일반적인 경 동맥 중재 이식 정 맥 경에서에서 튼튼한 Transgene 식의 토끼 모델

이 방법은 정맥 이식 실패의 발병에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다. 예를 들어, 이식 실패의 매개체를 식별하고 이식 실패를 예방하기 위한 전략을 테스트할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정맥 이식편 내피에서 내구성 있고 안정적인 전이유전자 발현을 달성할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 토끼를 마취한 후 흉골 노치에서 하악골 가장자리까지 동물을 면도합니다. 수술 설정이 완료되면 전기 소작술을 사용하여 흉골 노치와 하악골 사이의 정중선을 따라 약 7-9cm 길이의 피부를 절단합니다. 그런 다음 수건 클램프를 부착하여 절개 부위를 엽니다.

전체 정중선을 따라 근막 아래를 무뚝뚝하게 절개합니다. 그런 다음 전기 소작을 사용하여 정중선을 따라 절개된 근막층을 자릅니다. 다음으로, 오른쪽에서 시작하여 기관 위에 있는 흉골 설골 근육과 흉골 근육 사이를 절개하여 총경동맥을 노출시킵니다.

그런 다음 총경동맥의 4-5cm 분절과 주변 조직이 없는 더 큰 가지를 조심스럽게 절개합니다. 봉합사 원위부의 각 가지를 절단하기 전에 5-0 실크 봉합사를 사용하여 총경동맥의 큰 가지를 접합합니다. 왼쪽 총경동맥 절개를 반복한 후 조직 고정 겸자를 사용하여 피하 조직층을 일시적으로 닫습니다.

그런 다음 외부 경정맥이 노출될 때까지 오른쪽 피부에서 표재성 근막을 절개합니다. 외부 경정맥의 4-5cm 분절을 절개하고 주변 조직에서 그 가지를 제거합니다. 5-0 실크 봉합사를 사용하여 가지를 접합한 다음 가지를 자릅니다.

다음으로 양쪽 끝에서 고립된 정맥을 접합하고 두개골 끝을 절단하고 헤파린 식염수로 내강을 씻어냅니다. 정맥 이식을 수행하려면 혈관 클립을 사용하여 고립된 분절의 두개골 끝에 있는 오른쪽 총경동맥을 고정합니다. 그런 다음 꼬리 끝에 혈관 클립을 놓습니다.

이제 정맥 분절의 두개골 끝 직경과 동일한 길이의 꼬리 클램프까지 두개골 절개술을 수행합니다. 그런 다음 꼬리 동맥절개술을 통해 헤파린화된 생리식염수 주사기에 연결된 IV 카테터를 삽입하고 경동맥 내강을 세척합니다. 액체는 동맥 절개술을 통해 빠져 나옵니다.

경정맥으로 돌아가서 정맥을 절제하고 동맥 옆에 놓습니다. 7-0 폴리프로필렌의 단일 스티치를 사용하여 꼬리 동맥 절개술의 꼬리 끝을 정맥 분절의 두개골 끝까지 봉합합니다. 그런 다음 첫 번째 스티치에서 180도 각도로 두 번째 스티치를 배치하여 꼬리 동맥 절개술의 두개골 가장자리를 정맥 분절의 두개골 끝까지 봉합합니다.

문합 측면의 처음 두 바늘에서 같은 거리에 세 번째 바늘을 놓습니다. 그런 다음 처음 두 바늘에서 같은 거리와 세 번째 바늘 건너편에 문합의 내측에 네 번째 바늘을 놓습니다. 1에서 4까지의 각 스티치 사이에 4개의 추가 스티치를 놓습니다.

원위 클립의 꼬리 쪽에서 두개골 동맥 절개술을 수행합니다. 두개골 동맥절개술의 두개골 끝과 꼬리 동맥 절개술의 꼬리 끝 사이의 거리는 정맥 분절의 길이와 같아야 합니다. 두개골 동맥 절개술의 길이는 정맥 분절의 꼬리 끝 지름과 같습니다.

문합에서 경동맥을 따라 두개골로 정맥이 확장되면 정맥이 뒤틀리지 않도록 합니다. 그런 다음 헤파린화된 생리식염수를 사용하여 두개골 동맥절개술을 통해 경동맥과 정맥을 씻어냅니다. 다음으로, 두개골 동맥절개술의 꼬리 끝을 정맥 분절의 꼬리 끝까지 봉합하기 위해 첫 번째 바늘을 꿰매십시오.

그런 다음 첫 번째 스티치에서 180도 각도로 두 번째 스티치를 배치하여 두개골 동맥 절개술의 두개골 가장자리를 정맥 분절의 꼬리 끝까지 봉합합니다. 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 문합을 완료합니다. 정맥 이식편이 혈액으로 채워질 수 있도록 두개골 클립을 임시로 해제하고 마른 거즈로 부드러운 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.

문합에서 더 이상 출혈이 없을 때까지 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 두개골과 꼬리 클립을 모두 제거합니다. 거즈를 사용하여 문합에서 추가 출혈을 멈춥니다.

3-0 실크 봉합사를 사용하여 문합 사이의 총경동맥 분절의 양쪽 끝을 결찰합니다. 그런 다음 경동맥을 합자 사이의 중간으로 나눕니다. 정맥 이식편에서 활발한 맥동이 보여야 합니다.

왼쪽에서 정맥 이식 배치를 반복합니다. 5-0 PGA 봉합사로 연속적인 패턴으로 피하 조직을 닫습니다. 그런 다음 3-0 PGA 봉합사를 사용하여 피내 패턴으로 피부를 닫고 양쪽 끝의 매듭을 묻습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 수술 후 관리 및 경피적 초음파를 수행합니다. 유전자 이식 수술을 수행하려면 이식편에 인접한 경동맥 1.5-2cm를 포함한 두개골과 꼬리 양쪽의 오른쪽 정맥 이식편을 조심스럽게 분리하십시오. 같은 방법으로 왼쪽의 해부를 반복합니다.

음파를 전달할 수 있도록 오른쪽 수술 상처강을 채우기 위해 생리식염수를 사용합니다. 2mm 혈관 주위 유량 프로브를 체적 유량계에 연결하고 프로브를 상처 구멍의 식염수에 담그십시오. 유속을 0으로 설정합니다.

정맥 이식편에 대한 꼬리 또는 두개골의 경동맥 주위에 흐름 프로브를 놓습니다. 그런 다음 전자 데이터 수집 시스템을 사용하여 유량 프로브의 데이터를 기록합니다. IV 카테터를 통해 토끼에게 헤파린을 주입하고 식염수로 씻어낸 후 혈관 클립을 사용하여 정맥 이식편의 두개골 끝에 있는 총경동맥을 고정합니다.

그런 다음 두 번째 클립을 경동맥에 적용하고 꼬리 문합에서 꼬리 약 10mm를 사용하여 동맥 절개술을 위한 공간을 남겨둡니다. 그런 다음 정맥 이식편 바로 꼬리 부분의 경동맥 주위에 두 개의 실크 넥타이를 느슨하게 놓습니다. 다음으로, 미리 준비된 구부러진 21 게이지 바늘을 사용하여 경동맥 꼬리를 이식편에 뚫고 두개골만 꼬리 혈관 클립에 구멍을 뚫습니다.

바늘을 내강으로 앞뒤로 두 번 전진시켜 내강이 깨끗한지 확인합니다. 그런 다음 조심스럽게 바늘을 빼냅니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DMEM으로 주사기 및 IV 카테터를 준비한 후 일반 경동맥 절개술에 굴곡 지점까지 삽입하고 0.5ml의 DMEM을 2회 채워 정맥 이식 내강을 세척합니다.

장갑을 낀 손가락을 사용하여 이식편의 두개골 끝을 가볍게 눌러 이식편에서 DMEM을 제거합니다. 그런 다음 이식편을 따라 손가락을 이식편의 꼬리 끝 쪽으로 조심스럽게 밀어 동맥 절개술을 통해 내강 내용물을 씻어냅니다. 카테터에서 DMEM 주사기를 제거하고 카테터를 혈관에 남겨둡니다.

바이러스 용액이 들어 있는 주사기를 연결하여 카테터에 공기가 들어가지 않도록 합니다. 느슨하게 매듭진 실크 넥타이를 카테터 끝 주위가 될 때까지 동맥 아래로 이동하되 조이지 마십시오. 0.03ml의 바이러스 용액을 주입하여 카테터에 남아 있는 DMEM을 밀어냅니다.

그런 다음 손가락을 사용하여 정맥 이식 내강에서 모든 액체를 제거하고 두개골에서 꼬리로 부드럽게 누릅니다. 동맥과 카테터 끝을 둘러싼 두 개의 넥타이를 조여 내강을 밀봉합니다. 그런 다음 정맥이 팽창할 때까지 바이러스 용액을 주입합니다.

거즈 둥지 위에 주사기를 부드럽게 놓습니다. 20분 후 빈 주사기를 사용하여 이식편에서 바이러스가 포함된 용액을 혈관이 무너질 때까지 부드럽게 흡인합니다. 주사기를 제거하여 카테터를 제자리에 둡니다.

그런 다음 실크 봉합사를 자르고 풀고 혈관에서 카테터를 빼냅니다. 이제 X 패턴으로 7-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 동맥 절개술을 닫습니다. 그런 다음 봉합사 끝을 부드럽게 당겨 두 개의 사각형 매듭으로 묶습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 오른쪽 정맥 이식편에서 혈류를 회복한 후 왼쪽에서 바이러스 주입을 반복합니다. 형질도입된 이식편을 적출하기 위해, 정맥 이식편과 총경동맥을 절개하고 앞서 설명한 것처럼 왼쪽과 오른쪽 모두에서 흐름을 측정합니다. 3-0 실크 봉합사를 사용하여 이식편에 오른쪽 총경동맥 두개골을 접합합니다.

그런 다음 3-0 실크 봉합사를 사용하여 경동맥 꼬리를 이식편에 접합합니다. 각 결찰과 인접한 문합 사이의 인접한 경동맥을 나누어 오른쪽 정맥 이식편을 절제합니다. 그런 다음 토끼의 정맥 이식편을 제거하고 식염수를 사용하여 내강을 씻어냅니다.

새로운 시술자가 달성해야 하는 첫 번째 이정표는 초기 정맥 이식 수술과 후속 지연된 형질 도입 수술 후 일관된 정맥 이식 개통입니다. 정맥 이식편이 특허를 받은 경우, 초음파 검사는 꼬리에서 두개골 혈류가 활발한 큰 혈관을 드러낼 것입니다. 이식편은 형질도입 3일 후에 적출하여 절편으로 자르고 X-gal로 염색했습니다.

내강 표면의 En-face 이미징은 효율적인 형질도입과 불량한 형질주입을 가진 정맥 이식편을 보여주었습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, 새로운 조작자에 의해 형질도입된 정맥 이식편에서 베타 갈락토시다아제 mRNA의 수치는 숙련된 조작자에 의해 이식된 정맥 이식편에서 베타 갈락토시다아제 mRNA의 수치와 크게 다르지 않았습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 문합에 걸리기 전에 정맥 이식편 두개골을 꼬리로 역전시키는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이것은 정맥 덩어리에 의한 혈류 방해를 피하기 위해 필요합니다. 이러한 수술을 마스터하면 정맥 이식 절차의 경우 약 3시간, 정맥 이식 유전자 이식 절차의 경우 약 2시간, 채취 절차의 경우 45분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터와 날카로운 물체에 대한 작업을 필요로 하기 때문에 적절한 생물 안전성 및 날카로운 물건 절차를 따라야 한다는 것을 잊지 마십시오.