미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

이 절차의 전반적인 목표는 미세유체 플랫폼을 사용하여 다세포 응집체 또는 스페로이드에서 관류 가능한 혈관 네트워크를 구성하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 및 체외 조직 모델에서 혈관 네트워크가 어떻게 중요한지와 같은 재생 의학 분야의 대체 형태에 대한 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약물 및 보충제 투여 경로를 관심 영역을 스페로이드로 직접 전달하여 체외에서 시뮬레이션할 수 있다는 것입니다.

일반적으로, 이 방법에 새로운 개인은 microfluidic 장치에 있는 표적 지역으로 세포를 소개하기에 있는 어려움 때문에 고군분투할 것입니다. PDMS 프리폴리머를 주조한 후 진공 챔버에서 2시간 동안 재료의 가스를 제거한 다음 공기 배출 오븐에서 섭씨 80도에서 하룻밤 동안 경화합니다. 다음 날 아침, 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 벗겨내고 직경 2mm의 홀 펀치를 사용하여 표시된 위치에서 재료에 구멍을 만듭니다.

직경 1mm의 펀치를 사용하여 스페로이드 웰을 만들고 접착 테이프를 사용하여 PDMS 슬래브와 24 x 24mm 유리 커버 슬립을 청소합니다. 깨끗한 슬래브를 40초 동안 공기 플라즈마로 처리하고 PDMS 슬래브를 커버 슬립에 접착합니다. 그런 다음 섭씨 80도에서 최소 12시간 동안 PDMS를 치료합니다.

미세유체 장치를 파종하기 2-3일 전에 10mm 접시에 담긴 10ml의 신선한 내피 배지에 갓 해동한 5번째 hLF, RFP-HUVEC 및 GFP-HUVEC에 10배를 3회 첨가합니다. hLF 및 RFP-HUVEC가 하위 포화도에 도달하면 내피 매체에서 최종 농도까지의 hLF 및 RFP-HUVEC를 각각 1.0 곱하기 10에서 5번째 셀 및 2.5 곱하기 10에서 네 번째 셀(mm)당 4번째 세포로 현탁합니다. 현탁액 배양에서 이틀 후, 생물 안전 캐비닛에서 갓 준비한 마스터 믹스 용액 99마이크로리터 방울을 얼음 위의 35mm 페트리 접시 중앙에 추가합니다.

미세유체 장치를 로드하려면 수정된 100마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 스페로이드와 100마이크로리터의 매체를 두 번째 실온 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 최소한의 매체로 스페로이드를 흡인하고 피펫을 똑바로 세워 스페로이드가 중력에 의해 피펫 팁의 바닥으로 이동하도록 합니다. 피펫 팁을 마스터 믹스 방울의 메니스커스에 대면 피펫 플런저를 누르지 않고 스페로이드가 용액으로 배출됩니다.

다음으로, 갓 준비한 트롬빈 1마이크로리터를 방울에 빠르게 넣고 트롬빈을 용액에 부드럽게 혼합합니다. 피펫을 7마이크로리터로 설정하고 스페로이드를 PDMS 슬래브의 스페로이드 웰로 천천히 옮깁니다. 절차의 가장 중요한 단계는 스페로이드가 장치 바닥에 가라앉을 수 있도록 충분한 젤을 스페로이드에 주입하는 것입니다.

적재 후 피펫 팁을 부드럽게 제거하여 마이크로 포스트 사이의 누출을 방지합니다. 스페로이드를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 피브린이 응고되면 20-30마이크로리터의 내피 배지를 구멍 1 A와 3 A에 천천히 주입하여 각각 채널 1과 3을 로드합니다.

그런 다음 장치를 100mm 접시에 담긴 젖은 실험실 물티슈에 옮기고 배지와 피브린 사이의 계면에서 기포를 쉽게 제거할 수 있도록 섭씨 37도 및 5% CO2에서 24시간 동안 장치를 배양합니다. 다음 날, 2ml의 0.05%트립신-EDTA를 sub-confluent GFP-HUVECs에 첨가하고, 세포가 완전히 분리되면 4ml의 완전한 배지로 트립신 반응을 멈춥니다. 원심분리로 내피 세포를 수집하고 펠릿을 밀리리터당 6번째 세포 농도의 5배 10에서 새로운 내피 배지에 재현탁합니다.

다음으로, 20마이크로리터의 HUVEC을 구멍 1 B에 주입하여 채널 1을 로드하고 장치를 섭씨 37도에서 30분 동안 놓고 90도 각도로 기울여 HUVEC가 채널 2의 피브린에 부착되도록 합니다. 동일한 방식으로 채널 3을 로드한 후 7-14일 동안 세포 배양 인큐베이터에 젖은 실험실 물티슈가 들어 있는 새 100mm 접시에 장치를 넣고 매일 채널 1과 3에 있는 배지의 절반을 교체합니다. HUVEC 로딩 0일차에 촬영된 이 대표적인 이미지는 채널 1 또는 3으로 누출되지 않고 채널 2에만 로드된 피브린 겔과 HUVEC이 피브린 겔의 측벽에 성공적으로 부착된 것을 보여줍니다.

스페로이드는 또한 장치의 바닥에 적절하게 정착하는 것을 관찰할 수 있습니다. 혈관신생 새싹은 1일째부터 관찰되며, 이 실험에서 가장 긴 새싹은 3일째에 스페로이드에 도달하고, 대부분의 혈관신생 새싹은 7일째에 스페로이드에 도달합니다. 최적으로는, 장치에서 4일 후에 혈관 끝의 방향과 혈관 뿌리에서 회전 타원체의 중심으로 정의된 혈관 각도를 사용하여 혈관 내강을 통해 흐름을 관찰할 수 있습니다.

혈관 각도는 시간에 따라 감소하며, 이는 혈관 형성 새싹이 스페로이드 쪽으로 이동하는 것을 나타냅니다. RFP와 GFP-HUVEC는 협조적으로 단일 혈관 내강을 형성할 수 있으며, 이는 채널 1 및 3 문합에서 스페로이드의 RFP-HUVEC로 혈관 형성 생균이 어떻게 싹을 틔우어 연속적인 혈관 네트워크를 형성하는지 명확하게 나타냅니다. 또한, 채널 1에 주입된 FITC-덱스트란은 구성된 혈관 네트워크와 스페로이드 내부로 흘러 들어가 결국 채널 3에 도달하는데, 이는 통합된 혈관 네트워크가 스페로이드에 영양분을 공급하고 스페로이드에서 노폐물을 제거할 수 있음을 의미합니다.

개발 후 이 기술은 유기 전기 분야의 연구자들이 체외 조직 모델에서 관심 있는 약물 또는 보충제의 효능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.