오버랩² 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

이 방법론의 전반적인 목표는 고처리량 스크리닝을 통해 결합될 때 서로의 활성을 증폭하는 시너지 분자를 식별하는 것입니다. 시너지 효과(synergistic drug pairs)는 약물 내성 감염을 퇴치하기 위한 유망한 전략이지만 식별하기가 어렵습니다. 이 방법은 감염성 질환을 치료하는 데 사용되는 기존 항균제와 상호 작용하는 분자를 식별할 수 있습니다.

장기적으로 이러한 조합은 전임상 평가에 들어갈 수 있으며 궁극적으로 환자 치료를 개선할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 있는 모든 유기체와 작은 분자의 모든 라이브러리로 수행할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 관심 있는 모든 유기체와 함께 작동하기 때문에 여러 감염성 질병의 치료로 확장됩니다.

표준 스프레드시트를 사용하여 추가된 작은 분자의 특정 농도가 있는 경우 모든 돌연변이에 대한 평균 성장 점수와 표준 편차를 계산합니다. 그런 다음 각 소분자 농도에 대한 Z 점수를 계산합니다. 그런 다음 유의미한 Z 점수를 가진 유전자 돌연변이를 강조 표시합니다.

먼저, 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 M9 최소 배지에서 대장균 배양을 성장시킵니다. 그런 다음 작은 분자를 디메틸 설폭사이드에 10밀리리터 이상의 고농도로 용해시킵니다. 다음으로, 100 웰 플레이트의 각 웰에 9 마이크로리터의 M9 매체를 추가합니다.

컬럼 1에 추가로 100마이크로리터의 M9 매체를 피펫팅하여 해당 컬럼의 부피가 200마이크로리터가 되도록 합니다. 그런 다음 약 10마이크로리터의 농축된 소분자 용액을 컬럼 1에 추가합니다. 작은 분자를 첨가한 후 플레이트의 X축을 가로질러 희석하기 시작합니다.

컬럼 11에 100마이크로리터가 있을 때까지 계속 희석합니다. 컬럼 11을 혼합한 후 해당 컬럼에서 100마이크로리터를 버립니다. 데이터를 정규화하기 위해 열 12에 매체만 있도록 합니다.

다음으로, M9 최소 배지에서 성장한 하룻밤 배양의 600나노미터에서 광학 밀도 값을 기록합니다. 그런 다음 각 웰에 2마이크로리터의 배양액을 추가합니다. 웰당 1000개의 셀이 있습니다.

그런 다음 접시를 부드럽게 흔듭니다. 그리고 0시간 시점에 대해 600나노미터에서 판독되는 광학 밀도에 주목하십시오. 판독값이 기록되면 하루 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.

다시 말하지만, 24시간 동안 600나노미터에서 광학 밀도 값을 측정합니다. 바둑판 분석을 수행하려면 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 M9 최소 배지에서 대장균 배양을 성장시킵니다. 그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 M9 매체를 추가하고 96웰 플레이트의 컬럼 1에 동일한 매체 100마이크로리터를 추가로 추가합니다.

다음으로, 1열의 각 웰에 테스트 작은 분자를 추가합니다. 그리고 A1 우물에 농도를 두 배로 첨가하십시오. 그런 다음 1열에서 2열로 100마이크로리터를 이동하여 X축을 따라 희석 구배를 만듭니다. 100마이크로리터가 컬럼 11에 추가될 때까지 희석 공정을 계속합니다.

컬럼 11을 혼합한 후 해당 컬럼에서 100마이크로리터를 버리고 컬럼 12에 약물 없이 매체만 남겨둡니다. 두 번째 약물 희석을 위한 또 다른 그래디언트를 생성합니다. 이렇게하기 위해, 2 개의 X, 행 A.에 입력 분자의 최소 억제 농도를 포함하는 매체의 100 마이크로 리터를 추가하십시오.그런 다음, 100 마이크로 리터가 행 G.에 추가 될 때까지 행 A에서 B.로 100 마이크로 리터를 옮깁니다.행 G를 혼합 한 후, 우물에서 100 마이크로 리터를 버리십시오.

그런 다음 플레이트에 2마이크로리터의 배양액을 각 웰에 접종합니다. 웰당 1000개의 셀이 있습니다. 그런 다음 0시간 시점에 대해 600나노미터에서 광학 밀도 판독값을 측정합니다.

판독값이 기록되면 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 24시간 동안 600나노미터에서 광학 밀도 값을 측정합니다. 고처리량 스크리닝을 수행하기 위해 시너지 약물에 대해 야생형 및 시너지 예측 돌연변이 세포를 M9 최소 배지에서 배양합니다.

그런 다음 라이브러리의 약물을 배지에 추가합니다. 다음으로, 라이브러리 약물 한 플레이트에 야생형을 접종하고 다른 한 플레이트에 시너지 예측 돌연변이 박테리아를 접종합니다. 이 플레이트는 시너지 약물 조합을 조사하는 데 사용되는 바둑판 분석을 나타냅니다.

이 플레이트에서 FICI 점수가 0.07로 가장 낮은 F9는 소분자쌍이 상승 작용을 나타낸다는 것을 나타냅니다. 이 플레이트는 비상호 작용 약물 조합을 조사하기 위한 바둑판 분석을 나타냅니다. 이 플레이트에서 FICI 점수가 1.0으로 가장 낮은 웰 C3는 소분자 쌍이 서로 상호 작용하지 않음을 나타냅니다.

이 플레이트는 길항제 약물 조합을 조사하는 데 사용되는 바둑판 분석법을 나타냅니다. 이 플레이트에서 FICI 점수가 8.0으로 가장 낮은 A1은 약물 분자 간의 상호 작용이 길항적임을 나타냅니다. 다음으로 플루코나졸의 소분자 약물인 베펠딘 A는 C 및 U 포르민의 성장을 연구하는 데 사용됩니다.

이 그래프는 야생형과 시너지 예측 돌연변이의 성장이 모두 약간 그리고 같은 정도로 억제되어 있음을 보여줍니다. 이는 Befeldin A와 Fluconazole이 비시너지 약물 파트너임을 나타냅니다. 반대로, C와 U 포르민의 시너지 예측 돌연변이의 성장은 레프로미신(Refromisyn)과 플루코나졸(Fluconazole)의 존재 하에서 현저히 억제된다.

약물이 시너지 파트너임을 나타냅니다. 흥미롭게도, 야생형의 성장은 전혀 억제되지 않는다. 여기에서 가장 큰 성장 차이는 접종 후 32시간에서 49시간 사이에 관찰됩니다.

이 기술을 완전히 익히면 시너지 효과를 내는 약물 상호작용을 식별하는 시간을 단축할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 바둑판 분석의 마지막 행에 있는 마지막 열에 있는 약물을 결합하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 추가적인 시너지 약물 상호 작용을 확인하기 위해 다른 시너지 분자 식별 방법을 수행할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 관심 유기체와의 시너지 약물 상호 작용을 찾기 위해 O2M 방법론을 사용하여 추정되는 시너지 마커를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일부 작은 분자로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 MSDS의 모든 예방 조치를 이 프로토콜을 수행하는 동안 따라야 한다는 점을 잊지 마십시오.