절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

이 프로토콜의 전반적인 목표는 부정맥성 심근병증 환자로부터 심장 중간엽 기질 세포를 분리하고, 지방 분화 적성을 테스트하고, 표면 마커를 표현형화하는 것입니다. 이 방법은 부정맥성 심근병증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 지방 치환 및 밑줄 분자 메커니즘에 심장 기질 세포의 관여와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 작은 심장 표본에서 몇 가지 간단한 통로로 장루 세포를 분리할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 부정맥성 심근병증 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 심근 생검이 필요한 심혈관 질환 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 우리는 장루 세포 분리 절차를 축소하여 심장 생검 및 전기 생리학에 적용할 수 있다는 것을 이해했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 연구했습니다.

이 프로토콜의 경우, 통합 전기해부학 매핑 및 심장 형광투시법을 사용하여 ACM 환자의 우심실에서 심내막 생검을 수집합니다. 약 5g의 조직을 TMES 배지에 담아 실험실로 보냅니다. 실험실에서 엔체틱 분해까지 절차를 수행하기 위해 필요에 따라 생물학적 안전 캐비닛을 설정합니다.

그런 다음 생검 결과를 플레이트에 옮기고 PBS로 두 번 세척합니다. 이 시점에서 생검은 현미경으로 사진을 문서화할 수 있습니다. 다음으로, 1ml의 콜라겐분해효소 용액이 들어 있는 2ml 튜브로 생검을 옮깁니다.

그 안에서 샘플을 0.5에서 1mm 너비의 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 90분 동안 조직을 지속적인 회전 교반으로 배양합니다. 다음으로, 분해된 용액을 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠릿을 PBS 1ml에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 튜브를 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 펠릿을 1ml의 TMES에 다시 현탁시킵니다. 이제 60mm 플레이트에 서스펜션을 플레이트하고 TMES를 사용하여 플레이트를 최대 3밀리리터까지 채우되 그 이상은 채우지 않습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 배양하고 확장하십시오.

시작하기 전에 세포 해리 시약, 세척 완충액 및 필요한 항체를 사용할 준비를 하십시오. 배양물의 추정 세포 수가 300만 개에 도달하면 100mm 플레이트를 10ml의 멸균 PBS로 두 번 세척합니다. 다음으로, 세포 해리 시약 5ml를 세포에 첨가하고 실온에서 7-10분 동안 플레이트를 배양하여 세포를 분리합니다.

세포가 분리되면 15ml의 PBS를 세포에 추가하고 현탁액을 50ml 튜브로 옮깁니다. 이제 세포를 원심 분리하고 펠릿을 1ml의 세척 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 세고 300만 개를 1.5ml의 세척 버퍼의 최종 부피에 있는 새 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 서스펜션을 12개의 팩스 튜브로 나눕니다. 각 튜브에 권장 농도에서 CMSC를 특성화하는 데 사용되는 항체를 추가합니다. isotype 컨트롤을 포함해야 합니다.

준비가 완료되면 튜브를 빛으로부터 차폐된 실온에서 15분 동안 배양합니다. 나중에 각 튜브에 1ml의 세척 버퍼를 추가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거한 다음 펠릿을 250마이크로리터의 세척 버퍼에 다시 현탁시킵니다.

이제 유세포 분석을 사용하여 세포를 특성화합니다. 세포의 지방형성 분화 후 ORO 염색을 사용하여 지질 축적을 테스트합니다. 시작하기 전에 ORO 작업 솔루션이 있는지 확인하십시오.

세포를 염색하기 전에 배지를 제거하고 2ml의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 4% 파라포름알데히드로 덮고 실온에서 5분 동안 고정시킵니다. 다음으로 파라 포름 알데히드를 버리고 2 밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 씻습니다.

두 번째 세척 후 세포를 덮을 수 있을 만큼 충분한 ORO 작업 용액을 추가합니다. 그런 다음 실온에서 한 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이 배양은 자동 솔루션이 작동하지 않는 환경에서 수행해야 하므로 전체 방은 권장되지 않습니다.

배양 후 ORO 용액을 흡인하고 PBS 세척에서 염색이 보이지 않을 때까지 그리고 현미경으로 볼 때 비특이적 염색이 검출되지 않을 때까지 2ml의 PBS로 세포를 여러 번 세척합니다. 이제 도립 조직 배양 위상차 현미경을 사용하여 20배 배율로 각 웰의 이미지 20개를 캡처할 수 있습니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다.

CMSC는 설명된 대로 심내막 생검에서 분리했습니다. 중간엽 계통을 확인하기 위해 세포를 적절한 플로로포어 접합 항체와 함께 배양하고 유세포 분석으로 분석했습니다. CMSC는 특정 중간엽 표면 항원 CD29, CD44 및 CD105에 대해 양성이었습니다.

CD90 양성 세포의 분율은 가변적인 것으로 알려져 있습니다. 내피 유산(endothelial heritage), 단핵구(monocyte) 또는 대식세포 유산(monocyte or macrophage heritage), 의성어(onomatopoetic heritage) 및 주요 조직적합성 복합체(histo-compatibility complex)에 대한 마커는 발현되지 않았다. 다음으로, CMSC를 지방생성 분화를 위해 T.ADIPO 배지에서 배양하고 ORO로 염색하여 세포 내 지질 방울을 찾았습니다.

부정맥성 심근병증 환자의 CMSC는 건강한 대조군의 세포보다 더 많은 지질 방울을 축적했습니다. 이러한 차이는 72시간 및 7일의 분화 조건에서 측정되었습니다. 일단 마스터하면 세포 해상도는 3시간, 염색은 2시간, 팩스 분석은 3시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 동일한 환자의 장루 세포를 사용하여 다른 자극에 반응할 수 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 약물 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 부정맥성 심근병증 분야의 연구자들이 인간 심장 기질 세포가 질병 발병에 관여하는 것을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.