Name: 오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 학습하세요 오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합을 높은 처리량으로 식별하는 기술을. 다제내성 감염 치료를 위한 신약 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 일 병 리의 부, J.C.S.B.에 유타 대학에서 시작 그랜트에 의해 지원 되었다

1. 식별 오버랩2 방법 (O2M)에 의해 화학 유전학 Dataset에서 시너지 예측 돌연변이
참고: 이것은 시너지 예측 돌연변이 니콜스 외에서 게시 된 데이터 집합을 사용 하 여 식별 하기 위한 방법입니다. 대장균에서 17 . 그러나,이 모든 화학 유전학 dataset 및 미생물에 수행할 수 있습니다. 이러한 데이터 세트의 녹아웃 돌연변이 100 개 이상의 작은 분자의 성장 각 작은 분자에 각 돌연변이 대 한 양적 성장 점수를 주는 라이브러리 포함 되어 있습니다. 1 개의 상승 쌍을 알고 있어야 합니다, 그리고 성장 점수는 데이터 집합에 포함 된 두 작은 분자에 대 한 되어야 합니다.
<ol><li>
모든 돌연변이 각 작은 분자의 단일 농도의 성장에 대 한 평균 성장 점수와 표준 편차를 계산 합니다. 참고:이 수행할 수 있는 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여. 브라운 실험실을 사용 하 여 Excel 기능 =AVERAGE(B3:B3981)와 작은 분자의 열 각의 계산에 대 한 =STDEV(B3:B3981).<ol>
<li>다른 데이터 집합을 사용 하는 경우이 방향이 다를 수 있지만 의미 및 작은 분자의 각 열에서 표준 편차를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>니콜스 외에서 동일한 데이터 집합을 사용 하 여 작은 분자의 각 농도 대 한 Z 점수를 계산 합니다. 스프레드시트 프로그램에서 17 . 이 대 한 음수 z 점수 Z(2.5) 것 = 의미-2.5 * 표준 편차, 그리고 긍정적인 z 점수 Z(2.5) 것 = 평균 + 2.5 * 표준 편차.</li>
	<li>어떤 유전자 돌연변이 포함 되 고 확실 하 게 그 분자의 모든 농도에서 알려진된 시너지 쌍을 구성 하는 작은 분자의 중요 한 Z 점수를 결정 합니다. 음수 Z (2.5) 보다는 작은 성장 돌연변이의 점수는 점수 또는 그 작은 분자에 대 한 긍정적인 Z (2.5) 점수 보다 큰, 그것은 중요 한 간주 됩니다.</li>
	<li>중요 한 유전자 돌연변이의 한 오 페론에 속하는 경우 결정 합니다. 참고: 대장균, 저자 추천 "Ecoli 위 키" 정보에 대 한 검사에 관한 유전자는 polycistronic RNA의 일환으로 복사할 경우.</li>
	<li>다른 농도 작은 분자의 대부분에 공통 된 유전자/오 페론 돌연변이 식별 (예. 항생제 trimethoprim와 synergize 분자 식별 표시 중요 한 Z 돌연변이 찾고 때, 점수 trimethoprim와 sulfamethizole 또는 sulfamethoxazole와 같은 알려진된 시너지 파트너의 성장 하는 때). 이들은 상 상속 시너지 예측 돌연변이입니다.</li>
</ol>2. 예측 O2M에 의해 화학 유전학 데이터 집합 내에서 Synergizers
<ol><li>데이터 집합17되돌립니다 시너지 예측 돌연변이에서 상당한 성장 점수를 elicits 작은 분자의 각 농도 식별 합니다. 이것은 작은 분자의 각 농도 대 한 계산 된 Z 점수 보고에 의해 이루어집니다. 다시 말하지만, 상당한 성장 점수는 부정적인 Z 점수 보다 보다 작거나 작은 분자의 그 농도 대 한 긍정적인 Z 점수입니다. 참고: 분자의 농도 중도에 나타납니다, 분자 예측된 synergizer를 간주 됩니다. 중요 한 성장 점수를 유도 하지 않는 어떤 분자 예측된 비-synergizer입니다.</li>
</ol>3입니다. 예측된 시너지 상호 작용의 유효성 검사
<ol><li>예측 된 synergizers의 최소 억제 농도 (MIC)를 찾는.
	<ol>
<li>37 ° c.에 M9 최소한의 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장 </li><li>&gt;</li><li><li> </li><li><li></li><li> </li><li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li><li> <img alt="FIC 지수 공식, 약물 상호작용 분석을 위한 방정식, 시너지 정량화 방법." src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li> </li><li><li><li><li><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li><li> </li><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li> </li><li><ol><li></ol></li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

시너지 작은 분자 쌍 미생물 감염을 치료에 강력한 도구가 될 수 있습니다 아직 시너지 쌍을 식별 하는 도전 때문에 그들은 그들의 전체 임상 잠재력을 도달 하지 않은. 이 문서에서는 간단한 없음을 조합 보다 훨씬 빠르게 상승 쌍을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 화학 유전학 데이터 집합을 사용 하 여 O2M 다음 시너지 쌍을 예측 하기 위해서는 화면 큰 라이브러리 작은 분자의 판독으로 사용 될 수 있는 유전자 knockouts와 돌연변이 식별 합니다. 작은 분자를 예측 하는 능력에 시너지 파트너의 대규모 식별에 게 스크린, 높은 확장성에 대 한 수 있습니다. 확인 후 시너지 쌍, 명료 하 게 하는 분자 메커니즘 기본 시너지 상호 작용, 다음 합리적으로 디자인 추가 시너지 쌍11수 하나.
O2M 화학 유전자 데이터 집합 및 알려진된 시너지 쌍을 필요합니다. 다행히, 화학 유전학 데이터 집합은 다양 한 미생물1...

항생제 내성 박테리아 발생할 2 백만 이상의 감염과 23000 죽음 매년 CDC1에 따르면 미국에서. 새로운 치료는 이러한 감염을 극복 하기 위해 필요 하다. 이러한 새로운 치료를 식별 하는 전략에는 새로운 항균 약물의 개발 이나 작은 분자 치료 미생물 감염2,,34다른 조건에 대 한 승인의 재사용 포함 됩니다. 그러나, 새로운 약물의 발견은 매우 비싸고 시간이 많이 소요. 마약을 재사용 소설 마약을 식별할 수 있습니다 또는 약물 대상5,6. 우리의 실험실 시너지 조합 치료로 알려진 세 번째 전략에 초점을 맞추고. 시너지 조합 두 작은 분자는 함께 그들의 개별 신진대사7의 첨가제 효과 보다는 효능을가지고 하는 경우 발생 합니다. 또한, 시너지 조합 큰 잠재적인8,9, 렌더링 덜 원치 않는 오프 대상 효과 이외 쌍에 있는 작은 분자 중에 병원 체 저항에 대 한 효과가 될 수 있습니다. 10.
시너지 쌍 드물다, 약물 조합11,,1213의 약 4-10%에서 발생. 따라서, 인덱스도 스크린 등 전통적인 기술 도전과 백 분자의 작은 도서관에서 잠재적인 조합의 수천 시간이 있습니다. 또한, 공동 성 상호 작용 일반적으로 예측할 수 없습니다 화합물14의 활동에서. 그러나, 저자 오버랩2 방법 (O2M)12라는 시너지 쌍에 대 한 화면에 대 한 높은 처리 접근을 개발 했다. 여기서 설명 하는이 방법을 이러한 시너지 쌍의 빠르고, 보다 효율적인 식별 수 있습니다. O2M 알려진된 시너지 쌍 및 화학 유전학 데이터 집합 사용을 해야합니다. 녹아웃 돌연변이의 도서관은 많은 다른 작은 분자의 성장 하는 때 화학 유전학 데이터 집합 생성 됩니다. 그 같은 돌연변이에서 표현 형을 elicits 다른 작은 분자 알려진의 각 멤버와 또한 synergize 해야 경우 알려진된 시너지 쌍에서 한 분자 두 번째 시너지 분자 처럼 특정 녹아웃 돌연변이에서 동일한 표현 형을 유도, 시너지 쌍입니다. 이 근거 시너지 항생제 쌍 대장균 (대장균) 에 대 한 활성 및 병원 성 균 류 Cryptococcus neoformans (c.에 대 한 활성 시너지 항진균 약물 쌍을 식별 하는 갈색 실험실에서 사용 되었습니다. neoformans)11,12. O2M만 다양 한 병원 균에 대 한 적응력은 하지만 쉽고 빠르게 상승 쌍을 확인 하려면 분자의 큰 도서관의 심사에 대 한 수 있습니다. O2M 식별 유전자 돌연변이와 심사 시너지에 대 한 예측만 그 작은 분자를 확인 하기 위해 수 있습니다. 따라서, 쌍 2000 분자 라이브러리를 테스트 걸릴 것 이라고 개월, 반면에 있던 경우에 20 분자 synergize 것으로 예측 하는 해당 라이브러리에서 일의 문제가 걸립니다 지금은 시너지에 대 한 테스트. O2M 프로그래밍 기술, 필요 하지 않습니다 이며 필요한 장비 대부분 연구소 나 핵심 시설에서 사용할 수 있습니다. 연구팀은 약물 조합에 관심이, 뿐만 아니라 O2M 분석 약 화면을 완료 하 고 중요 한 약물-약물 상호 작용을 식별 하 여 그들의 명 중을 확장 하 고 싶어 누가 누구에 게 관심입니다. 아래는 박테리아, 시너지 작은 분자 식별로 잘 알려진 분석15,16예측된 공동 성 상호 작용을 확인 프로토콜이입니다.

<table><tbody><tr><td>Bioscreen C</td><td>기기</td><td>성장 곡선 미국</td><td></td></tr><tr><td>시너지 H1</td><td>기기</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>M9 국물</td><td>시약</td><td>Amresco</td><td>J863-500G</td></tr><tr><td>카사미노 산</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-500</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시약</td><td>시그마</td><td>G7021-10KG</td></tr><tr><td>니코틴산</td><td>시약</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12683</td></tr><tr><td>티아민</td><td>시약</td><td>Acros Organics</td><td>148991000</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrate</td><td>시약</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td></tr><tr><td>MgSO4 Heptahydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td></tr><tr><td>chemical-genetics dataset</td><td>dataset</td><td>examplesexamples: Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014 등 본문에 인용되어 있습니다.</td><td></td></tr><tr><td>트리메토프림 (예시 입력 약물; 모든 약물 사용 가능)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19552701</td></tr><tr><td>설파메톡사졸 (예시 테스트 약물; 모든 사용 가능)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15671125</td></tr></tbody></table>

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

항균 약물 극적으로 증가 수명과 삶의 질20 세기에서 비록 항균 성 저항 조직의 감염을 치료 하는 우리의 전체 사회 능력을 위협 한다. 년 및 비용 추가 건강에 약 20 십억 달러는 미국에서 혼자, 항생제 내성 감염 약 23000 명 죽 일. 항균 성 저항에 대처 하기 위해 한 가지 방법은 조합 치료, 감염의 중요 한 초기 단계에 특히 유용 하다 전에 감염 유기 체와 약물 저항 프로필 확인 되었습니다입니다. 많은 항균 성 치료는 조합 치료를 사용합니다. 그러나,이 조합은 대부분의 첨가물, 결합 된 효능은 개별 항생제 효능의 합계와 같은 의미. 일부 조합 치료는 시너지: 결합 된 효능 첨가제 보다 훨씬 큽니다. 때문에 그들은 항균 약물 저항 종자의 성장을 억제할 수 있는 시너지 조합은 특히 유용 합니다. 그러나, 이러한 조합은 희귀 하 고 식별 하기 어려운 있습니다. 이것은 없음을 방식으로 테스트 하는 데 필요한 분자의 완전 한 숫자 때문 이다: 1000 분자의 도서관은 1 백만 잠재적인 조합. 따라서, 시너지 효과 대 한 분자를 예측 하기 위해 노력 되었습니다. 이 문서에서는 중복2 방법 (O2M)로 알려진 시너지 작은 분자 쌍을 예측에 대 한 우리의 높은 처리량 방법. O2M 화학 유전자 데이터 집합에서 사용 하 여 과민 시너지 쌍에서 각 분자를 하지만 다른 분자는 돌연변이 식별. 브라운 실험실 돌연변이 하지 야생-타입 세포의 성장을 억제 하는 분자에 대 한 높은 처리 화면을 수행 하 여이 성장 차이 이용 한다. 실험실의 작업은 이전 항생제 trimethoprim와이 전략을 사용 하 여 항진균 약물 fluconazole synergize 분자 식별. 여기, 저자 여러 미생물에 대 한 변경 될 수 있습니다 새로운 시너지 조합에 대 한 화면을 방법 제시.

바둑판 분석 실험은 공동 성 상호 작용을 측정 하기 위한 반 정량 방법. 최종 점수 출력, FICI, 결정 약물 조합 시너지 (FICI ≤0.5)으로 간주 됩니다, 만약 비-상호 작용 (0.5 &lt; FICI &lt; 4), 또는 대립 (FICI ≥4.0). 그림 1 에 바둑판 분석 결과에서 마약 그라디언트를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 일반적인 결과를 보여 줍니다. 성장을 (보라색 우물) 90% 성장 억제 보다 적게 표시 하는 것이 좋습니다. 각 접시에서의 OD600 , 측정 후 우리 정상화는 마약 통제에 모든 잘. 정규화 된 값으로 아무것도 &gt; 0.1 (10% 잘 컨트롤의 OD600 의) "성장"으로 점수입니다. FICI 점수 다를 수 있습니다에 따라 잘 고른 이다; 우리는 각 접시에 대 한 낮은...

시너지 마약 조합은 어렵고 경험적으로 확인할 수 있다. 여기, 우리는 식별 하 고 시너지 작은 분자를 확인 하는 방법을 설명 합니다.

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

이 방법론의 전반적인 목표는 고처리량 스크리닝을 통해 결합될 때 서로의 활성을 증폭하는 시너지 분자를 식별하는 것입니다. 시너지 효과(synergistic drug pairs)는 약물 내성 감염을 퇴치하기 위한 유망한 전략이지만 식별하기가 어렵습니다. 이 방법은 감염성 질환을 치료하는 데 사용되는 기존 항균제와 상호 작용하는 분자를 식별할 수 있습니다.장기적으로 이러한 조합은 전임상 평가에 들어갈 수 있으며 궁극적으로 환자 치료를 개선할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 있는 모든 유기체와 작은 분자의 모든 라이브러리로 수행할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 관심 있는 모든 유기체와 함께 작동하기 때문에 여러 감염성 질병의 치료로 확장됩니다.표준 스프레드시트를 사용하여 추가된 작은 분자의 특정 농도가 있는 경우 모든 돌연변이에 대한 평균 성장 점수와 표준 편차를 계산합니다. 그런 다음 각 소분자 농도에 대한 Z 점수를 계산합니다. 그런 다음 유의미한 Z 점수를 가진 유전자 돌연변이를 강조 표시합니다.먼저, 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 M9 최소 배지에서 대장균 배양을 성장시킵니다. 그런 다음 작은 분자를 디메틸 설폭사이드에 10밀리리터 이상의 고농도로 용해시킵니다. 다음으로, 100 웰 플레이트의 각 웰에 9 마이크로리터의 M9 매체를 추가합니다.컬럼 1에 추가로 100마이크로리터의 M9 매체를 피펫팅하여 해당 컬럼의 부피가 200마이크로리터가 되도록 합니다. 그런 다음 약 10마이크로리터의 농축된 소분자 용액을 컬럼 1에 추가합니다. 작은 분자를 첨가한 후 플레이트의 X축을 가로질러 희석하기 시작합니다.컬럼 11에 100마이크로리터가 있을 때까지 계속 희석합니다. 컬럼 11을 혼합한 후 해당 컬럼에서 100마이크로리터를 버립니다. 데이터를 정규화하기 위해 열 12에 매체만 있도록 합니다.다음으로, M9 최소 배지에서 성장한 하룻밤 배양의 600나노미터에서 광학 밀도 값을 기록합니다. 그런 다음 각 웰에 2마이크로리터의 배양액을 추가합니다. 웰당 1000개의 셀이 있습니다.그런 다음 접시를 부드럽게 흔듭니다. 그리고 0시간 시점에 대해 600나노미터에서 판독되는 광학 밀도에 주목하십시오. 판독값이 기록되면 하루 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.다시 말하지만, 24시간 동안 600나노미터에서 광학 밀도 값을 측정합니다. 바둑판 분석을 수행하려면 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 M9 최소 배지에서 대장균 배양을 성장시킵니다. 그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 M9 매체를 추가하고 96웰 플레이트의 컬럼 1에 동일한 매체 100마이크로리터를 추가로 추가합니다.다음으로, 1열의 각 웰에 테스트 작은 분자를 추가합니다. 그리고 A1 우물에 농도를 두 배로 첨가하십시오. 그런 다음 1열에서 2열로 100마이크로리터를 이동하여 X축을 따라 희석 구배를 만듭니다. 100마이크로리터가 컬럼 11에 추가될 때까지 희석 공정을 계속합니다.컬럼 11을 혼합한 후 해당 컬럼에서 100마이크로리터를 버리고 컬럼 12에 약물 없이 매체만 남겨둡니다. 두 번째 약물 희석을 위한 또 다른 그래디언트를 생성합니다. 이렇게하기 위해, 2 개의 X, 행 A.에 입력 분자의 최소 억제 농도를 포함하는 매체의 100 마이크로 리터를 추가하십시오.그런 다음, 100 마이크로 리터가 행 G.에 추가 될 때까지 행 A에서 B.로 100 마이크로 리터를 옮깁니다.행 G를 혼합 한 후, 우물에서 100 마이크로 리터를 버리십시오.그런 다음 플레이트에 2마이크로리터의 배양액을 각 웰에 접종합니다. 웰당 1000개의 셀이 있습니다. 그런 다음 0시간 시점에 대해 600나노미터에서 광학 밀도 판독값을 측정합니다.판독값이 기록되면 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 24시간 동안 600나노미터에서 광학 밀도 값을 측정합니다. 고처리량 스크리닝을 수행하기 위해 시너지 약물에 대해 야생형 및 시너지 예측 돌연변이 세포를 M9 최소 배지에서 배양합니다.그런 다음 라이브러리의 약물을 배지에 추가합니다. 다음으로, 라이브러리 약물 한 플레이트에 야생형을 접종하고 다른 한 플레이트에 시너지 예측 돌연변이 박테리아를 접종합니다. 이 플레이트는 시너지 약물 조합을 조사하는 데 사용되는 바둑판 분석을 나타냅니다.이 플레이트에서 FICI 점수가 0.07로 가장 낮은 F9는 소분자쌍이 상승 작용을 나타낸다는 것을 나타냅니다. 이 플레이트는 비상호 작용 약물 조합을 조사하기 위한 바둑판 분석을 나타냅니다. 이 플레이트에서 FICI 점수가 1.0으로 가장 낮은 웰 C3는 소분자 쌍이 서로 상호 작용하지 않음을 나타냅니다.이 플레이트는 길항제 약물 조합을 조사하는 데 사용되는 바둑판 분석법을 나타냅니다. 이 플레이트에서 FICI 점수가 8.0으로 가장 낮은 A1은 약물 분자 간의 상호 작용이 길항적임을 나타냅니다. 다음으로 플루코나졸의 소분자 약물인 베펠딘 A는 C 및 U 포르민의 성장을 연구하는 데 사용됩니다.이 그래프는 야생형과 시너지 예측 돌연변이의 성장이 모두 약간 그리고 같은 정도로 억제되어 있음을 보여줍니다. 이는 Befeldin A와 Fluconazole이 비시너지 약물 파트너임을 나타냅니다. 반대로, C와 U 포르민의 시너지 예측 돌연변이의 성장은 레프로미신(Refromisyn)과 플루코나졸(Fluconazole)의 존재 하에서 현저히 억제된다.약물이 시너지 파트너임을 나타냅니다. 흥미롭게도, 야생형의 성장은 전혀 억제되지 않는다. 여기에서 가장 큰 성장 차이는 접종 후 32시간에서 49시간 사이에 관찰됩니다.이 기술을 완전히 익히면 시너지 효과를 내는 약물 상호작용을 식별하는 시간을 단축할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 바둑판 분석의 마지막 행에 있는 마지막 열에 있는 약물을 결합하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 추가적인 시너지 약물 상호 작용을 확인하기 위해 다른 시너지 분자 식별 방법을 수행할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 관심 유기체와의 시너지 약물 상호 작용을 찾기 위해 O2M 방법론을 사용하여 추정되는 시너지 마커를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일부 작은 분자로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 MSDS의 모든 예방 조치를 이 프로토콜을 수행하는 동안 따라야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

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높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

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약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

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