혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

이 방법은 체외에서 적절한 T-보조 모델을 구축하는 방법과 같은 구강암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재구성된 TSCC가 임상 TSCC 조직병리학과 매우 유사한 종양 특성을 발현한다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸을 때 2-D 배양 TSCC 세포가 TSCC의 기본 표현형을 제대로 나타내지 않는다는 것을 깨달았을 때.

또한, 암 생존 회피 및 분화를 위한 세포외 기질의 중요성을 깨달았습니다. 미니 생물반응기를 사용한 혀 세포 외 기질의 준비 및 3D 배양은 단어만으로는 배우기 어렵고 설명을 위해 보이는 것이 가장 좋기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 안락사된 쥐에서 혀를 분리한 후 조직을 75% 에탄올에 3분 동안 담그십시오.

그런 다음 각 혀를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브와 1mL의 10milliMolar 멸균 PBS로 옮깁니다. 세포 용해를 수행하려면 혀를 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 얼립니다. 그런 다음 실온에서 45분 동안 조직을 해동합니다.

동결/해동을 두 번 더 반복합니다. 다음으로, 75%에탄올이 함유된 3 1/2cm 또는 6cm 배양 접시에 수술용 바늘을 사용하여 각 혀를 수술용 봉합사 조각에 로드합니다. 그리고 작은 멸균 주석 호일 조각으로 봉합사 끝을 감쌉니다.

3 1/2cm 또는 6cm 배양 접시에 PBS 3ml를 사용하여 각 혀를 30초 동안 헹굽니다. 그런 다음 입이 넓은 병에 250ml의 멸균 초순수에 암피실린 밀리리터당 90마이크로그램을 준비하고 교반 막대를 추가합니다. 바닥에서 약 2cm 떨어질 때까지 5개의 혀를 병 안으로 내리고 봉합사의 일부가 병 밖에 남아 있도록 뚜껑을 조입니다.

병을 자석 교반기에 12시간 동안 올려 놓습니다. 그런 다음 배양 후 멸균 1 몰 염화나트륨에 암피실린 밀리리터당 250 마이크로그램 90 밀리리터를 준비합니다. 혀와 저어주는 바를 병에 옮기고 뚜껑을 조입니다.

자석 교반기에 병을 24시간 동안 올려 놓습니다. 세포 용해를 수행하려면 PBS에서 250ml의 멸균 2% TritonX-100에 암피실린 밀리리터당 90마이크로그램을 준비합니다. 혀와 젓는 막대를 병에 옮기고 뚜껑을 조입니다.

그런 다음 48시간 동안 병을 저어줍니다. 암피실린으로 염화칼슘과 염화마그네슘을 준비한 후 티슈와 교반 막대를 병에 넣고 24시간 동안 저어줍니다. 각 혀 샘플에 대해 하나의 마이크로 원심분리 튜브에 HBSS의 300 microMolar DNase 1ml를 준비합니다.

혀를 튜브로 옮기고 봉합사의 동일한 부분을 바깥쪽에 매달아 놓습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 24시간 동안 조직을 배양합니다. 샘플을 암피실린이 함유된 멸균 PBS의 넓은 입 병에 다시 옮기고 24시간 동안 교반기에 올려 놓습니다.

배양 후, 준비된 혀 세포외 기질(TEM)을 사용할 때까지 섭씨 4도의 멸균 PBS에 보관하십시오. TSCC 시드에 대한 정적 모델을 10에서 6번째 단일 Cal-27 세포를 3 1/2cm 배양 접시로 재구성합니다. 10%FBS를 함유한 DMEM F12 배지 3ml를 암피실린과 카나마이신을 각각 밀리리터당 90마이크로그램에 첨가합니다.

세포를 섭씨 37도에서 2-3일 동안 60% 포화도까지 배양합니다. 그런 다음 TEM을 배양 접시의 세포 단층에 로드합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 28일 동안 접시를 배양합니다.

매일 매체를 새로 고칩니다. 10 밀리리터 주사기에서 플런저를 제거하여 자체 제작 교반 미니 바이오 리액터를 준비합니다. 막대의 아래쪽 단자 근처에 직경 1cm의 구멍을 만들고 구멍을 통해 교반 막대를 로드합니다.

입이 넓은 플라스틱 병의 병 뚜껑 중앙에 직경 반 센티미터의 또 다른 구멍을 만들고 뚜껑을 통해 피스톤로드를 넣습니다. 그런 다음 50ml 원심분리기 튜브의 절반을 자르고 병 뚜껑 바깥쪽에 용접합니다. 낚싯바늘에 묶인 낚싯줄로 낚싯대를 감아 낚싯바늘을 낚싯대에 부착합니다.

동적 세포 배양을 준비하려면 미니 생물반응기에서 6번째 단일 Cal-27 세포에 10배 1배를 파종합니다. 10% FBS를 함유한 DF12 배지 150밀리리터와 암피실린과 카나마이신을 각각 밀리리터당 90마이크로그램을 추가합니다. 막대에 부착된 낚싯바늘을 사용하여 TEM을 미니 생물 반응기에 로드한 다음 병 뚜껑을 조입니다.

미니 생물 반응기를 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터의 자기 교반기에 놓습니다. 미니 바이오리액터를 200RPM으로 7일에서 14일 동안 활성화합니다. H 및 E 염색을 통해 이 비디오에서 입증된 프로토콜이 핵 염색이 완전히 사라지고 조직 무결성에 대한 드문 손상만 있는 토착 혀 조직에 비해 완벽한 탈세포화로 TEM을 생성하면서 세포 구성 요소를 제거했음을 확인했습니다.

이 그림에서 H 및 E 염색은 TEM과 자체 제작 미니 생물 반응기를 사용하여 TSCC를 3D 재구성한 결과 전형적인 TSCC 병리학적 특성을 생성했음을 보여줍니다. 교반 배양 조건의 세포는 서로 다른 병변 영역에서 단일 세포 이동 또는 집단 이동을 보여주었습니다. 정적 배양 조건에서 Cal-27 세포는 TEM에서 침습적 구조도 형성했지만 시간이 더 오래 걸렸습니다.

U2OS 세포는 배양 배지에서 살 수 있지만 TEM에서는 발견되지 않았으며, 이는 TEM이 특정 유형의 암세포와 생체 적합성을 가지며 다른 종양 세포가 번성하기 위해 다른 미세 환경이 필요하다는 것을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 멸균 상태에서 작동해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 구강암 분야의 연구자들이 세포외 기질 샘플에서 TSCC 세포의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 세포화된 혀 세포외 기질을 준비하고 TSCC의 체외 모델을 제작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.