Name: 미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 배우세요 미세유체 플랫폼을 이용해 다세포 응집체에서 관류 가능한 혈관 네트워크를 구축하는 방법을. 이 기술은 체외 조직 모델에서 약물 전달을 시뮬레이션하여 재생의학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 크레스트 JST (보조금 번호 JPMJCR14W4), 사회 대는 승진의 과학 (JSP) KAKENHI (25600060, 16 K 16386 번호 부여), 문 부 과학성 및 JST, 프로젝트에서 키 평가 기술 개발에 초점을 맞춘 혁신 프로그램의 센터에 의해 지원 되었다 의료 연구 및 개발, 아메드, 미즈호 기초 과학의 승진을 위한 일본 기관. 소는 교토 대학교 나노 기술 허브에 의해 지원 되었다.

1입니다. 미세 장치 금형의 제작
<ol><li>상용 소프트웨어를 사용 하 여 미세 소자의 패턴 디자인 (Clewin5 또는 AutoCAD 2016, 등.). Clewin5의 기능에 대 한 사용자 설명서 (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual)를 참조 하십시오. 참고: 디자인 파일은 보조 파일 1에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로 패턴 발생기에 디자인 파일을 전송 하 고 긍정적인 감광 제 코팅 크롬 마스크 도구를 로드 합니다.</li>
	<li>마이크로 패턴 발생기를 사용 하 여 패턴 영역에서 긍정적인 감광 노출.</li>
	<li>개발자 (테이블의 재료)를 사용 하 여 긍정적인 감광 제를 개발 하 고 마스크 이온된 (DI) 수와 린스.</li>
	<li>Using 크롬 현상 (자료 테이블), 긍정적인 감광 제 제거 되었습니다 노출된 영역에 크롬 에칭. 마스크 디 물으로 린스.</li>
	<li>남은 아세톤을 사용 하 여 마스크에 포토 레지스트를 제거 합니다. 참고: 투명도 마스크 Cr 마스크에 대 한 대안을 수 있습니다.</li>
	<li>깨끗 한 실리콘 웨이퍼를 준비 (4 인치, P(100)) 및 스핀 코트 hexamethyldisilazane (HMDS) 30 3000 rpm에서 s.</li>
	<li>Softbake HMDS 120 ° C와 멋진 웨이퍼 상 온에서 5 분에서 5 분.</li>
	<li>Spincoat 10 s 500 rpm 및 30에 대 한 1200 rpm에서 부정적인 감광 제 (자료 테이블) s. 참고: 스핀 코팅 조건 해야 얻을 감광 레이어 웨이퍼에 약 100 µ m의 두께 가진 사진 평판 후.</li>
	<li>95 ° C에서 45 분에 대 한 부정적인 감광 prebake 고 실 온에서 60 분에 대 한 웨이퍼를 냉각 하십시오.</li>
	<li>각 실험에서 UV 빛의 강도 확인 하 고 250 mW/cm2에서 총 노출 에너지 복용량에 대 한 노출 시간을 계산 합니다. 웨이퍼에 포토 마스크 (단계 1.1-1.6)을 놓고는 자외선에 노출 합니다.</li>
	<li>Postbake 1 분 65 ° C에서와 95 ° c.에 5 분에 대 한 부정적인 감광 제 실 온에서 1 분 동안 진정 웨이퍼를 허용 합니다.</li>
	<li>첫 번째 개발자 (자료 테이블) 목욕에서 하 고 두 번째 목욕에서 2 분 15 분에 대 한 부정적인 감광 레이어를 개발 합니다. 10에 대 한 첫 번째 소 프로 파 놀 (IPA) 목욕에 웨이퍼를 씻어 s 10에 대 한 두 번째 IPA 목욕에서 s.</li>
	<li>Hardbake 200 ° C와 멋진 웨이퍼 상 온에서 5 분에서 30 분에 대 한 부정적인 감광 제.</li>
	<li>표면 프로파일러를 사용 하 여 부정적인 포토 레지스트 층의 두께 측정 합니다.</li>
	<li>진공 펌프에 연결 된 desiccator 웨이퍼 놓고 silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)의 200 µ L을 추가. 10 분 동안 펌프 다음 그것을 해제 켜고 4 h desiccator에 웨이퍼를 유지.</li>
</ol>2. 제조 단계 및 PDMS 층 어셈블리
<ol><li>캐스팅 사전입니다 (PDMS) 폴리머 (PDMS 자료: 경화제 = 10:1 (w/w))와 2 시간에 대 한 진공 챔버에 드.</li>
	<li>치료 PDMS 공기 통풍 오븐 하룻밤에 80 ° C에서.</li>
	<li>실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 벗기십시오.</li>
	<li>펀치 구멍 1A-3B (그림 1)와 잘 회전 타원 체 문화. -3B, 고 1 m m 직경은 회전 타원 체에 대 한 잘 펀치 구멍 1A에 대 한 2 m m 직경 펀치를 사용 합니다.</li>
	<li>반복적으로 집착 하 고 테이프를 벗 하 여 접착 테이프를 가진 PDMS 슬 래 브와 유리 커버 슬립 (24 m m × 24 m m)를 청소 합니다. 다음 치료 40 공기 플라즈마 PDMS 석판 s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>PDMS 슬 래 브와 커버 슬립 80 ° C 12 h 이상에서 치료 사이의 표면에서 모든 기포를 추방 하기 위해 유리 커버 슬립에 PDMS 슬 래 브 본드.</li>
</ol>3. 회전 타원 체 준비
참고:이 연구에서 빨간색 형광 단백질을 표현 하는 인간의 배꼽 정 맥 내 피 세포 (RFP-HUVECs) 고 표현 하는 녹색 형광 단백질 HUVECs (GFP-HUVECs)에 사용 된 회전 타원 체와 microchannels, 각각의 구별 Perfusable 혈관 네트워크의 건설 후 HUVECs. HUVECs의 필요 하지 않은 경우 레이블된 HUVECs 실험을 위해 충분 하다.입니다.
<ol><li>RFP-HUVECs (3.0 × 105 셀/유리병)과 인간의 폐 섬유 (hLF) (1.0 × 106 셀/유리병) 해 동을 내 피 세포와 섬유 세포에 대 한 매체의 10 mL에 각각 추가 합니다 (자료 테이블). 문화 그들 37 ° C, 5% CO2 에서 100 mm 접시에 2-3 일에 대 한 하위 confluent RFP HUVECs 및 hLFs. 이 준비는 200 ~ spheroids를 얻을 것입니다.</li>
	<li>RFP HUVECs 및 hLFs 0.05% 트립 신-EDTA의 2 mL와 함께 요리에서 분리 하 고 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% (v/v) 페니실린/스 포함 된 DMEM의 4 mL와 트립 신 반응을 중지.</li>
	<li>3 분 220 x g에서 원심 분리 후 상쾌한, 제거 하 고 마지막 셀 농도 2.5 × 104 와 1.0 × 105 셀/mL, 내 피 중간에 RFP HUVECs와 hLFs를 각각 resuspend.</li>
	<li>부드럽게 낮은 바인딩 표면 96 잘 접시에 잘 당 셀 정지 (5000 셀 RFP HUVECs에 대 한) 및 hLFs에 대 한 20000 셀의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>2-4 일 동안 37 ° C, 5% CO2 96 잘 접시를 품 어. 참고: 회전 타원 체 직경 문화 기간과 96 잘 접시에 초기 휴대폰 번호에 따라, 이후 그것은 제어할 수 있습니다 이러한 두 매개 변수에 의해.</li>
</ol>4입니다. 세포 미세 장치에 뿌리기
참고: 채널 구멍과 회전 타원 체에 대 한 명명 규칙 잘 그림 1에서 시연 됩니다. 우리 세포 미세 장치에 수확 끝나면 하루 하루 0을 정의 합니다. 실험 일정의 회로도 그림 2에 표시 됩니다.
<ol><li>일 − 1) 회전 타원 체 로드 참고: 다음 단계 콜라겐과 섬유 소의 겔 화를 방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 합니다.<ol>
<li>2.80 mg/mL의 최종 농도 대 한 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 fibrinogen 디졸브.</li>
		<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 중화 콜라겐 (PBS에 3.0 mg/mL)를 준비 합니다.</li>
		<li>Fibrinogen 솔루션 (2.80 mg/mL)의 107.2 µ L, 중화 콜라겐 (3.0 mg/mL), 8.0 µ L 및 3.6 µ L 반응 관에서 당 aprotinin (5 U/mL)의 결합. 이 솔루션은 "마스터 믹스 솔루션" 표시 됩니다 (MS). 참고: 볼륨 충분 한 회전 타원 체를 로드 됩니다. 하나 이상의 회전 타원 체 있는 경우에, spheroids의 수로 각 볼륨을 곱하면 됩니다.</li>
		<li>50 U/mL의 최종 농도 대 한 PBS에 트 롬 빈을 디졸브. 참고: 50 U/mL 트 롬 빈 (20 µ L/튜브)의 Aliquots −30 ° C에 저장 되 고 각 실험 전에 해 동.</li>
		<li>Biosafety 캐비닛 내부 spheroids를 포함 하는 96 잘 접시를 놓습니다.</li>
		<li>Biosafety 내각, 얼음 (1 접시) 1 접시와 벤치탑 (2 접시)에 다른 접시 안에 두 35 m m 접시를 준비 합니다. 접시 1 (그림 3a) 물방울 형성의 중심에 피펫으로 99 µ L의 MS입니다.</li>
		<li>(10-100 µ L) 2 노란색의 끝을 트림와 3 피 펫 팁 (1-100 µ L) MS, spheroids의 정밀한 수집 장치에 있는 spheroids를 주입 하 고 장치에 미디어를 주입와 트 롬 빈을 혼합 96 잘 접시에서 spheroids의 컬렉션에 대 한 취소 각각. 팁의 기 공 크기 구멍 1A-채널 1과 3의 3B의 직경 보다 약간 더 큰 또는 채널 2 아늑한에서에서 회전 타원 체에 맞게. 참고:이 하, 달리 언급 하지 않는 한 사용 하 여이 단계에서 잘라내기 피 펫 팁. 그림4에서 컷된 팁의 사진을 이용하실 수 있습니다.</li>
		<li>96 잘 접시에서 매체의 100 µ L로 회전 타원 체를 수집 하 고 접시 2 (그림 3a) 추가.</li>
		<li>접시 2에서에서 미디어의 최소 볼륨으로 회전 타원 체 선택 합니다. pipettor을 똑바로 잡고는 회전 타원 체 중력에 의해 피펫으로 팁의 아래쪽으로 이동 해야 합니다. 접시 1 (그림 3a)에 MS 물방울의 초승달 모양에 피펫으로 팁으로는 회전 타원 체를 꺼냅니다. 참고: 다음 단계 4.1.10 & 4.1.11 신속 하 게 수행 되어야 한다.</li>
		<li>트 롬 빈 (50 U/mL)의 1 µ L을 추가 하 고 노란색 피펫으로 팁으로 부드럽게 혼합.</li>
		<li>7 µ L로 설정 하는 피 펫으로는 회전 타원 체를 선택 하 고 천천히 회전 타원 체 잘 (그림 3b) 그것을 넣습니다.</li>
		<li>섬유 소의 겔 화에 대 한 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>미디어와 구멍 1A와 3A 및 채우기 채널 1과 3에서에서 내 피 매체를 천천히 주입 (20 ~ 30 µ L/채널).</li>
		<li>미디어 장치 (그림 3c)에서 증발을 방지 하기 위해 젖은 Kimwipe와 100 mm 접시에는 장치를 놓습니다.</li>
		<li>미디어와 섬유 소 사이의 인터페이스에서 거품 제거를 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 장치를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>로드 하는 데 0) HUVECs<ol>
<li>Thaw GFP-HUVECs (105 셀/유리병 x 3.0)을 내 피 매체의 10 mL를 추가 합니다. 하위 confluency 도달 하 2-3 일 동안 37 ° C, 5% CO2 에서 100 mm 접시에 그들을 문화. 하위 confluent GFP-HUVECs의 1 접시 준비 8-10 장치에 대 한 충분 하다.</li>
		<li>GFP-HUVECs 0.05% 트립 신-EDTA의 2 mL와 함께 요리에서 분리 하 고 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% (v/v) 페니실린/스 포함 된 DMEM의 4 mL와 트립 신 반응을 중지.</li>
		<li>3 분 220 x g에서 원심 분리 후 106 셀/mL x 5.0에 GFP-HUVECs 내 피 중간에 resuspend.</li>
		<li>채널 1 구멍 1b HUVECs 세포 현 탁 액 주입 (20 µ L/채널).</li>
		<li>미세 장치 90 °를 기울기, 측면에 배치와 준수는 HUVECs 채널 2에에서 섬유 소를 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.<ol>
<li>섬유 소에 HUVECs의 첨부 파일을 확인 합니다. 젤와 매체 간의 인터페이스에 연결 된 HUVECs 수가 부족 한 경우는 맥 관 구조 장치 문화 (그림 5)의 몇 일 후 혈관 루트에서 끊을 수 있습니다. 프로토콜에는 관류의 성공률은 > 50%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>채널 3 4.2.4-4.2.5 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>7-14 일 동안 37 ° C, 5% CO2 젖은 Kimwipe와 100 mm 접시에 문화 세포.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 일 ~) 미디어 교환<ol>
<li>채널 1과 3에에서 미디어의 절반 매일 교환 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. 핵 얼룩
<ol><li>PBS에서 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다.</li>
	<li>채널 1과 3에서에서 미디어를 제거 하 고 4%의 20 µ L 추가 채널당 PFA. 4%에서 솔루션을 대체 하기 위하여 PFA, 반복 장치에서 솔루션 제거 및 추가 4% PFA 3 번.</li>
	<li>4 ° C에서 장치를 밤새 품 어.</li>
	<li>4% 제거 장치 및 세척 PFA PBS와 채널 3 번.</li>
	<li>세포 핵 얼룩 채널 당 10 µ g/mL 형광 염료 (자료 테이블)의 20 µ L를 추가 합니다. 장치에 솔루션을 교환 하는 장치에서 솔루션을 제거 하 고 10 µ g/mL를 추가 형광 염료 3 번 반복 합니다.</li>
	<li>24 h에 대 한 4 ° C에서 장치를 저장 합니다.</li>
</ol>6. 유체 관류는 회전 타원 체의
<ol><li>7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 장치에는 지속적인 혈관 통로의 완료에 대 한 배양 후는 회전 타원 체를 준비 합니다.</li>
	<li>구멍 1A, 1B, 3A, 3B에서 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>10 µ L fluorescein isothiocyanate (FITC) 10 µ M 솔루션의 소개-dextran PBS에 구멍 1A 및 1B에.</li>
	<li>Microbeads 또는 거꾸로 현미경 FITC 염료의 흐름을 모니터링 합니다.</li>
</ol>7입니다. 새싹 길이의 정량화
참고:이 연구에서 이미지의 분석의 모든 ImageJ 버전 1.49 소프트웨어 사용 됩니다.
<ol><li>GFP HUVECs 일 0, 1, 3, 5 및 7의 이미지를 오버랩.</li>
	<li>하루 1, 3, 5 및 7 일에 촬영 한 이미지에서 같은 위치에서 0의 맥 관 구조 팁의 위치를 뺍니다.</li>
	<li>루트 위치 (그림 6)에서 혈관 끝의 성장을 결정 합니다. 혈관 팁 및 루트 사이의 거리는이 연구 (그림 7b) 새싹 길이로 정의 했다.</li>
</ol>8입니다. 혈관 각도의 정량화
참고: 혈관 각도 각도 혈관 각도, 루트 및 회전 타원 체 (그림 7c)의 중심 구성으로 정의 되었다.
<ol><li>RFP HUVECs를 포함 하는 coculture 회전 타원 체의 형광 이미지를 binarize 하 고 분석 함수 ImageJ에 의해 "중심" 위치를 측정 한다. 이 연구에서는 측정된 "중심" 위치는 회전 타원 체 (그림 6)의 중심으로 정의 됩니다.</li>
	<li>7 단계에서 같은 방법으로 혈관 팁 및 뿌리의 위치를 결정 합니다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어에서 분석 기능을 사용 하 여 혈관 각도 측정 합니다.</li>
</ol>

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이전 보고서 보기 hLFs angiopoietin 1, angiogenin, hepatocyte 성장 인자, 성장 인자 α, 종양 괴 사 인자와 일부 세포 외 기질 단백질29, 변형 등의 여러 신생 요인의 칵테일을 분 비 30. 이 분석 결과에서 coculture 회전 타원 체, 기술의 한계는 hLFs에서 신생 비에 의존 합니다. 따라서, 그것은 coculture 회전 타원 체와 채널 1과 3에서에서 HUVECs 사이의 거리를 단축 될 수 있다 우물의 바닥에 coculture 회전 타원 체를 설정 하는 안정적인 혈관 형성 중요 합니다. 짧은 거리는 안정적인 혈관 형성에 대 한 유리 섬유 아 세포에서 혈관 길이 내 피 세포 및 섬유 아 세포31, 사이의 거리에 반비례 했다. 그러나, 손상 채널 1 및 3 없이 회전 타원 체 구멍 (직경에서 1 m m)를 열고, 채널 2의 최소 폭 1...

생활의 세포질 기능을 모방 하는 문화 모델을 사용 하는 필요에 의해 자극 된다 3 차원 문화에 단층 (2 차원) 문화에서 변화 조직1,2,3. 일반적으로 세포 배양에 사용 하는 평평 하 고 단단한 플라스틱 기판 대부분을 인체에 extracellular 환경의 닮는 다 하지. 사실, 많은 연구가 보여주는 그 3 차원 문화 재현 조직 관련 건축, 기계 및 생 화 확 적인 신호 및 셀 통신, 기존의 2 차원 문화4에서에서 관찰 되었습니다 하지, 5,6,,78.
다세포 집계 또는 회전 타원 체,이 3 차원 문화9,10을 실현 하기 위해 가장 유망한 기술 중 하나입니다. 세포는 세포 외 기질 (ECM)을 분 비 하 고는 회전 타원 체에서 다른 사용자와 상호 작용할 수 있습니다. 비록 다른 바이오 접근11,12,,1314, 셀 스택 등 인체의 공간 복잡도 성공적으로 복제, 이러한 접근만 2 또는 3 분석의 용이성 및 대상 기관에 초점 을된 하나의 기능에 대 한 셀의 종류. 대조적으로, spheroids에 세포 영양분, 산소, paracrine autocrine 신호는 회전 타원 체에 분자의 다른 유형의 공급으로 인해 회전 타원 체에 그들의 위치에 따라 다른 문화 환경에 노출 됩니다. Spheroids의이 기능은 부분적으로 모방 문화 상태 vivo에서 그리고 생체 외에서 스태킹 조직9, 에서 교양 보다 훨씬 더 복잡 하 고, 조직 조직 만들 spheroids 셀 구조 사용 15 , 16.는 회전 타원 체는 세포의 단일 종류의 구성 되어, 경우는 회전 타원 체에 세포의 기능 하지 않습니다는 회전 타원 체에서 이기종 환경으로 인해 균일 한. 지난 몇 년 동안, 회전 타원 체 문화 허용 배아 줄기 세포 (ESCs), 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 또는 vivo에서 발달 순서를 모방 하 여 미니-17뇌 등 장기를 다시 조직 상주 줄기 세포 간18및 신장19,20.
회전 타원 체 문화 기술에 있는 뜻깊은 진도도 불구 하 고 오랜 동안 큰 spheroids 경작은 여전히 문제가 있다입니다. 3 차원 조직에서 세포를 150-200 µ m의 혈관 내 산소와 영양소21의 한정 된 공급 때문에 필요 합니다. 회전 타원 체 내 혈관 네트워크는 혈액과 조직 비보사이 교환 물질을 정리 하는 데 필요한. 이를 위해, 다른 그룹 공동 대상 셀22,,2324 과 내 피 세포를 배양 하거나 CD31-긍정적인 세포20로 만능 세포의 분화를 유도. 그럼에도 불구 하 고, 보고 된 선박-같은 구조는 회전 타원 체의 중심에 산소와 양분을 공급 하는 루미나의 열린 끝을 있지 않습니다. 3 차원 문화에 있는 세포 영양 혈관 역할을 모방 하는 회전 타원 체에 오픈 및 perfusable 혈관 네트워크를 개발 해야 합니다.
지난 몇 년 동안 microengineering 필드에 일부 연구 그룹 보고 cocultured fibroblast 세포25에서에서 신생 요소를 이용 하 여 미세 장치에 자발적으로 형성 된 perfusable 혈관 네트워크를 구성 하는 방법 ,26. 이러한 혈관 네트워크에 그들의 생체 내에서 유사한 형태학 있고 그들을 회전 타원 체 문화에 혈관 기능을 흉내 낸에 대 한 적당 한 만드는 환경 요인에 의해 개장 될 수 있다. 이 프로토콜의 목적은 미세 플랫폼27을 사용 하 여 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 구성 하는 것입니다. 미세 장치는 회전 타원 체 통합 될 수 있도록 이전에 보고 된 장치25 에서 수정 됩니다. Microchannels에서 내 피 세포에는 회전 타원 체에서 fibroblast 세포에서 신생 비 여, 신생은 회전 타원 체와 anastomosed microchannels에서 콩나물 하 고 perfusable 혈관 네트워크를 형성 했다. 이 메서드는 다양 한 형광 분자 및 혈관 네트워크와 장기 조직 문화에 대 한 프레임 워크를 제공 하는 회전 타원 체의 내부에 마이크로 미터 규모 구슬 같은 물질의 직접 배달 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>AZP 1350으로 코팅된 크롬 마스크.</td><td>CLEAN SURFACE TECHNOLOGY</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 패턴 생성기</td><td>하이델베르크</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26 현상액</td><td>Rohm and haas electronic materials</td><td>-</td><td>프로토콜 1.4</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>Sasaki Chemical</td><td>S-24</td><td>크롬 에칭액 프로토콜 1.5</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Wako</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Tokyo Ohka Kogyo</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem-Negative</td><td></td> <td>Photoresist in protocol 1.9</td></tr><tr><td>UV Exposure</td><td>Nanometric Technology Inc</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>프로토콜 1.13의 네거티브 포토레지스트에 대한 개발자</td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Wako</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>표면 프로파일러</td><td>Veeco</td><td>Dektak XT-S</td><td></td></tr><tr><td>(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Toray</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치 (1.0mm)&nbsp;</td><td>카이 인더스트리</td><td>BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>바이옵시 펀치 (2.0mm)&nbsp;</td><td>카이 공업</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 시스템</td><td>펨토 사이언</td>스 <td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>MATSUNAMI GLASS</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes</td><td>이와키</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>RFP 표현 인간 배꼽 정맥 내피 세포</td><td>혈관 단백</td><td>cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>정상 인간 폐 섬유 아세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>섬유 아세포 성장 미디어 키트</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토 마이신 용액</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>0.05w/v% 트립신-0.53mmol/l EDTA&bull; 4Na 용액과 페놀 레드</td><td>Wako</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충염)</td><td>타카라 바이오</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>스미토모 베이클라이트</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000ul 칩</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200ul&nbsp; Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Model 370</td><td></td></tr><tr><td>GFP 발현 인간 배꼽 정맥 내피 세포</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>소 플라즈마에서 추출한 피브리노겐</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>소 폐에서 추출한 아프로티닌</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>소 플라즈마에서 추출한 트롬빈</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>프로토콜 5.5에서 핵을 염색하기 위한 형광 염료 파라</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Wako</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>디지털 CCD 카메라</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 생물 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란</td><td>시그마</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

회전 타원 체 (다세포 집계)는 인간의 신체에서 살아있는 조직의 좋은 모델으로 간주 됩니다. 회전 타원 체 문화에서 중요 한 발전에도 불구 하 고 perfusable 혈관 네트워크는 spheroids에 유지 하 고 단백질 식 및 morphogenesis 같은 그들의 기능을 개발 하는 데 필요한 장기 문화에 대 한 중요 한 도전 남아 있습니다. 프로토콜 미세 장치에서 회전 타원 체 내 perfusable 혈관 네트워크를 통합 하는 새로운 방법을 선물 한다. Perfusable 혈관 네트워크는 회전 타원 체에 유도, 신생 콩나물 microchannels에 연결 된 인간의 폐 섬유 아 세포는 회전 타원 체에 경작에서 신생 요소를 활용 하 여는 회전 타원 체를 유도 했다. 신생 콩나물 회전 타원 체, 회전 타원 체, 공동 경작 하는 내 피 세포와 합병을 도달 하 고 지속적인 혈관 네트워크를 형성 했다. 혈관 네트워크 어떤 유출 없이 회전 타원 체의 내부를 perfuse 수 있습니다. 생성 된 혈관 네트워크 영양분의 공급과 혈액 순환 비보를 흉내 낸 폐기물의 제거에 대 한 경로로 추가 사용 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 조직 생활의 더 나은 재현 부로 회전 타원 체 문화에서 새로운 플랫폼을 제공합니다.

그림 1 에서는 설계 및 미세 소자의 사진. 그것은 3 개의 병렬 채널, 어느 채널에서 2는 회전 타원 체 잘 들어 있습니다. HUVEC 문화에 사용 되는 채널 1과 3 이며 채널 2는 회전 타원 체에 대 한. 각 채널 패턴 PDMS 하도록 설계 된 사다리꼴 microposts로 구분 됩니다. microposts에서 채널 1과 3에 표면 장력에 의해 새 채널 2에서에서 하이드로 겔을 방지 하 고 microchannels28회전 타원 체와 HUVECs 사이의 물질 교환 허용.
그림 7a 셀 시드 후 미세 소자의 센터를 보여 줍니다. 밝은 분야 및 형광 이미지 0에 찍은 섬유 소 젤 채널 1, 3에 채널 2 어떤 누설 ...

프로토콜에는 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 설계 하는 방법을 설명 합니다. 회전 타원 체의 주변 microenvironment 신생 유도 microchannels 미세 장치에는 회전 타원 체 연결을 고안 이다. 메서드를 사용 하면 3 차원 문화에 오랫동안 기다려온 기술 회전 타원 체의 관류를 수 있습니다.

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

이 절차의 전반적인 목표는 미세유체 플랫폼을 사용하여 다세포 응집체 또는 스페로이드에서 관류 가능한 혈관 네트워크를 구성하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 및 체외 조직 모델에서 혈관 네트워크가 어떻게 중요한지와 같은 재생 의학 분야의 대체 형태에 대한 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약물 및 보충제 투여 경로를 관심 영역을 스페로이드로 직접 전달하여 체외에서 시뮬레이션할 수 있다는 것입니다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개인은 microfluidic 장치에 있는 표적 지역으로 세포를 소개하기에 있는 어려움 때문에 고군분투할 것입니다. PDMS 프리폴리머를 주조한 후 진공 챔버에서 2시간 동안 재료의 가스를 제거한 다음 공기 배출 오븐에서 섭씨 80도에서 하룻밤 동안 경화합니다. 다음 날 아침, 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 벗겨내고 직경 2mm의 홀 펀치를 사용하여 표시된 위치에서 재료에 구멍을 만듭니다.직경 1mm의 펀치를 사용하여 스페로이드 웰을 만들고 접착 테이프를 사용하여 PDMS 슬래브와 24 x 24mm 유리 커버 슬립을 청소합니다. 깨끗한 슬래브를 40초 동안 공기 플라즈마로 처리하고 PDMS 슬래브를 커버 슬립에 접착합니다. 그런 다음 섭씨 80도에서 최소 12시간 동안 PDMS를 치료합니다.미세유체 장치를 파종하기 2-3일 전에 10mm 접시에 담긴 10ml의 신선한 내피 배지에 갓 해동한 5번째 hLF, RFP-HUVEC 및 GFP-HUVEC에 10배를 3회 첨가합니다. hLF 및 RFP-HUVEC가 하위 포화도에 도달하면 내피 매체에서 최종 농도까지의 hLF 및 RFP-HUVEC를 각각 1.0 곱하기 10에서 5번째 셀 및 2.5 곱하기 10에서 네 번째 셀(mm)당 4번째 세포로 현탁합니다. 현탁액 배양에서 이틀 후, 생물 안전 캐비닛에서 갓 준비한 마스터 믹스 용액 99마이크로리터 방울을 얼음 위의 35mm 페트리 접시 중앙에 추가합니다.미세유체 장치를 로드하려면 수정된 100마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 스페로이드와 100마이크로리터의 매체를 두 번째 실온 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 최소한의 매체로 스페로이드를 흡인하고 피펫을 똑바로 세워 스페로이드가 중력에 의해 피펫 팁의 바닥으로 이동하도록 합니다. 피펫 팁을 마스터 믹스 방울의 메니스커스에 대면 피펫 플런저를 누르지 않고 스페로이드가 용액으로 배출됩니다.다음으로, 갓 준비한 트롬빈 1마이크로리터를 방울에 빠르게 넣고 트롬빈을 용액에 부드럽게 혼합합니다. 피펫을 7마이크로리터로 설정하고 스페로이드를 PDMS 슬래브의 스페로이드 웰로 천천히 옮깁니다. 절차의 가장 중요한 단계는 스페로이드가 장치 바닥에 가라앉을 수 있도록 충분한 젤을 스페로이드에 주입하는 것입니다.적재 후 피펫 팁을 부드럽게 제거하여 마이크로 포스트 사이의 누출을 방지합니다. 스페로이드를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 피브린이 응고되면 20-30마이크로리터의 내피 배지를 구멍 1 A와 3 A에 천천히 주입하여 각각 채널 1과 3을 로드합니다.그런 다음 장치를 100mm 접시에 담긴 젖은 실험실 물티슈에 옮기고 배지와 피브린 사이의 계면에서 기포를 쉽게 제거할 수 있도록 섭씨 37도 및 5% CO2에서 24시간 동안 장치를 배양합니다. 다음 날, 2ml의 0.05%트립신-EDTA를 sub-confluent GFP-HUVECs에 첨가하고, 세포가 완전히 분리되면 4ml의 완전한 배지로 트립신 반응을 멈춥니다. 원심분리로 내피 세포를 수집하고 펠릿을 밀리리터당 6번째 세포 농도의 5배 10에서 새로운 내피 배지에 재현탁합니다.다음으로, 20마이크로리터의 HUVEC을 구멍 1 B에 주입하여 채널 1을 로드하고 장치를 섭씨 37도에서 30분 동안 놓고 90도 각도로 기울여 HUVEC가 채널 2의 피브린에 부착되도록 합니다. 동일한 방식으로 채널 3을 로드한 후 7-14일 동안 세포 배양 인큐베이터에 젖은 실험실 물티슈가 들어 있는 새 100mm 접시에 장치를 넣고 매일 채널 1과 3에 있는 배지의 절반을 교체합니다. HUVEC 로딩 0일차에 촬영된 이 대표적인 이미지는 채널 1 또는 3으로 누출되지 않고 채널 2에만 로드된 피브린 겔과 HUVEC이 피브린 겔의 측벽에 성공적으로 부착된 것을 보여줍니다.스페로이드는 또한 장치의 바닥에 적절하게 정착하는 것을 관찰할 수 있습니다. 혈관신생 새싹은 1일째부터 관찰되며, 이 실험에서 가장 긴 새싹은 3일째에 스페로이드에 도달하고, 대부분의 혈관신생 새싹은 7일째에 스페로이드에 도달합니다. 최적으로는, 장치에서 4일 후에 혈관 끝의 방향과 혈관 뿌리에서 회전 타원체의 중심으로 정의된 혈관 각도를 사용하여 혈관 내강을 통해 흐름을 관찰할 수 있습니다.혈관 각도는 시간에 따라 감소하며, 이는 혈관 형성 새싹이 스페로이드 쪽으로 이동하는 것을 나타냅니다. RFP와 GFP-HUVEC는 협조적으로 단일 혈관 내강을 형성할 수 있으며, 이는 채널 1 및 3 문합에서 스페로이드의 RFP-HUVEC로 혈관 형성 생균이 어떻게 싹을 틔우어 연속적인 혈관 네트워크를 형성하는지 명확하게 나타냅니다. 또한, 채널 1에 주입된 FITC-덱스트란은 구성된 혈관 네트워크와 스페로이드 내부로 흘러 들어가 결국 채널 3에 도달하는데, 이는 통합된 혈관 네트워크가 스페로이드에 영양분을 공급하고 스페로이드에서 노폐물을 제거할 수 있음을 의미합니다.개발 후 이 기술은 유기 전기 분야의 연구자들이 체외 조직 모델에서 관심 있는 약물 또는 보충제의 효능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

perfusable-vascular-network-with-tissue-model-microfluidic

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

이 프로토콜은 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA) 하이드로겔에 내장된 혈관 유래 생체 모방 미세유체 네트워크를 제조하기 위해 이미지 유도 레이저 기반 하이드로겔 분해를 구현하는 방법을 설명합니다. 이러한 생체 모방 미세유체 시스템은 조직 공학 응용 분야, 체외 질환 모델 생성 및 고급 "온칩" 장치 제작에 유용할 수 있습니다.

혈관 유래 미세 유체 네트워크의 이미지 유도, 레이저 기반의 제조

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 종양온어칩(tumor-on-a-chip) 모델을 제시하여 고처리량 기초 및 중개 인간 암 연구를 수행하고, 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 로딩, 유지 관리 및 평가 절차에 대한 설명과 함께 맞춤형 의학 접근법을 발전시킵니다.

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

당사는 VOP(vessels-on-a-plate)라고 하는 3D 바이오프린팅 기술을 사용하여 표준 6웰 플레이트에서 유연한 크기와 원하는 패턴을 가진 혈관 채널의 고처리량 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 손상된 내피와 관련된 질환에 대한 치료법 개발을 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 High-throughput Bioprinting 방법

여기에서는 전폐절제술을 모방하도록 설계된 OOC(Organ-on-Chip) 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 글리코칼릭스 손상과 전폐절제술 후 합병증 사이의 잠재적 상관관계를 조사합니다.

3D 유체 칩에서 폐절제술 후 내피 글리코칼릭스 모델링 - 혈관 기반 장기 온 칩 시스템 제작에 대한 접근 방식

배우세요 미세유체 플랫폼을 이용해 다세포 응집체에서 관류 가능한 혈관 네트워크를 구축하는 방법을. 이 기술은 체외 조직 모델에서 약물 전달을 시뮬레이션하여 재생의학 연구에 활용됩니다.

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

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