세유체 장치의 제조 방법을. 스테인리스 스틸 핀 에칭과 PDMS 채널 조립을 통해 다양한 실험 조건에 적응하는 흐름 제어가 가능합니다.

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이 연구는 KAKENHI (20800048, 23700543)에 의해 지원 되었다.

1. 에칭의 핀 (그림 2A)
<ol><li>아세톤에 침수에 의해 사각형 핀을 탈지 하십시오.</li>
	<li>10% 질 산의 4 mL에 immersing 하 여 핀을 passivate 다음 오븐에서 30 분 65 ° C에서 솔루션을 열.</li>
	<li>잔여 산을 제거 하 고 종이 타월로 건조 5 분 이온된 수에 핀 sonicate 담가 2 h.Sonicate에 대 한 금형 릴리스 에이전트의 0.5 mL에 핀 5 분 이온된 수에 핀.</li>
	<li>에칭 접시 (그림 2C) 조작.<ol>
<li>그리기 또는 통치자를 사용 하 여 유리 슬라이드에 4 m m 간격으로 두 개의 평행선을 새 기 면.</li>
		<li>Coverglasses 잘라 두 직사각형의 1 개의 표면에 화학 저항 및 낮은 점도 접착제를 적용 합니다.</li>
		<li>4 m m 간격에 유리 슬라이드에 두 컷된 coverglasses 본드. 병렬 라인을 사용 하 여 가이드로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에칭 접시에 실리콘 접착제의 두 줄을 분배 (윤곽선의 크기와 위치에 대 한 그림 2C 를 참조). 참고: 3D 인쇄 템플릿 (STL 모델 파일은 보충 자료 포함) 쉽고 정확 하 게 라인을 그릴 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>그들의 바로 끝에 2 m m 긴 팁 접착 라인 패턴으로 몰입 하는 핀 에칭 접시에 넣어. 다시 핀 완전히 덮여 있다 고는 윤곽을 그리는 접착제 분배. 38 ° c가 열 습도 fermenter에 에칭 접시를 전송 접착제를 치료 하는 하룻밤을 기다립니다.</li>
	<li>유리 제 작은 유리병에 천천히 5.0 M 염 산의 0.2 mL에 0.5 M 질 산의 0.2 mL를 추가 합니다. 주의: 혼합로 알려진 또한 아쿠아 레 지아은 매우 부식성 및 잠재적으로 폭발성입니다. 산 증거 고무 장갑과 안전 고글을 착용 하 고 산을 처리 하는 경우 극단적인 주의. 솔루션을 저장 하지. 질소 산의 공격 성 감소를 최대한 줄입니다.</li>
	<li>65 ° c.에가 열 된 열판에 에칭 접시를 넣어 핀의 발견된 지역 산 성 혼합물의 0.4 mL 붓는 다. 10 분을 기다려 하 고 비 커에 염 산을 전송.</li>
	<li>이온을 제거 된 물에서 0.8 M 탄산 솔루션의 5 mL와 핀의 에칭된 지역을 포함 한 모든 나머지 산을 중화.</li>
	<li>핀셋으로 경도 핀을 당겨 에칭 접시에서 핀을 제거 합니다. 5 분 뒤에 5 분 동안 아세톤에 쥡니다 이온된 수에 핀 sonicate</li>
	<li>1.2 단계에서 핀의 에칭된 지역 passivate</li>
	<li>십자선 상점 현미경 에칭된 핀의 폭을 확인 하십시오. 에칭 영역의 너비는 0.2 ± 1.7에 설명 된 에칭 시간 조절 0.02 m m.</li>
	<li>70% 에탄올 5 ml를 포함 하는 유리 유리병에 핀을 전송. 층 류 후드에 유리병을가지고. 유리병에서 핀을 선택 하 고 건조 하도록 허용.</li>
</ol>2. 저수지와 핀 공간 실리콘 슬 래 브의 제조.
<ol><li>전형적인 석판 인쇄 프로세스에 의해 핀을 고정된 측 벽 공간에 대 한 금형을 조작.<ol>
<li>코트의 부정적인 에폭시 감광 제 1000 rpm 스핀 coater를 사용 하 여 1 mL와 탈지 유리 슬라이드. 한 번 15 분 반복에 대 한 95 ° C 뜨거운 접시에 감광이이 단계 건조.</li>
		<li>스핀 코트 감광 제 코팅된 된 유리 슬라이드에 2000 rpm에서 동일한 감광의 세 번째 계층. 30 분 동안 95 ° C 열판에 감광 드라이.</li>
		<li>Photoplotted 영화를 통해 UV 반점 빛 소스에서 포토 레지스트 층 450 mJ/cm2 365 nm 자외선의 노출. 손 스프레이 어를 사용 하 여 용 매 (2-methoxy-1-methylethyl 아세테이트)를 분사 하 여 15 분 개발에 대 한 95 ° C 열판에 노출 된 포토 레지스트는 포토 레지스트를 구워 고 질소 가스와 함께 타격 건조.</li>
		<li>플라스틱 접시의 하단에 포토 레지스트 패턴화 된 유리 슬라이드를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepolymer입니다 (PDMS)의 3 m m의 두께를 몰드에 붓으십시오. 10 분 동안-800 kPa에서 진공 desiccator에서 PDMS prepolymer debubble</li>
	<li>치료 1 h. Demold 65 ° C에서 오븐에서 PDMS prepolymer 부분적으로 치료 PDMS 슬 래 브는 메스를 사용 하 여. 오븐에서 1 h 동안 120 ° C에서 PDMS는 완전히 치료.</li>
	<li>지침 패턴 따라 같은 메스와 PDMS 슬 래 브에서 멀리 불규칙 한 가장자리를 잘라 주세요. 정확 하 고 특히 핀에 대 한 삽입 슬롯(참조 그림 1)를정의 하는 표면에 가능한 상처를 청소.</li>
	<li>생 검 펀치를 사용 하 여 PDMS 슬 래 브의 주요 채널의 끝에 입구/출구에 대 한 2 m m 직경 구멍 구멍. 마찬가지로, 공기 통풍구 채널의 끝에 1 m m 직경 구멍 구멍. 그림 1A 채널 레이아웃 및 이러한 구멍의 위치에 대 한 참조.</li>
</ol>3. 갭 필러 및 방 벽의 장소에서 제조와 소자의 조립.
<ol><li>조작 아닌 어셈블리.<ol>
<li>10 분 동안 60 ° C에가 열 하는 청소 솔루션에 10 × 20 mm 4 coverglass 담가.</li>
		<li>이온을 제거 된 물으로 coverglasses를 두 번 헹 구 고 10 분 동안 120 ° C에서 건조.</li>
		<li>플라즈마-본드는 PDMS는 coverglass 슬 래 브:<ol>
<li>PDMS 슬 래 브 (채널 기능 쪽)와 청소 10 × 20 mm 4 coverglass 스퍼터 coater의 진공 챔버에 배치 합니다.</li>
			<li>60 실바 생성 공기 진공 플라즈마 챔버 내려 펌핑 시작 (20 mA) 30 s.</li>
			<li>즉시 챔버 환기. 본드는 PDMS의 채널 기능 측면 그들의 가장자리는 coverglass에 슬라브 정렬.</li>
			<li>10 분 동안 65 ° C 오븐에서 보 세 레이어를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>살 균 컨테이너를 사용 하 여 층 류 후드를 보 세 레이어를 가져와. 30 분 동안 자외선과 그들을 소독.</li>
		<li>층 류 후드 슬롯에 핀은 아닌의 다른 측 벽을 형성 하는 그들의 끝을 삽입 합니다. 인접 한 핀 다른 길이 (참조 그림 1B) 수직 양쪽의 접촉을 피하기 위해 해야 합니다. 큰 간격 수직 끝 낫다입니다. 공간 (N-1) × (핀 폭) 때 다른 핀 길이 ( 그림 2AL )와 핀의 N 종류 준비가 가능 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>( 그림 2B) 기본 조작.<ol>
<li>또는 기지의 부품 파일을 읽고 확인 하 고 두 개의 수치 제어 (NC) 파일 (포함 된 공구 경로, 보충 자료로 포함) CAD/CAM 소프트웨어를 사용 하 여. 첫 번째 추가 NC 파일 4 mm 직경 엔드밀 및 1 m m 직경 끝 밀 초 사용 합니다.</li>
		<li>3 m m 두께 취소 polymethylmethacrylate (PMMA) 보드 CNC 밀링 클램프.</li>
		<li>컴퓨터 NC (CNC) 밀의 컨트롤러에 첫 번째 NC 파일을 엽니다. 엔드밀 4 m m CNC 선반을 설치 하 고 PMMA 보드 엔드밀 만져 부분 0을 찾습니다. 보드를 잘라 NC 코드를 실행 합니다. 참고: 때때로 끝 밀 팁 냉각 및 칩 제거를 위한 압축 공기를 불어.</li>
		<li>3.2.3 두 번째 NC 파일 및 1mm 엔드밀을 사용 하 여 반복 합니다.</li>
		<li>세제와 가공된 부품 degrease 고 종이 수건으로 건조. 부품 70% 에탄올 스프레이 하 고 층 류 후드를 갖다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>핀 갭 필러와 탄성 장벽 조작: 참고: 단계 3.3.1-3.3.7 박판 모양 후드에서 aseptically 수행 되어야 한다.<ol>
<li>무게에 의해 백색 바 셀 린과 2:1 비율로 소계 분말을 혼합 하 여 갭 필러를 준비 합니다. 초음파 균질 화기를 사용 하 여 혼합 균질</li>
		<li>디스펜서 주사기에 갭 필러를 부 어. 플런저를 삽입 하 고 주사기의 끝을 채우기 위해 밀어. 바늘을 연결 하 고 다시 바늘 팁 채워질 때까지 플런저를 밀어. 마찬가지로, 플런저와 바늘, 디스펜서 주사기를 준비 하 고 실리콘 접착제로 작성.</li>
		<li>각 주사기는 어댑터 튜브를 사용 하 여 공기 분배기에 연결 합니다. 실리콘 접착제와 250 kPa와 280 kPa를 위한 디스 펜스 압력을 조정 합니다.</li>
		<li>기지의 포켓의 가장자리에 실리콘 접착제 분배. 10 × 20 m m No.4 coverglass를 주머니에 놓고 본드로 단단히 누릅니다.</li>
		<li>기지의 두 외부 슬롯에 따라 두 개의 세그먼트를 그리는 데 약 1 m m의 깊이에 실리콘 접착제 분배. 다른 슬롯에 따라 세그먼트를 그릴에 깊이 약 1 m m의 갭 필러를 분배.</li>
		<li>다른 포켓의 가장자리에 실리콘 접착제 분배. 주머니에 아닌 어셈블리 (3.1)을 놓고 본드로 단단히 누릅니다.</li>
		<li>3.3.5 갭 필러와 실리콘 접착제 완전히 핀 포함 하 고 슬롯에 아무 여가를 반복 합니다.</li>
		<li>뚜껑을 가진 스테인리스 상자와 같은 살 균 컨테이너에 장치를 넣어. 38 ° c 습도 fermenter에 컨테이너 열을 전송 층 류 후드, 탄성 장벽 1 일에 대 한 치료.</li>
		<li>각 핀 최대 1 mm 인접 한 핀 해제 치료 탄성 장벽에서 핀을 따라 이동 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 UV 빛을 가진 장치를 소독.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 미세 소자의 평가
<ol><li>형광을 사용 하 여 누설을 감지<ol>
<li>아닌 훌륭한 도구 또는 데스크탑 로봇을 사용 하 여 엽니다. 가능한 채널에 걸쳐 일관 된 채널 너비를 확인 합니다.</li>
		<li>녹색 형광 염료 형광 솔루션 10 µ M에서 이온을 제거 된 물으로 희석.</li>
		<li>micropipettor와 아닌의 끝 포트 중 하나에 형광 솔루션을 추가 합니다. 이 단계는 솔루션 채널을 채울 것입니다.</li>
		<li>미세 장치 및 큰 플라스틱 접시에 이온을 제거 된 물으로 젖은 흡수 성 종이 두 조각을 넣어. 적어도 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어.</li>
		<li>현미경 카메라로 거꾸로 형광 현미경으로 아닌의 녹색 형광 이미지를 기록 합니다.</li>
		<li>적절 한 이미지 분석 소프트웨어와 형광 이미지를 열고 누설 (그린 형광)는 갭 필러 및 핀의 인터페이스에서 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>종자는 아닌 게 셀.<ol>
<li>70-80% (종류)에 따라 confluent 셀을 포함 하는 셀 문화 선박을 준비 합니다. 분리 하 고 성장 매체에 셀 중단.</li>
		<li>셀 (속도 시간 셀 형식에 따라), 원심 및 매체를 발음.</li>
		<li>중간의 작은 양의 셀 resuspend 셀 카운터로 셀 고 셀 밀도 1.5 × 106 에서 1.5 × 107 셀/mL를 조정 합니다.</li>
		<li>아닌 바로 400 µ m 전체 채널 수 있도록 좋은 도구 또는 데스크탑 로봇 (그림 1B)를 사용 하 여 엽니다. 가능한 채널을 통해 평면으로 측 벽을 핀 위치를 조정 합니다. 세포 현 탁 액은 아닌의 끝 포트 중 하나에 추가 하 고 채널을 채우기.</li>
		<li>문화를 시작 하는 영역의 측 벽을 정의 하는 핀 중 하나를 찾습니다. 거꾸로 현미경 셀 셀 문화 영역에 포함 하려면 두 개의 인접 한 핀을 닫습니다.</li>
		<li>순서에 내부 외부 채널에서 모든 셀을 추방 하는에서 모든 핀을 닫습니다. 부드럽게 발음 끝 포트에서 정지 하 고 그들에 게 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>4.1.4에 설명 된 대로 장치를 품 어. 때 세포는 약 70-80 %confluent, 문화 영역을 넓혀 핀을 열고 천천히.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+microfluidic+materials%2C+functions%2C+integration%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications.</a> Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).</li>
<li>Araci, I. E., Brisk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+microfluidic+large+scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in microfluidic large scale integration.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 60-68 (2014).</li>
<li>Gu, W., Chen, H., Tung, Y. -C., Meiners, J. -C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2431771?journalCode=apl">Multiplexed hydraulic valve actuation using ionic liquid filled soft channels and Braille displays.</a> Appl Phys Lett. 90 (3), 033505(2007).</li>
<li>Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+microfluidic+systems+with+reversible+seals+compatible+with+2D+and+3D+surfaces+of+arbitrary+chemical+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition.</a> Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).</li>
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<li>Oono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+microfluidic+device+with+discretized+sidewall%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 034103(2017).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

핀 분할 아닌은 갖춘 미세 채널, 그리고 우리는 그것이 분명히 높은 갖추었을 모든 기존 미세 채널 비교 채널 형태로 믿습니다. 우리가 여기 제공 하는 프로토콜에는 점차적으로 오랜 기간 동안 confluency에서 문화를 계속 셀 문화 표면 영역을 확대와 함께 세포 배양의 미세 장치 수 있게 된다. 장치 또한 미리 기판 또는 어떤 다른 시간에 디자인 또는 제조에 단백질 패턴 없이 셀에서 채널 패턴을 제공 합니다. 또한,이 재구성 가능한 미세 장치 쉽게 그러한 어려운 흐름 자료의 처리 장치를 처리할 수 있는 매우 몇몇 기존 미세 구현 하는 것을 도울 것 이다 강한 채널에서 변위 흐름을 생성 합니다. 즉, 세포 및 다른 미생물, 가스, 및 기타 비-유체 간의 상호 작용 장치 디자인에서 큰 수정 없이이 장치를 사용 하 여 평가할 수 있습니다.
우리는 채널의 한 입구 외부 흐름 제어 방법으로 라플라스 압력 또는 액체 정역학 압력 적용 간주 있다. 우리는 핀과 채널의 천장/바닥 사이의 격차를 통해 공기 환기 채널 쪽으로 흐름 생성 됩니다 때문에 죽은 끝에 액체 추진 권장 하지 않습니다. 많은 액체 작업 같은 핀 작업을 필요 하지 않습니다. 예를 들어 혼합 한 핀 (즉, 이동 1 개의 핀만 앞뒤로 여러 번) 액체를 mashing에 의해 수행할 수 있습니다.
장치의 가장 중요 한 부품은 핀입니다. 길이 정밀, 병렬 처리, 직각도 및 표면 품질은 핀, 처럼 그들은 아닌 형성 해야 합니다 원활 하 게 이동 해야 하 고 인접 한 핀의 움직임을 안내 합니다 합니다. 따라서, 핀 그림 2A와 유사한 그림을 제출 하 여 정밀 가공 전문 회사에서 주문 해야 하는 것이 좋습니다. 추가 기하학적 치수를 요구 하는 회사와 명시적 표면 거칠기 방향 수 있습니다. 그러나, 핀 그들은 신중 하 게 처리 하 고 때때로 질소 산 패 하는 경우 다시 사용할 수 있습니다.
탄성 방 벽은 또 다른 중요 한 기능, 그리고 그것의 형성은 소자의 제조 공정에서 가장 중요 한 단계. 정확 하 게 가공 된 자료는 반복 하 고 안정적인 결과를 얻이 필요 합니다. Uncured 장벽에 핀을 배치 또한 중요 한 단계입니다. 핀 잘 정렬 및 갭 필러와 기포 없이 장벽에 포함 된 유지 되어야 한다. 다음이 단계는이 미세 소자와 일반적인 문제는 핀을 통해 누설 방지.
이 장치를 사용 하 여 다른 일반적인 문제는) frictionally 제 핀, 및 b) 세포 죽음, 그리고 낮은 성장 율. 가능한 원인에 대 한 한) 핀 팁 높이 실리콘 석판에 대 한 금형에 포토 레지스트 층의 높이 사이 에칭된, 표면 및 치수 부적합의 핀 중간, 불 쌍 한 품질의 고르지 못한 테이퍼 (물결 모양) 에칭을 포함. Etchant 배합, 온도, 그리고 동요의 조정 핀 운동을 향상 시킬 수 있습니다. 또한, 왁 스 또는 접착제를 사용 하지 않고 피팅 재판 문제를 해결 하기 위해 힌트를 제공 합니다. 가능한 요인 b에서) 핀, 오류 탄성 장벽에 대 한 접착제의 선택에는 접착제의 불완전 한 치료의 부족 한 패 시 베이 션은. 일부 세포는 세포 접착을 홍보 하는 고분자 단백질 또는 다른 fibronectin 아닌 내부 코팅이 필요할 수 있습니다. 또한, 셀 문화 연습 trypsinization 등 원심 분리에에서 최적화는 아닌 죽은 세포를 줄일 것 이다.
제시 제조 프로토콜의 한계 중 하나는 측 벽 중 하나만 분할은 이다.입니다. 채널의 갖추었을 것 두 측 벽 핀 배열에 의해 구축 되어 있으면 더욱 향상 됩니다. 핀 및 더 이상 제조 단계의 금액을 두 번 필요 합니다, 비록 기술적으로 실행 가능한 옵션입니다.

미세 소자-마이크로 크기의 장치를 소량의 액체와 그들의 흐름을 제어-휴대성과, 자주, 경제성 "칩" 형식으로 생물 의학 절차의 소형화를 제공 합니다. 최근 검토1에 설명 된 대로 공간 및 긍정적인 기능으로 구성 된 다양 한 미세 구성 요소 기본 키 유체 함수와 혼합, 분리, 입자 트랩, 또는 반응 등을 실현 하기 위해 개발 되었습니다.
디자인 단계에서 많은 미세 소자의 동작을 결정 하는 동안 어떤 종류의 미세 장치 그들의 구조 또는 동작의 사후 제작 변경 수 있습니다. 여기 우리는 "갖추었을"로이 기능을 참조 하십시오. 미세 시스템의 갖추었을 일반적으로 장치를 디자인 하는 데 필요한 비용과 시간을 줄일 수 및/또는 시간이 지남에 미세 레이아웃 또는 기능 사용자 지정을 수 있습니다.
이전에 장치는 다음 세 가지 범주로 재구성 가능한 미세 기술. 첫 번째, 변형 탄성 채널의 흐름 속도 방향으로 사용 하는 동안 변경 될 수 있습니다. 갖추었을 얻을, 탄성 채널 공 압 압력 소스2, 점자 액추에이터3또는4밀봉 압축 등 다양 한 외부 및 지배할 수 있는 힘에 의해 변형 된다. 두 번째, 재구성 가능한 장치에 의존 모듈 디자인, 멀티 레이어 유체 회로, 자기와 모듈형 채널 상호 연결와 같은 튜브 기반 마이크로5. 세 번째, 장치 자체는 재구성, 하지만 전극 배열 (디지털 마이크로 라고도 함)6,7 , 교수형 드롭 기반 미세 장치8 microdroplet 교통 사용 요청 시 흐름 또는 액체의 경로 전환.
그럼에도 불구 하 고, 이러한 재구성의 많은 토폴로지 및 거시적인 수준에서 제한 됩니다. 예를 들어 많은 통합된 미세 장치 흐름을 중지 하거나 microchannels에서 미리 정의 된 영역을 축소 하 여 흐름 방향을 변경할. 그러나, 위치 및 개수 축소 됩니다 지역 재구성 하지 않습니다. 디지털 마이크로 유체 취급 능력의 다양 한 있지만, 각 작은 물방울의 볼륨에 의해 가능한 흐름을 크게 제한 한다. 또한, 세포 세포 배양의 같은 방울에 교양 때 추가적인 노력이 필요 증발 및 방울에서 가스 소모를 방지 하 고 osmolality 충격과 급격 한 pH 변화를 방지 합니다.
채널 기능 수준 갖추었을 실현, 우리 기계 요소를 동적으로 재구성 사용9에 때 그들의 배열의 구성 되어 움직이는 측 벽과 미세 장치를 제안 했다. 변형 측 벽을 형성 하기 위하여 작은 직사각형 핀이 핀 각 끝 정의 측 벽의 세그먼트 줄지어 있었다. 슬라이딩 핀 전송 허용 되는 측 벽의 변형 또는 셀, 거품, 및 채널 내 입자의 패턴을 허용. 죽은 볼륨을 최소화 하 고 극대화 갖추었을, 인접 한 핀 사이의 거리 최소화 했다. 그러나, 강력한 모 세관 행동에 작은 핀 내부 연결 사이 틈새와 아닌 외부 입력 핀 간격, 미디어 증발, 세균 이나 세포 독성 오염, 그리고 결국 셀을 일으키는 어떤 액체의 누설 원인 죽음입니다. 따라서, 우리는 주기적 핀 작업 및 장기 세포 문화10견딜 누출 무료 분할 된 측 벽 형 재구성 가능한 미세 채널을 개발 했습니다.
이 문서에서는, 우리는 셀 문화 영역에서 점진적 증가 따라 재구성 될 수 있다 분할 된 측 벽으로 미세 세포 배양 장치를 구축 하는 프로토콜을 제공 합니다. 개별 채널 측 벽의 기밀성이 형광 이미징 사용 하 여 테스트 됩니다. 세포 배양 호환성 및 세포 패터 닝의 능력 칩에 세포 배양을 사용 하 여 계산 됩니다.
이 미세 시스템은 적당 한 때마다 적절 한 채널 디자인 미리 결정 될 수 없습니다 요청 시 변경 해야 합니다. 예를 들어이 시스템 세포 성장 또는 마이그레이션, 흐름 또는 트랩 활성 nematodes 또는 채널에 예기치 않게 동작 하는 다른 작은 물체에 따라 채널 폭과 흐름 속도를 조정 하거나 다양 한 원시 샘플 또는 바이오 수락 하도록 사용 될 수 있는 아니 아직 생각 되었다 디자인의 때에.

<table><tbody><tr><td>오븐</td><td>Yonezawa</td><td>MI-100</td><td></td></tr><tr><td>10% 질산</td><td>Wako Chemicals</td><td>149-06845</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 핀</td><td>Micro Giken</td><td>N/A</td><td>0.3mm 단면, 등급 316L 스테인리스강, 와이어 컷 EDM</td></tr><tr><td>이형제</td><td>Fluoro Technology</td><td>FG-5093SH</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>신에츠 화학</td><td>KE-106</td><td></td></tr><tr><td>네거티브 에폭시 포토레지스트</td><td>Nippon Kayaku</td><td>SU-8 3050</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경 (직사각형)</td><td>Matsunami Glass</td><td>26 x 60mm No.4</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Kanto Chemicals</td><td>01060-79</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides (Large)</td><td>Matsunami Glass</td><td>76 x 52mm No.1</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 접착제</td><td>Shin-Etsu Chemicals</td><td>KE-41</td><td></td></tr><tr><td>백색 바셀린</td> 닛<td>코 리카</td><td>선 화이트 P-1</td><td></td></tr><tr><td>폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 분말</td><td>파워 하우스 Accele</td><td>마이크로 플루온 II</td><td></td></tr><tr><td>투명 아크릴 판 (3mm 두께)</td> <td>다양</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>공압 디스펜서</td><td>Musashi Engineering</td><td>ML-5000XII</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>간토 화학 물질</td><td>180768-00</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 수치 제어 (CNC) 밀</td><td>Pro Spec Tools</td><td>PSF240-CNC</td><td></td></tr><tr><td>엔드 밀 (직경 4mm)</td><td>Mitsubishi 재료</td><td>MS2MSD0400</td><td></td></tr><tr><td>엔드 밀 (직경 1mm)</td><td>Mitsubishi 재료</td><td>MS2MSD0100</td><td></td></tr><tr><td>접착제 (내 화학성 및 저점도</td>)<td>Cotronics</td><td>Duralco 4460</td><td></td></tr><tr><td>Borisilicate 유리 바이알</td><td>다양</td><td></td><td>HNO3+HCl 용액(왕수)을 제조합니다. 항상 붕규산 유리를 선택하십시오.</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>Kanto Chemicals</td><td>37116-00</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>AS ONE</td><td>AS12GTU</td><td></td></tr><tr><td>초음파 드릴</td><td>Shinoda Tools</td><td>SOM-121</td><td>초음파 균질기로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Active</td><td>ACT-220DII</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>AS ONE</td><td>ND-1</td><td></td></tr><tr><td>Photoplotted film (12,700 dpi)</td><td>Unno Giken</td><td>N/A</td><td>PDMS 슬래브 하단의 홈의 네거티브 이미지가 플롯됩니다.</td></tr><tr><td>2-메톡시-1-메틸에틸 아세테이트</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-10505</td><td></td></tr><tr><td>UV 스폿 광원</td><td>Hamamatsu</td><td>L8327</td><td>자외선 소스</td></tr><tr><td>질소</td><td>다양한</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>진공 데시케이터 및 펌프</td><td>ONE</td><td>MVD-100, GM-20S</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>다양한</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치(1.0mm 및 2.0mm)</td><td>Kai Medical</td><td>BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm)</td><td></td></tr><tr><td>유리 조각 펜</td><td>다양한</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>세척 용액</td><td>Tama Chemicals</td><td>TMSC</td><td>탈이온수로 1:100 희석</td></tr><tr><td>스퍼터 코팅기</td><td>San-yu Electron</td><td>SC-708</td><td>플라즈마 본딩용.</td></tr><tr><td>디스펜서 주사기 (5ml)</td> <td>무사시 엔지니어링</td><td>PSY-5E</td><td></td></tr><tr><td>플런저</td><td>무사시 엔지니어링</td><td>FLP-5E</td><td></td></tr><tr><td>무딘 바늘 (21G)</td><td>무사시 엔지니어링</td><td>PN-21G-B</td><td></td></tr><tr><td>어댑터 튜브</td><td>무사시 엔지니어링</td><td>AT-5E</td><td></td></tr><tr><td>발효기</td><td>일본 반죽기</td><td>PF100</td><td></td></tr><tr><td>녹색 형광 염료 (Alexa Fluor 488 카르복실산)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A33077</td><td></td></tr><tr><td>대형 플라스틱 접시</td><td>Greiner bio-one</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>흡수지</td><td>Asahi Kasei</td><td>BEMCOT M-1</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco modified Eagle medium (DMEM)</td><td>GE Health Care</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA 용액</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>GE Health Care</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1820</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>FPI</td><td>OC-C-S02</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 용기</td><td>VIOLAMO</td><td>VTC-D100</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Shop 현미경</td><td>PEAK</td><td>2034-20</td><td></td></tr><tr><td>핸드 스프레이</td>어 <td>FURUPLA</td><td>No.3530</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경 (직사각형)</td> <td>Matsunami Glass</td><td>10 x 20mm No.4</td><td></td></tr><tr><td>CAD/CAM 소프트웨어</td><td>Autodesk</td><td>Inventor HSM</td><td></td></tr><tr><td>질소 가스 압력 레귤레이터</td><td>AS ONE</td><td>GF1-2506-RN-V</td><td>를 0.1MPa로 설정</td></tr></tbody></table>

재구성 가능한 미세 채널 핀 분할 측 벽

Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls

미세 구성 요소 혼합, 분리, 입자 트랩, 또는 반응 등 다른 주요 미세 기능을 실현 하기 위해 다양 한 도형이 필요 합니다. 미세 채널을 채널 형태를 유지 하면서 제조 후에 변형 높은 spatiotemporal 갖추었을 수 있습니다. 이 갖추었은 기존 "재구성" 또는 "통합" 미세 시스템을 달성 하기 어려운 그런 키 미세 기능에 필요 합니다. 직사각형 핀의 끝의 옆으로 정렬 된 배열 구성 된 변형 측 벽으로 미세 채널 제조 하는 방법을 설명 합니다. 움직이는 그들의 경도 방향에 있는 핀 핀의 끝 위치, 그리고 이렇게, 분할 된 채널 측 벽의 모양을 변경 합니다. 원치 않는 누설 또는 초승달 모양 힘에 의해 발생 하는 인접 한 핀 접착 핀 간격이 발생할 수 있습니다. 핀 간격을 닫으려면, 우리는 탄화수소 중합체 정지-기반 갭 필러는 탄성 장벽에 의해 동반를 도입 했습니다. 이 재구성 가능한 미세 장치 강한 시간에 채널 변위 흐름을 생성할 수 또는 채널의 모든 영역에서 흐름을 중지할 수 있습니다. 이 기능은 촉진 한다, 주문형, 셀, 점성 액체, 가스 거품, 및 비-유체, 처리 경우에 그들의 존재 나 행동 하지 알려져 제조의 때에.

재구성 가능한 아닌의 건설은 그림 1에 표시 됩니다. 여러 개의 직사각형 핀 유리 기판에 배치 했다 고 핀의 긴 측 접촉에서 했다 그래야 줄지어 있었다. PDMS 시트와 펀치 구멍 및 핀 높이 같은 깊이의 쉬는 시간 덮여 채널 입구/출구 저수지, 채널, 천장과 핀 구성 되어 채널 벽 반대 다른 측 벽을 형성 하는 핀의 끝. 핀, 벽 (PDMS 시트의 얼굴 중 하나), 그리고 유리 기판으로 둘러싸인 지역 한 미세 채널을 형성 합니다.
앞에서 설명한 대로 제안 된 미세 시스템의 갖추었은 매우 작지만 0이 아닌 간격으로 병렬로 배치 하는 많은 작은 핀에 의해 이루어집니다. 이전 보고서에서 문제는 격차를 통해 모 세관 효과 의해 생성 하는 강한 흐름을 했다. 이 문제를 해결 하려면 간격 처음 갭 필러와 함께 가득 차 있었다. 이 프로토콜에서 점성 탄화수소와 플라스틱 분말의 분산 혼합 갭 필러로 사용 되었다. 그러나, 갭 필러 자체는 또한 모 세관 효과. 따라서, 그림 1에서 보듯이, 탄화수소/플라스틱 갭 필러와 갭 필러의 외부 둘레의 주위에 형성 하는 탄성 장벽 결과 재구성 가능한 아닌이 있다. 핀의 중간 숱이 충분 한 양의 두께 보장 하기 위해 갭 필러 및 2 개의 핀 사이 탄성 방 벽의 힘을 필요 합니다.
그림 2 A 측 벽 세그먼트를 형성 하는 핀의 그림을 보여줍니다. 스테인레스 스틸 학년 316 L 부식 저항 및 낮은 leaching 속성 자료로 선정 되었다. 그러나, 여분의 패 시 베이 션 과정 호환 핀 세포 배양을 만들 것을 요구 했다. 핀 측 벽 세그먼트를 성공적으로 털 없이 정확 하 게 직사각형 팁을가지고 있어야 합니다. 또한, 핀 핀 핸들을 추진 하 여 쉽게 이동할 수 있도록 "핸들"을가지고 있어야 합니다. 때문에 각 핀에는 좁은 가운데, 핀 사이 고무의 두께 핀 운동으로 인 한 전단 저항 하기 충분 했다. 장치에 구성 된 다른 부분과 달리 전기 방전 (EDM) 작은 가공의 가장 정확 하 고 비용 효율적인 방법 중 하나 이기 때문에 가공 전문 회사에서 중간 숱이 제외 하 고 핀의 제조를 주문 하드 금속 부품입니다. 자신을 에칭에 의해 중간 숱이 수행 가공 비용 및 절곡 하거나 가공 중의 위험을 줄일 수 있습니다.
갭 필러, 탄성 장벽, 그리고 결국 재구성 가능한 아닌의 watertightness 제대로 작동 확인, 누수 탐지 형광에 의해 사용 되었다. 그림 3 에서 3 일 후에 아닌 형광 추적 염료를 포함 하는 물으로 채워졌다 탄성 방 벽의 가장자리 근처의 형광 이미지를 보여준다. 형광 이미지는 탄성 방 벽의 보이는 가장자리에서 약 200 µ m의 깊이 도달 하는 채널을 채우는 액체를 보여줍니다. 그러나, 액체 도달 하지 않았다는 갭 필러. 또한, 탄성 장벽을 통해 갭 필러의 누설은 관찰 되었다. 이 관측은 핀 및 탄성의 좁은 중간 사이 꽉 맞는 격차를 통해 액체의 마이그레이션 방지 나타냅니다.
마지막으로, 우리는 점차적으로 재구성 가능한 미세 장치 그림 4A의 측 벽을 확장 하 여 적응 하는 문화 영역으로 장기 세포 배양을 수행. 0 d, 세포의 작은 수 셀 핀 폭 및 다른 발음 했다 한 공간 내에서 국한 되었다. 2 d 셀 아래쪽 표면에 연결 된 고 확산 시작 했다. confluency은 여전히 낮은 모든 셀은 명확 하 게 볼 수 있도록 두 개의 핀 제거 했다. 5 d, 세포 증식을 계속 하 고는 confluency 증가 합니다. 6 d 9에서 다른 2 개의 핀 셀 underconfluent 유지 하 철회 했다. 문화 영역의 점진적 확장의 효과 그림 4B에 표시 됩니다. 빼낸 철회 했다 하루에 셀 밀도의 급격 한 변화 했다. 그러나 일반 세포 배양에 본 지는, 세포 수의 성장 속도 상수, 유지 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57230/57230fig1.jpg"> 그림 1 : 한 핀 분할 sidewall 재구성 가능한 미세 장치. (A) 부품 및 재구성 가능한 미세 소자의 건설. 장치 한 스트레이트 채널 10 스테인레스 스틸 핀 PDMS/유리 아닌 기능에 삽입의 끝으로 한 측면 있다. 갭 필러와 탄성 장벽 핀 간격을 통해 새 기에서 액체를 방지 합니다. Coverglasses, 갭 필러와 탄성 장벽 기본 polymethylmethacrylate (PMMA)에 고정 됩니다. (B) 자동 핀 조작 금속 시트에서 만든 엔드 이펙터 3 축 데스크탑 로봇에 고정 됩니다. 하나의 핀을 이동 하려면 엔드 이펙터의 수직 끝을 못 살게 굴지. 다른 길이 핀 핀 폭의 3 배 간격으로 배치 됩니다. 간격 끝 이펙터 동료 한 핀 한 번에 충분 한 허가 함께 사용. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57230/57230fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57230/57230fig2.jpg"> 그림 2 : 프로토콜에 사용 되는 가공된 부품의 기계 그림. 단위는 밀리미터; R 나타냅니다 반지름 치수; 사각형 기호 (□) 나타냅니다 평방 기능; t 는 두께 나타냅니다. (A)는 316l 스테인레스 스틸 핀 sidewall의 일환으로. 핀 주문 하 고 설명 된 대로 가공 될 수 있다. 개 뼈 같은 모양 수 있도록 핀 중간의은에 반영 되지이 그림 때문에이 가공 하는의 일환으로 주문 하지는 하지만 프로토콜의 일환으로 수행 되었다. (B) 핀 운동에 대 한 장소에서 coverglasses, 갭 필러와 탄성 장벽 보유 하는 polymethylmethacrylate (PMMA) 기지. (C) 핀의 중간을 식 각 하는 데 사용 되는 에칭 요리. 구축 하기 위해 에칭 접시, 유리의 4 개의 조각 실리콘 접착제를 사용 하 여 보 세는. 실리콘 접착제의 등고선 패턴의 핀 배치 도면에 표시 된 대로 접시에 다음 접시에 그려집니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57230/57230fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57230/57230fig3.jpg"> 그림 3 : 핀 간격을 통해 재구성 가능한 아닌에서 누설의 형광 탐지. 재구성 가능한 아닌 작성 녹색 형광 염료의 형광 이미지에 갭 필러 (불투명)으로 구성 된 물개 구조 단계 대조 이미지 중첩 및 탄성 (반투명). 고무 방 벽의 가장자리 초승달 모양-같은 기능으로 볼 수 있으며, 위의 점선;로 표시 고무 방 벽 및 갭 필러 간의 인터페이스 문의 검은 지역 초승달 모양-같은 기능으로 표시 되 고 낮은 점선으로 표시 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57230/57230fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57230/57230fig4.jpg"> 그림 4 : 가변 셀 문화 영역 재구성 가능한 아닌 진보와 지속적인 세포 성장. (A) 측 벽을 이동 하 여 갇혀 셀 문화 영역에서 COS-7 세포 성장. (B) 성장 곡선 및 시간 진화의 A에 표시 된 재구성 가능한 아닌에 가변 크기 문화 영역에 COS-7 세포의 밀도). 3 수직 화살표 각각 2, 5, 및 6 d, 셀 문화 영역의 확장을 나타냅니다. 세포 수, 뿐만 아니라 셀 밀도 동일한 문화 영역, 각 지 수 성장 곡선을 개별적으로 장착 하 고 시간을 추정 하는 현지 배로 (td [h])는 프레임에 표시 된 사용에 대 한 표시 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57230/57230fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

측 벽 변형 된 미세 채널 흐름 제어, 입자 처리, 채널 차원 사용자 지정 및 사용 하는 동안에 다른 재구성을 제공 합니다. 우리는 그들의 모양을 변경할 수 있는 핀의 배열을 측 벽으로 미세 채널을 조작 하는 방법을 설명 합니다.

Microfluidic components need to have various shapes to realize different key microfluidic functions such as mixing, separation, particle trapping, or ...

이 절차의 전반적인 목표는 핀 배열로 만들어진 측벽이 있는 재구성 가능한 미세유체 장치를 제작하는 것입니다. 이 미세유체 장치의 주요 장점은 채널 설계 단계에서 알 수 없는 흐름이 어려운 물체와 상황을 처리할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 개 뼈 모양에 작은 핀을 에칭하는 데 어려움을 겪을 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 많은 미세유체 부품을 조립하고 베이스에 장착하는 것이 서면 프로토콜만으로는 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 이 사진은 재구성 가능한 채널이 있는 완성된 미세유체 소자입니다. 여기서, reconfigurable 부분은 이미지의 상단을 따라 있습니다.분해도 회로도는 주요 구성 요소 중 일부를 나타냅니다. 특히, 마이크로채널과 이를 재구성하는 데 사용되는 핀에 주목하십시오. 첫 번째 단계로 핀을 에칭합니다.길이가 다른 0.3mm 두께의 L자형 탈지 스테인리스 스틸 핀으로 시작합니다. 10 % 질산 4 밀리리터를 준비하고 핀을 담그십시오. 그런 다음 용기를 섭씨 65도의 오븐에 30분 동안 넣습니다.핀을 회수한 후 핀셋으로 하나씩 탈이온수 용기에 옮깁니다. 다음으로, 물속에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 완료되면 종이 타월로 말리십시오.0.5ml의 이형제를 준비하고 핀을 담그십시오. 2시간 후 핀을 탈이온수에 넣고 5분 동안 초음파 처리합니다. 계속하려면 에칭 접시가 필요합니다.에칭 접시는 유리와 실리콘 접착제로 구성됩니다. 접시의 핀 끝에 실리콘 접착제를 분배하여 에칭 과정을 시작합니다. 곧은 끝의 끝이 접착제에 잠기도록 핀을 놓습니다.이것은 모든 핀이 제자리에 있고 다음 단계를 위해 준비된 후의 요리입니다. 에칭 접시를 섭씨 38도로 가열된 가습 발효조로 옮기고 접착제가 경화될 때까지 밤새 기다립니다. 준비가 되면 핀이 있는 에칭 접시를 섭씨 65도의 핫플레이트에 놓습니다.핀의 덮이지 않은 영역에 0.8ml의 에칭 산을 붓습니다. 10분 후, 마이크로피펫터를 사용하여 산을 비커로 옮깁니다. 그런 다음 접시에 에칭산을 더 넣어 에칭 단계를 반복합니다.에칭 후 에칭된 영역의 너비가 약 0.2mm인지 확인하십시오. 그렇다면, 5ml의 중탄산나트륨 용액을 에칭 접시에 마이크로피펫으로 분사하여 잔여 산을 중화시킵니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 세로로 당겨 핀을 제거합니다.제작된 금형으로 시작합니다. 이 회로도에서와 같이 금형은 측벽이 고정되어 있고 핀을 위한 공간이 있는 장치용입니다. 리소그래피를 사용하여 유리 슬라이드에 금형을 만듭니다.준비한 슬라이드를 플라스틱 접시 바닥에 놓습니다. 이제 PDMS의 예비 중합체를 금형에 3mm 두께로 붓습니다. 접시를 진공 데시케이터에 10분 동안 넣습니다.그런 다음 섭씨 65도의 오븐에 1시간 동안 옮깁니다. 그 결과 부분적으로 경화된 슬래브가 생성됩니다. 메스를 사용하여 다음 단계를 위해 슬래브를 탈형합니다.슬래브를 섭씨 120도의 오븐에 한 시간 동안 넣어 완전히 경화시킵니다. 이제 완전히 경화된 슬래브로 작업하십시오. 가이드 라인 패턴을 따라 불규칙한 가장자리가 있습니다.메스를 사용하여 불규칙한 가장자리를 정확하고 깨끗하게 다듬습니다. 최상의 장치를 만들기 위해 핀 삽입 슬롯의 표면에 특히 주의하십시오. 메인 챔버의 입구/출구 및 다른 곳에 생검 펀치를 사용하여 구멍을 뚫습니다.이제 마이크로채널 어셈블리를 제작합니다. 세척액을 섭씨 60도로 가열하고 4번 커버 유리를 얻습니다. 커버 유리의 크기는 10mm x 20mm입니다.커버 유리를 용액에 10분 동안 담그십시오. 헹굼 및 건조된 커버 유리와 PDMS 슬래브를 스퍼터 코팅기의 하부 전극에 놓습니다. 30초 동안 공기 진공 플라즈마를 생성합니다.검색된 항목을 접착하여 가장자리가 정렬되고 채널 피쳐가 커버 글래스를 통해 보이도록 합니다. 멸균 용기를 사용하여 접착된 층을 층류 후드로 가져와 살균합니다. 완료되면 핀을 슬롯에 삽입합니다.인접한 핀의 길이는 달라야 합니다. 핀은 마이크로 챔버의 다른 측벽을 형성합니다. 층류 후드에서 계속 작업하십시오.다음 단계에서는 장치에 대한 베이스를 준비합니다. 백색 바셀린과 폴리테트라플루오로에틸렌 분말의 혼합물을 균질화하여 갭 필러를 준비합니다. 균질화된 혼합물을 디스펜서 주사기에 붓고 플런저를 삽입합니다.플런저를 밀어 주사기 팁을 채웁니다. 그런 다음 바늘을 부착하고 바늘이 채워질 때까지 플런저를 밉니다. 비슷한 방식으로 실리콘 접착제가 있는 두 번째 주사기를 준비하고 각각을 공압 디스펜서에 연결합니다.이제 베이스에 실리콘 접착제를 뿌립니다. 주머니 중 하나에 넣어 두십시오. 그런 다음 주머니에 4번 커버글라스를 놓고 세게 눌러 접착합니다.다음으로, 약 1mm 깊이의 세그먼트를 그려 베이스의 두 외부 슬롯을 따라 실리콘 접착제를 분배합니다. 중간의 다른 슬롯을 따라 1mm 깊이의 세그먼트로 갭 필러를 분배합니다. 다른 주머니의 가장자리에 접착제를 더 바르십시오.마이크로 채널 어셈블리를 포켓에 놓고 단단히 누릅니다. 다시 한 번, 베이스 중앙을 따라 슬롯에 갭 필러를 넣습니다. 인접한 슬롯에 접착제를 바르면 됩니다.멸균 후드에 장치를 하루 동안 그대로 두십시오. 경화 후 층류 후드에서 인접한 핀을 따라 각 핀을 최대 1mm까지 움직여 엘라스토머 장벽에서 분리합니다. 이온수에 녹색 형광 염료를 희석하여 누출에 대한 형광 테스트를 설정합니다.그런 다음 마이크로채널을 열어 전체적으로 일정한 너비를 갖습니다. 마이크로피펫을 사용하여 염료를 마이크로채널의 한쪽 끝 포트로 옮기고 용액으로 채웁니다. 큰 플라스틱 접시에 탈이온수에 젖은 흡수성 종이 두 장과 장치를 안에 넣습니다.섭씨 37도에서 최소 24시간 동안 5% 이산화탄소에서 접시를 배양합니다. 회수된 장치를 도립 형광 현미경으로 보고 이미지를 기록합니다. 이를 사용하여 핀 주변에 누출이 없는지 확인하십시오.이 이미지는 누출 및 누출되지 않는 샘플입니다. 또 다른 검사는 세포를 파종하는 것과 관련이 있습니다. 마이크로 채널을 열어 측벽이 전체적으로 가능한 한 평평하게 400미크론 너비의 직선 채널을 만듭니다.채널을 채우기 위해 한쪽 끝 포트에 셀 서스펜션을 추가합니다. 세포 배양을 시작하기 위해 영역의 측벽을 정의하는 핀을 찾고 이를 닫아 영역의 세포를 둘러쌉니다. 영역 근처에서 시작하여 채널의 셀을 추방하기 위해 모든 핀을 닫습니다.엔드 포트에서 서스펜션을 흡입한 후 매체를 추가합니다. 젖은 흡수성 종이가 있는 플라스틱 용기에 장치를 넣습니다. 최소 24시간 동안 배양하십시오.밀폐된 영역에서 셀이 약 10개의 셀이 있는지 확인합니다. 그런 다음 핀을 천천히 집어넣어 배양 영역을 넓힙니다. 이 이미지는 재구성 가능한 마이크로채널에서 성장한 COS-7 세포의 이미지입니다.9일 동안 마이크로채널 배양 구역이 확장되었습니다. 수집된 데이터는 세포 수와 밀도를 시간의 함수로 나타낼 수 있습니다. 파란색 점과 곡선 맞춤은 세포 수에 대한 것입니다.빨간색 기호와 맞춤은 밀도에 대한 것입니다. 밀도의 경우 세로 화살표는 2일, 5일, 6일에 세포 배양 면적이 확장되었음을 나타냅니다. 밀도는 동일한 배양 영역에 대해 계산됩니다.이 비디오를 시청한 후에는 작은 핀으로 미세유체 채널의 누출 없는 측벽을 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 프로토콜 단계를 신중하고 철저하게 수행하는 것이 중요합니다.강산으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 적절한 양의 중화제를 준비하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 절차에 따라 더 복잡한 세포 배양을 확립하기 위해 액체가 있는 다른 세포를 도입할 수 있습니다.

reconfigurable-microfluidic-channel-with-pin-discretized-sidewalls

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 탄성 polydimethylsiloxane (PDMS) 기반 photolithographically 정의 정확한 볼륨을 닫고 기능을 더 추가 에너지를 필요가 없다 microvalve 배열을 제조 및 자동화 프로토콜을 보여줍니다. 병렬 subnanoliter 볼륨 믹서와 통합 microfluidic 재관류 시스템을 소개하는 부분이있다.

Microfluidic 칩은 탄성 Microvalve의 배열을 제어

마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

홈마이크로유체 채널을 통과하는 2개의 인접한 유체는 사전 중합체 코어 주위의 칼집을 형성하도록 지시될 수 있다; 따라서 모양과 단면을 모두 결정합니다. 티올 클릭 화학과 같은 광숙련 중합화는 코어 유체를 소정의 크기와 모양으로 미세화로 빠르게 고화시키는 데 적합합니다.

미리 설계된 크기와 모양의 중합체 및 바이오 하이브리드 섬유의 미세 유체 제조

우리는 폴리디메틸실록산(PDMS)에서 두 마이크로채널 사이에 나노유체 접합을 생성하기 위해 실리카 콜로이드 나노입자의 간단한 자기 조립 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하여 기공 크기가 ~45nm인 나노다공성 비드 멤브레인을 마이크로채널 내부에 구축하고 DNA 샘플의 동전기 사전 농축에 적용했습니다.

콜로이드 입자의 자기 조립 과정을 통해 PDMS 미세 유체 칩의 하위 50 Nm의 나노 유체 접합 만들기

여기에서는 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만들어진 이중층 미세유체 시스템의 제조 및 작동에 대해 설명합니다. 우리는 트래핑을 위한 이 장치의 잠재력을 보여주고, 결정질 분자 물질의 배위 경로를 지시하고, 온칩 트랩 구조에 대한 화학 반응을 제어합니다.

미세 유체 압축 공기를 넣은 케이지 : A의 칩 크리스탈 트래핑, 조작에 대한 새로운 접근 방식 및 제어 화학 처리

다층 미세유체 장치는 종종 기능을 위해 복잡한 형상을 가진 마스터 금형의 제작을 포함합니다. 이 기사에서는 모든 응용 분야에 맞게 조정할 수 있는 밸브 및 가변 높이 기능을 갖춘 다단계 포토리소그래피를 위한 완벽한 프로토콜을 제시합니다. 시연으로, 우리는 하이드로겔 비드를 생산할 수 있는 미세유체 액적 발생기를 제작합니다.

판막 다층 미세 유체 장치에 대한 여러 단계의 변수 높이 포토 리소그래피

표시 하 고 적외선 빛 영상에 대 한 투명 한 뷰-포트 플라스틱 미세 소자의 제조에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

뷰-포트 표시 하 고 적외선 빛에 투명 한 플라스틱 미세 소자를 제작 하기 위한 소프트 리소 절차

여러 가지 방법입니다 미세 장치에 포함 된 비 직사각형 섹션의 채널의 제조에 사용할 수 있습니다. 그들의 대부분을 다단계 제조 하 고 광범위 한 맞춤 포함. 이 문서에서 한 단계 접근입니다 순차적 습식된 에칭에 의해 다른 기하학적 횡단면의 미세 채널 제조에 대 한 보고 됩니다.

1 단계 접근입니다 미세 채널 순차적 습식된 에칭 프로세스에 의해 다른 형상 섹션의 조작

이 프로토콜은 개방형 웰 형식과 유체 흐름 기능을 통합하는 재구성 가능한 멤브레인 기반 세포 배양 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 표준 프로토콜과 호환되며 오픈 웰과 미세유체 배양 모드 간의 가역적 전환이 가능하여 엔지니어링 및 생명과학 실험실의 요구 사항을 모두 수용할 수 있습니다.

정적 장벽 조직 모델을 동적 미세생리학 시스템으로 변환

여기에서는 수중수(water-in-oil) 에멀젼(플러그)의 조합 라이브러리를 생산하기 위한 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 이중층 장치의 제조를 소개합니다. 플러그 생산을 자동화하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어는 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 형광 플러그의 정량적 라이브러리 생산도 시연됩니다.

조합 플러그 생산을 위한 이중층 미세유체 장치

학습하세요 핀 배열로 제작된 변형 가능한 측벽을 갖춘 재구성 가능한 미세유체 장치의 제조 방법을. 스테인리스 스틸 핀 에칭과 PDMS 채널 조립을 통해 다양한 실험 조건에 적응하는 흐름 제어가 가능합니다.

재구성 가능한 미세 채널 핀 분할 측 벽

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