May 21st, 2018
여기 우리는 복잡 한 형상의 설계 조직 히드로-기반 생산에 사용할 수 있는 사용자 지정입니다 금형 날조를 위한 신속 하 고, 손쉬운, 고 저가 방법 제시. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 생산 조작된 심장 조직에서 실시 하는 기계 및 조직학 평가 결과 설명 합니다.
이 방법은 조직 발달, 세포 정렬, 고분자 및 엔지니어링 조직의 기계적 분석과 관련된 조직 공학 분야의 연구를 촉진할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 사용하기 쉽고 빠르다는 것입니다. 우리는 이 분야에서 밀리미터 대 센티미터 규모로 조작된 조직의 기하학적 제어가 이루어지지 않았기 때문에 제 연구실에서 이 기술을 개발했으며, 조작된 조직의 크기를 확장하는 것에 대해 번역적으로 생각해야 할 필요성을 느꼈습니다.
이 기술을 사용하면 포스트와 다양한 모양을 사용하는 제작 기술을 통해 세포 생리학 및 엔지니어링 조직에 대한 기하학적 대기열의 이점을 활용할 수 있습니다. 이 방법은 크기, 모양 및 정렬이 제어된 엔지니어링 조직의 생산에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 다양한 질병 모델, 맞춤형 재생 의학 및 전임상 연구에 엔지니어링 조직을 변환하는 데 적용할 수 있습니다.
컴퓨터에서 벡터 그래픽 프로그램을 열어 시작합니다. 원하는 금형 형상 및 벡터 형식을 준비하려면 RGB 색상 형식으로 적절한 치수의 새 캔버스를 엽니다. 그런 다음 왼쪽 패널에서 모양 도구를 선택하고 창 상단에 치수를 입력하여 원하는 형상을 만들어 모양 크기를 정확하게 정의합니다.
가장 바깥쪽 피쳐의 가장자리에서 최소 6mm 경계가 허용되도록 금형 형상을 설계하고 금형 주조 후 PDMS 메니스커스를 트리밍할 수 있도록 절단선을 설계합니다. 이렇게 하면 완성된 주형이 배양 접시의 바닥과 같은 높이로 놓일 수 있습니다. 그런 다음 창의 왼쪽 상단 모서리에 있는 색상 선택기를 열고 레이저 절단기 소프트웨어와 호환되는 새 색상 견본을 정의합니다.
각 패스를 선택하고 잘라낸 견본에서 적절한 색상을 지정합니다. 완료되면 채우기 색상에 대해 없음을 지정합니다. 마찬가지로, 개체를 선택한 다음 채우기 색상에 대한 에칭 경로를 선택하고 색상 피커에서 경로 색상에 대해 없음을 선택하여 에칭 경로에 견본 색상을 할당합니다.
벡터 그래픽 프로그램 및 레이저 절단기에 적합한 형식에 따라 디자인을 ai or. pdf 파일 형식으로 저장합니다. 제조업체의 사양에 따라 절단을 위해 레이저 절단기를 준비하고 충분한 환기가 이루어지도록 하십시오.
그런 다음 1/4인치 아크릴 시트를 레이저 베드에 놓습니다. 아크릴에 맞게 적절하게 보정되도록 침대 높이를 조정하십시오. 그런 다음 레이저 절단기에 연결된 컴퓨터에서 디자인 파일을 열고 인쇄 메뉴를 엽니다.
레이저 절단기가 프린터로 설정되어 있고 배율 드롭다운 메뉴에서 배율 조정 안 함이 선택되어 있는지 확인하여 디자인의 왜곡을 방지합니다. 그런 다음 Printing 대화 상자의 아래쪽에 있는 Print 버튼을 클릭합니다. 레이저 절단기 인쇄 유틸리티에서 설정 버튼을 클릭하여 각 설계 기능에 대한 절단 에칭 매개변수를 설정합니다.
여기에서 이전에 선택한 각 색상에 대한 출력, 속도 및 인치당 펄스 매개변수를 설정합니다. 설정이 입력되면 레이저 절단기 소프트웨어에서 큰 녹색 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 레이저 절단기가 네거티브 마스터 몰드를 에칭하고 절단하기 시작합니다.
마지막으로 작은 브러시나 압축 공기를 사용하여 네거티브 마스터 몰드에 남아 있는 파편을 제거합니다. 이렇게 하면 PDMS 주조를 위한 표면이 준비됩니다. 제조업체의 사양에 따라 PDMS 주조 혼합물을 준비합니다.
표준 라인 진공 실험실에 연결된 진공 챔버에서 1시간 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 준비된 PDMS의 가스를 제거합니다. PDMS가 탈기되는 동안 비닐 또는 마스킹 테이프로 금형의 바깥쪽 가장자리를 가져와 테이프가 네거티브 마스터 몰드의 에칭된 면에서 최소 3mm 위로 확장되도록 합니다. 나중에 누출되지 않도록 테이프를 금형 측면에 단단히 누르십시오.
다음으로, PDMS가 최소 두께가 1.5mm에 도달하도록 PDMS를 제곱센티미터당 약 0.35밀리리터를 마스터 몰드에 붓습니다. PDMS 코팅된 네거티브 마스터 몰드를 진공 챔버에 놓고 1시간 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 다시 가스를 제거합니다. 그런 다음 가스가 제거된 PDMS 코팅된 네거티브 마스터 몰드를 섭씨 60도 오븐의 평평한 선반에 최소 6시간 동안 놓아 PDMS를 경화시킵니다.
경화되면 면도날을 사용하여 개별 금형이 음극 마스터 금형에 있는 동안 분리하십시오. 그런 다음 네거티브 마스터 몰드에서 각 PDMS 몰드를 천천히 조심스럽게 떼어냅니다. 반월판이 있는 모든 부분을 주조에서 제거하여 곰팡이가 평평하게 놓이는 것을 방지하고 과도한 재료나 파편을 제거하십시오.
마지막으로, 조직 배양을 위해 멸균하기 위해 표준 오토클레이브 사이클을 사용하여 금형을 오토클레이브합니다. 시작하려면 처리되지 않은 플라스틱 플레이트에 금형을 부착하십시오. 피브리노겐(fibrinogen), 트롬빈(thrombin) 및 중화된 콜라겐 용액을 준비하고 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원하는 세포를 수확합니다.
피브리노겐, 중화된 콜라겐 및 세포 현탁액을 결합하여 캐스팅 믹스를 만듭니다. 캐스팅 믹스를 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 휴대용 고주파 발생기를 사용하여 PDMS 소수성을 완화하기 위해 주조 혼합물에 노출될 금형 표면을 처리합니다.
재료를 주조하기 약 5분 전에 플라즈마 처리에 표면을 3-5초 노출시킵니다. 단백질 세포 혼합물을 주조하기 직전에 주조 혼합물에 트롬빈을 첨가하고 기포가 발생하지 않도록 부드럽게 위아래로 피펫을 낳습니다. 신속하게 작업하여 주조 혼합물을 금형에 피펫으로 주입하고 혼합물을 금형의 모든 모서리와 틈새에 넣으십시오.
구조체 내부에 기포 형성을 방지하기 위해 피펫의 첫 번째 정지 지점 너머로 혼합물을 배출하지 마십시오. 그런 다음 샘플을 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터에 45분 동안 넣습니다. 45분 후, 구조물을 후드에 다시 넣고 인큐베이터로 돌아가기 전에 세포 배지로 덮습니다.
세포 및 구성 유형에 필요한 만큼 48-72시간마다 세포 배지를 변경합니다. 마지막으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 구성물의 조직 압축 및 인장 특성을 정량화하고 다양한 염색 기술을 준비하고 세포 정렬을 측정합니다. 시간이 지남에 따라 세포화된 구조는 매트릭스 리모델링으로 인해 압축됩니다.
이는 주변 매트릭스의 재구성 및 저하를 통해 발생하며 일반적으로 기계적 강성의 증가와 관련이 있습니다. 지시된 압축은 또한 조직 내에서 응력장을 유도할 수 있으며, 이는 세포 정렬을 촉진하기 위해 세포화된 구조에서 조작할 수 있습니다. 이 두 이미지는 양쪽 끝에 기둥이 있는 3mm x 17mm 직사각형 주형에서 성장한 심장 조직 구조체에서 가져온 것입니다.
그리고 이 두 이미지는 제약 없이 성장한 심장 조직 구조입니다. 제약을 받은 두 가지 구조는 나머지 두 방향에서만 압축할 수 있었고 응력에 의한 세포 정렬로 이어졌습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 사용하여 하루 이내에 맞춤형 티슈 몰드를 설계, 제작 및 구현할 수 있습니다.
조직 형성 후에는 세포 형태 및 조직 기능에 대한 정렬의 영향을 더 잘 이해하기 위해 기계적 검사 및 조직학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 레이저 절단 아크릴 마스터에서 맞춤형 PDMS 티슈 몰드를 제작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 하이드로겔 기반의 조직 공학 조직을 생산하기 위한 사용자 정의 폴리디메틸실록산 금형을 제작하는 신속하고 저렴한 방법을 제시합니다. 이 기술은 조직 공학 조직의 기하학적 제어를 가능하게 하여 조직 개발 및 기계적 분석 연구를 용이하게 합니다.
Geometric control of engineered tissues enables precise modulation of cellular behavior and tissue mechanics, addressing a critical gap in preclinical model reproducibility. This low-cost, rapid fabrication method supports scalable production of shape-defined tissue constructs for mechanistic de-risking in early discovery. By providing reproducible microscale to centimeter-scale tissue molds, the technique enhances predictive confidence in downstream functional assays and translational decision-making.
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven tissue engineering to lead identification, providing geometrically controlled tissues that enable quantitative functional assessment prior to preclinical commitment.