Name: 오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 학습하세요 오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합을 높은 처리량으로 식별하는 기술을. 다제내성 감염 치료를 위한 신약 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 일 병 리의 부, J.C.S.B.에 유타 대학에서 시작 그랜트에 의해 지원 되었다

1. 식별 오버랩2 방법 (O2M)에 의해 화학 유전학 Dataset에서 시너지 예측 돌연변이
참고: 이것은 시너지 예측 돌연변이 니콜스 외에서 게시 된 데이터 집합을 사용 하 여 식별 하기 위한 방법입니다. 대장균에서 17 . 그러나,이 모든 화학 유전학 dataset 및 미생물에 수행할 수 있습니다. 이러한 데이터 세트의 녹아웃 돌연변이 100 개 이상의 작은 분자의 성장 각 작은 분자에 각 돌연변이 대 한 양적 성장 점수를 주는 라이브러리 포함 되어 있습니다. 1 개의 상승 쌍을 알고 있어야 합니다, 그리고 성장 점수는 데이터 집합에 포함 된 두 작은 분자에 대 한 되어야 합니다.
<ol><li>
모든 돌연변이 각 작은 분자의 단일 농도의 성장에 대 한 평균 성장 점수와 표준 편차를 계산 합니다. 참고:이 수행할 수 있는 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여. 브라운 실험실을 사용 하 여 Excel 기능 =AVERAGE(B3:B3981)와 작은 분자의 열 각의 계산에 대 한 =STDEV(B3:B3981).<ol>
<li>다른 데이터 집합을 사용 하는 경우이 방향이 다를 수 있지만 의미 및 작은 분자의 각 열에서 표준 편차를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>니콜스 외에서 동일한 데이터 집합을 사용 하 여 작은 분자의 각 농도 대 한 Z 점수를 계산 합니다. 스프레드시트 프로그램에서 17 . 이 대 한 음수 z 점수 Z(2.5) 것 = 의미-2.5 * 표준 편차, 그리고 긍정적인 z 점수 Z(2.5) 것 = 평균 + 2.5 * 표준 편차.</li>
	<li>어떤 유전자 돌연변이 포함 되 고 확실 하 게 그 분자의 모든 농도에서 알려진된 시너지 쌍을 구성 하는 작은 분자의 중요 한 Z 점수를 결정 합니다. 음수 Z (2.5) 보다는 작은 성장 돌연변이의 점수는 점수 또는 그 작은 분자에 대 한 긍정적인 Z (2.5) 점수 보다 큰, 그것은 중요 한 간주 됩니다.</li>
	<li>중요 한 유전자 돌연변이의 한 오 페론에 속하는 경우 결정 합니다. 참고: 대장균, 저자 추천 "Ecoli 위 키" 정보에 대 한 검사에 관한 유전자는 polycistronic RNA의 일환으로 복사할 경우.</li>
	<li>다른 농도 작은 분자의 대부분에 공통 된 유전자/오 페론 돌연변이 식별 (예. 항생제 trimethoprim와 synergize 분자 식별 표시 중요 한 Z 돌연변이 찾고 때, 점수 trimethoprim와 sulfamethizole 또는 sulfamethoxazole와 같은 알려진된 시너지 파트너의 성장 하는 때). 이들은 상 상속 시너지 예측 돌연변이입니다.</li>
</ol>2. 예측 O2M에 의해 화학 유전학 데이터 집합 내에서 Synergizers
<ol><li>데이터 집합17되돌립니다 시너지 예측 돌연변이에서 상당한 성장 점수를 elicits 작은 분자의 각 농도 식별 합니다. 이것은 작은 분자의 각 농도 대 한 계산 된 Z 점수 보고에 의해 이루어집니다. 다시 말하지만, 상당한 성장 점수는 부정적인 Z 점수 보다 보다 작거나 작은 분자의 그 농도 대 한 긍정적인 Z 점수입니다. 참고: 분자의 농도 중도에 나타납니다, 분자 예측된 synergizer를 간주 됩니다. 중요 한 성장 점수를 유도 하지 않는 어떤 분자 예측된 비-synergizer입니다.</li>
</ol>3입니다. 예측된 시너지 상호 작용의 유효성 검사
<ol><li>예측 된 synergizers의 최소 억제 농도 (MIC)를 찾는.
	<ol>
<li>37 ° c.에 M9 최소한의 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장 </li><li>&gt;</li><li><li> </li><li><li></li><li> </li><li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li><li> <img alt="FIC 지수 공식, 약물 상호작용 분석을 위한 방정식, 시너지 정량화 방법." src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li> </li><li><li><li><li><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li><li> </li><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li> </li><li><ol><li></ol></li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

시너지 작은 분자 쌍 미생물 감염을 치료에 강력한 도구가 될 수 있습니다 아직 시너지 쌍을 식별 하는 도전 때문에 그들은 그들의 전체 임상 잠재력을 도달 하지 않은. 이 문서에서는 간단한 없음을 조합 보다 훨씬 빠르게 상승 쌍을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 화학 유전학 데이터 집합을 사용 하 여 O2M 다음 시너지 쌍을 예측 하기 위해서는 화면 큰 라이브러리 작은 분자의 판독으로 사용 될 수 있는 유전자 knockouts와 돌연변이 식별 합니다. 작은 분자를 예측 하는 능력에 시너지 파트너의 대규모 식별에 게 스크린, 높은 확장성에 대 한 수 있습니다. 확인 후 시너지 쌍, 명료 하 게 하는 분자 메커니즘 기본 시너지 상호 작용, 다음 합리적으로 디자인 추가 시너지 쌍11수 하나.
O2M 화학 유전자 데이터 집합 및 알려진된 시너지 쌍을 필요합니다. 다행히, 화학 유전학 데이터 집합은 다양 한 미생물1...

항생제 내성 박테리아 발생할 2 백만 이상의 감염과 23000 죽음 매년 CDC1에 따르면 미국에서. 새로운 치료는 이러한 감염을 극복 하기 위해 필요 하다. 이러한 새로운 치료를 식별 하는 전략에는 새로운 항균 약물의 개발 이나 작은 분자 치료 미생물 감염2,,34다른 조건에 대 한 승인의 재사용 포함 됩니다. 그러나, 새로운 약물의 발견은 매우 비싸고 시간이 많이 소요. 마약을 재사용 소설 마약을 식별할 수 있습니다 또는 약물 대상5,6. 우리의 실험실 시너지 조합 치료로 알려진 세 번째 전략에 초점을 맞추고. 시너지 조합 두 작은 분자는 함께 그들의 개별 신진대사7의 첨가제 효과 보다는 효능을가지고 하는 경우 발생 합니다. 또한, 시너지 조합 큰 잠재적인8,9, 렌더링 덜 원치 않는 오프 대상 효과 이외 쌍에 있는 작은 분자 중에 병원 체 저항에 대 한 효과가 될 수 있습니다. 10.
시너지 쌍 드물다, 약물 조합11,,1213의 약 4-10%에서 발생. 따라서, 인덱스도 스크린 등 전통적인 기술 도전과 백 분자의 작은 도서관에서 잠재적인 조합의 수천 시간이 있습니다. 또한, 공동 성 상호 작용 일반적으로 예측할 수 없습니다 화합물14의 활동에서. 그러나, 저자 오버랩2 방법 (O2M)12라는 시너지 쌍에 대 한 화면에 대 한 높은 처리 접근을 개발 했다. 여기서 설명 하는이 방법을 이러한 시너지 쌍의 빠르고, 보다 효율적인 식별 수 있습니다. O2M 알려진된 시너지 쌍 및 화학 유전학 데이터 집합 사용을 해야합니다. 녹아웃 돌연변이의 도서관은 많은 다른 작은 분자의 성장 하는 때 화학 유전학 데이터 집합 생성 됩니다. 그 같은 돌연변이에서 표현 형을 elicits 다른 작은 분자 알려진의 각 멤버와 또한 synergize 해야 경우 알려진된 시너지 쌍에서 한 분자 두 번째 시너지 분자 처럼 특정 녹아웃 돌연변이에서 동일한 표현 형을 유도, 시너지 쌍입니다. 이 근거 시너지 항생제 쌍 대장균 (대장균) 에 대 한 활성 및 병원 성 균 류 Cryptococcus neoformans (c.에 대 한 활성 시너지 항진균 약물 쌍을 식별 하는 갈색 실험실에서 사용 되었습니다. neoformans)11,12. O2M만 다양 한 병원 균에 대 한 적응력은 하지만 쉽고 빠르게 상승 쌍을 확인 하려면 분자의 큰 도서관의 심사에 대 한 수 있습니다. O2M 식별 유전자 돌연변이와 심사 시너지에 대 한 예측만 그 작은 분자를 확인 하기 위해 수 있습니다. 따라서, 쌍 2000 분자 라이브러리를 테스트 걸릴 것 이라고 개월, 반면에 있던 경우에 20 분자 synergize 것으로 예측 하는 해당 라이브러리에서 일의 문제가 걸립니다 지금은 시너지에 대 한 테스트. O2M 프로그래밍 기술, 필요 하지 않습니다 이며 필요한 장비 대부분 연구소 나 핵심 시설에서 사용할 수 있습니다. 연구팀은 약물 조합에 관심이, 뿐만 아니라 O2M 분석 약 화면을 완료 하 고 중요 한 약물-약물 상호 작용을 식별 하 여 그들의 명 중을 확장 하 고 싶어 누가 누구에 게 관심입니다. 아래는 박테리아, 시너지 작은 분자 식별로 잘 알려진 분석15,16예측된 공동 성 상호 작용을 확인 프로토콜이입니다.

<table><tbody><tr><td>Bioscreen C</td><td>기기</td><td>성장 곡선 미국</td><td></td></tr><tr><td>시너지 H1</td><td>기기</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>M9 국물</td><td>시약</td><td>Amresco</td><td>J863-500G</td></tr><tr><td>카사미노 산</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-500</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시약</td><td>시그마</td><td>G7021-10KG</td></tr><tr><td>니코틴산</td><td>시약</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12683</td></tr><tr><td>티아민</td><td>시약</td><td>Acros Organics</td><td>148991000</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrate</td><td>시약</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td></tr><tr><td>MgSO4 Heptahydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td></tr><tr><td>chemical-genetics dataset</td><td>dataset</td><td>examplesexamples: Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014 등 본문에 인용되어 있습니다.</td><td></td></tr><tr><td>트리메토프림 (예시 입력 약물; 모든 약물 사용 가능)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19552701</td></tr><tr><td>설파메톡사졸 (예시 테스트 약물; 모든 사용 가능)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15671125</td></tr></tbody></table>

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

항균 약물 극적으로 증가 수명과 삶의 질20 세기에서 비록 항균 성 저항 조직의 감염을 치료 하는 우리의 전체 사회 능력을 위협 한다. 년 및 비용 추가 건강에 약 20 십억 달러는 미국에서 혼자, 항생제 내성 감염 약 23000 명 죽 일. 항균 성 저항에 대처 하기 위해 한 가지 방법은 조합 치료, 감염의 중요 한 초기 단계에 특히 유용 하다 전에 감염 유기 체와 약물 저항 프로필 확인 되었습니다입니다. 많은 항균 성 치료는 조합 치료를 사용합니다. 그러나,이 조합은 대부분의 첨가물, 결합 된 효능은 개별 항생제 효능의 합계와 같은 의미. 일부 조합 치료는 시너지: 결합 된 효능 첨가제 보다 훨씬 큽니다. 때문에 그들은 항균 약물 저항 종자의 성장을 억제할 수 있는 시너지 조합은 특히 유용 합니다. 그러나, 이러한 조합은 희귀 하 고 식별 하기 어려운 있습니다. 이것은 없음을 방식으로 테스트 하는 데 필요한 분자의 완전 한 숫자 때문 이다: 1000 분자의 도서관은 1 백만 잠재적인 조합. 따라서, 시너지 효과 대 한 분자를 예측 하기 위해 노력 되었습니다. 이 문서에서는 중복2 방법 (O2M)로 알려진 시너지 작은 분자 쌍을 예측에 대 한 우리의 높은 처리량 방법. O2M 화학 유전자 데이터 집합에서 사용 하 여 과민 시너지 쌍에서 각 분자를 하지만 다른 분자는 돌연변이 식별. 브라운 실험실 돌연변이 하지 야생-타입 세포의 성장을 억제 하는 분자에 대 한 높은 처리 화면을 수행 하 여이 성장 차이 이용 한다. 실험실의 작업은 이전 항생제 trimethoprim와이 전략을 사용 하 여 항진균 약물 fluconazole synergize 분자 식별. 여기, 저자 여러 미생물에 대 한 변경 될 수 있습니다 새로운 시너지 조합에 대 한 화면을 방법 제시.

바둑판 분석 실험은 공동 성 상호 작용을 측정 하기 위한 반 정량 방법. 최종 점수 출력, FICI, 결정 약물 조합 시너지 (FICI ≤0.5)으로 간주 됩니다, 만약 비-상호 작용 (0.5 &lt; FICI &lt; 4), 또는 대립 (FICI ≥4.0). 그림 1 에 바둑판 분석 결과에서 마약 그라디언트를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 일반적인 결과를 보여 줍니다. 성장을 (보라색 우물) 90% 성장 억제 보다 적게 표시 하는 것이 좋습니다. 각 접시에서의 OD600 , 측정 후 우리 정상화는 마약 통제에 모든 잘. 정규화 된 값으로 아무것도 &gt; 0.1 (10% 잘 컨트롤의 OD600 의) "성장"으로 점수입니다. FICI 점수 다를 수 있습니다에 따라 잘 고른 이다; 우리는 각 접시에 대 한 낮은...

시너지 마약 조합은 어렵고 경험적으로 확인할 수 있다. 여기, 우리는 식별 하 고 시너지 작은 분자를 확인 하는 방법을 설명 합니다.

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

이 방법론의 전반적인 목표는 고처리량 스크리닝을 통해 결합될 때 서로의 활성을 증폭하는 시너지 분자를 식별하는 것입니다. 시너지 효과(synergistic drug pairs)는 약물 내성 감염을 퇴치하기 위한 유망한 전략이지만 식별하기가 어렵습니다. 이 방법은 감염성 질환을 치료하는 데 사용되는 기존 항균제와 상호 작용하는 분자를 식별할 수 있습니다.장기적으로 이러한 조합은 전임상 평가에 들어갈 수 있으며 궁극적으로 환자 치료를 개선할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 있는 모든 유기체와 작은 분자의 모든 라이브러리로 수행할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 관심 있는 모든 유기체와 함께 작동하기 때문에 여러 감염성 질병의 치료로 확장됩니다.표준 스프레드시트를 사용하여 추가된 작은 분자의 특정 농도가 있는 경우 모든 돌연변이에 대한 평균 성장 점수와 표준 편차를 계산합니다. 그런 다음 각 소분자 농도에 대한 Z 점수를 계산합니다. 그런 다음 유의미한 Z 점수를 가진 유전자 돌연변이를 강조 표시합니다.먼저, 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 M9 최소 배지에서 대장균 배양을 성장시킵니다. 그런 다음 작은 분자를 디메틸 설폭사이드에 10밀리리터 이상의 고농도로 용해시킵니다. 다음으로, 100 웰 플레이트의 각 웰에 9 마이크로리터의 M9 매체를 추가합니다.컬럼 1에 추가로 100마이크로리터의 M9 매체를 피펫팅하여 해당 컬럼의 부피가 200마이크로리터가 되도록 합니다. 그런 다음 약 10마이크로리터의 농축된 소분자 용액을 컬럼 1에 추가합니다. 작은 분자를 첨가한 후 플레이트의 X축을 가로질러 희석하기 시작합니다.컬럼 11에 100마이크로리터가 있을 때까지 계속 희석합니다. 컬럼 11을 혼합한 후 해당 컬럼에서 100마이크로리터를 버립니다. 데이터를 정규화하기 위해 열 12에 매체만 있도록 합니다.다음으로, M9 최소 배지에서 성장한 하룻밤 배양의 600나노미터에서 광학 밀도 값을 기록합니다. 그런 다음 각 웰에 2마이크로리터의 배양액을 추가합니다. 웰당 1000개의 셀이 있습니다.그런 다음 접시를 부드럽게 흔듭니다. 그리고 0시간 시점에 대해 600나노미터에서 판독되는 광학 밀도에 주목하십시오. 판독값이 기록되면 하루 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.다시 말하지만, 24시간 동안 600나노미터에서 광학 밀도 값을 측정합니다. 바둑판 분석을 수행하려면 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 M9 최소 배

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

이 프로토콜에서 우리가 어떻게 베 가산 기반 약물 상호 작용 측정 쌍 및 3 방향 약물 조합을 설명 합니다.

약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

이 프로토콜 Chou와 Talalay 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 항 체와 전 임상 모델에서 antineoplastic 마약 성분 평가 하는 방법을 설명 합니다.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

항균 시너지 테스트 조합에 사용 되는 두 개 이상의 항생제의 효과 평가 하는 데 사용 하 고는 일반적으로 두 가지 방법 중 하나에 의해 수행: 바둑판 배열 또는 시간 죽 일 분석 결과. 여기, 우리는 자동화 된, 잉크젯 프린터 기반 바둑판 배열 시너지 기술 및 고전적인 시간 죽이기 시너지 연구 제시.

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

모형 유기체에 있는 큰 유전 스크린은 부정적인 유전 상호 작용의 확인으로 이끌어 냈습니다. 여기에서는 모델 유기체의 유전 화면에서 데이터를 사용하여 암에 있는 합성 치명적인 상호 작용을 표적으로 하는 약물 조합을 설명하는 데이터 통합 워크플로우를 설명합니다.

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

이 프로토콜은 하나의 실험에서 4개의 약 사이에서 얻을 수 있는 모든 가능한 조합을 공부하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 결과를 평가하기 위해 표준 96-웰 플레이트 마이크로 희석 분석 및 분수 억제 농도(FIC)의 계산을 기반으로 한다.

쿼드러플-체커보드: 약물 조합을 연구하기 위한 3차원 체커보드 수정

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

온도에 민감한(ts) 치명적인 돌연변이는 필수 기능을 식별하고 분석하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 높은 처리량으로 ts의 치명적인 돌연변이를 생성하고 분류하는 방법을 설명합니다.

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

학습하세요 오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합을 높은 처리량으로 식별하는 기술을. 다제내성 감염 치료를 위한 신약 개발에 활용할 수 있습니다.

오버랩² 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

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