Name: 절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 심장 중간 엽 기질 세포를 절연 및 특성화하는 방법을 부정맥성 심근병증 환자의 심내막 생검에서. 이 기법은 지방 대체 과정과 질병 기전 연구에 활용됩니다.

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이 작품의 건강, 검색 전류 센트 Cardiologico Monzino-IRCCS에 이탈리아 정부에 의해 투자 되었다.

헬싱키의 선언 준수이 접근 하 고 오른쪽 심 실 샘플의 컬렉션 (07/06/2012) "센트 Cardiologico Monzino IRCCS" 윤리 위원회에 의해 승인.
1입니다. 솔루션
<ol><li>C-MSC 문화에 대 한 TMES 매체와 Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM), 20% 보충 하 게 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 10000 U/mL 페니실린, 10000 µ g/mL 스, 그리고 0.02 M L-글루타민. TMES 매체 0.22 μ m 살 균 필터 단위를 사용 하 여 필터링 및 4 ° c.에 저장</li>
	<li>콜라 솔루션을 준비 하려면 콜라 NB4 믹스 3 mg/mL의 농도로 최종 솔루션을 얻기 위해 IMDM 매체에 resuspend. 분말, 그리고 콜라 솔루션 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링을 부드럽게 소용돌이. Aliquot 1 mL 2 mL 무 균 튜브에-20 ° c까지 사용 하기 위해 필요한 저장소 볼륨.</li>
	<li>10 %FBS, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (0.5 M의 농도에서 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 미리 희석 및 사용까지-20 ° C에서 보관), (사전 희석 1 µ M 날린 보충 T. ADIPO 매체를 준비, IMDM 매체 adipogenic 매체를 100 살 균 10 m m m m 및 더 희석에 DMSO에 증류수와 사용까지-20 ° C에서 보관) 및 0.1 m m indomethacin (0.5 M의 농도에서 DMSO에 미리 희석 및 사용까지-20 ° C에서 보관). T. ADIPO 매체 0.22 μ m 살 균 필터 단위를 사용 하 여 필터링 및 4 ° c.에 저장</li>
	<li>세척 버퍼 인산 염 버퍼 염 0.0067 M 포4 (PBS), ethylenediamine 테 트 라 아세트산 (EDTA) 구성 준비 5 밀리미터, 및 5% 소 혈 청 알 부 민, 그리고 4 ° c.에 게</li>
	<li>소 프로 파 놀 60%에서에서 1% 오로 분말을 용 해, 2 시간, 혼합 하 고 침전을 제거 하는 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 필터링 하 여 기름 빨간 O (오로) 작업 솔루션을 준비 합니다. 실 온 (RT)에서 작업 솔루션을 저장 합니다.</li>
</ol>2입니다. 심장 중간 엽 기질 세포의 고립
<ol><li>
심장 생 수집 및 처리 참고: 시작 하기 전에, 콜라 솔루션 및 준비 TMES 매체를가지고 있는지 확인.<ol>
<li>넣어 ACM endomyocardial 생 검 (보통 약 5 mg의 조직) 무 균 튜브에 TMES 채워지고 실험실에 수송. 참고: ACM biopsies 이전 보고서10에 따라 전기 생리학 수술 실에서 수집 됩니다. 간단히, 전기 해부학 매핑 및 우 심 실에서 intracardiac 심장 초음파의 통합 ( 비디오 1참조)을 사용 endomyocardial 생 검 ( 비디오 2, 참조 fluoroscopy)의 테두리 영역에 대응에는 질병 심근입니다. 건강 한 제어 (HC) 샘플 조직 바이오-은행, 죽음 (우발적인 죽음, 건강 한 과목)의 24 시간 안에 시체 기증자의 오른쪽 심 실 무료 벽에서 가져온에 의해 제공 됩니다. 전송 중 및 해 부 이전, 저장 생 검 TMES에 4 ° c.에 생 검 컬렉션 및 조직 처리 (최대 24 시간) 사이의 시간을 제한 합니다.</li>
		<li>설정 생물 안전 캐비닛 효소 소화까지 절차를 수행 하기 위해 필요한 솔루션.</li>
		<li>후드 아래 살 균 제를 넣고 온도 상승 200-250 ° c.까지 악기 사용 하기 전에 15 분 설정</li>
		<li>가 위를 소독 하 고 핀셋 10 s. 확인 확실히 소독된 계기는 사용 하기 전에 차가운. 일회용 멸 균 scalpels 준비.</li>
		<li>살 균 후드에 생 검 튜브를 놓습니다. 튜브를 열고 생 검 살 균 격판덮개로 전송 합니다.</li>
		<li>우 심 생 멸 균 PBS의 3 mL로 두 번 씻는 다. 당신이 원하는 경우에 현미경에서 생 검의 사진을 찍을.</li>
		<li>우 심 실 생 검, 콜라 솔루션의 1 mL를 포함 하는 메 마른 2 mL 튜브에 멸 균 핀셋을 사용 하 여 전송 합니다.</li>
		<li>살 균가 위 샘플을 0.5-1 m m3 조각으로 잘라.</li>
		<li>1.5 h 연속 회전 동요에서 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 소화 용액을 원심</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 펠 릿을 세척 살 균 PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 TMES 매체의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>얻은 정지 처리 살 균 60 m m 조직 문화 접시에 접시와 3 mL의 최종 볼륨을 TMES 매체를 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 접시를 품 어. 참고: 매체의 높은 볼륨 소화 생 조각의 정확한 접착을 방지할 수 있습니다.</li>
		<li>24 시간 후 매체 비 부착 한 세포와 파편 제거를 삭제 합니다. 참고: 단일 해리 중간 엽 세포 수 플라스틱 표면에 연결 하 고 일으키 다 클론; 또한, 소화 되지 않은 작은 생 검 조각 플라스틱 접시를 연결 하 고 셀 돋 아 허용 수 있습니다.</li>
		<li>살 균 PBS의 5 mL로 두 번 접시를 세척 하 고 신선한 TMES 매체의 3 개 mL를 추가.</li>
		<li>세포가 80% 합칠 때까지 주 번 3 TMES 매체를 교체 합니다. 참고: 연결 된 셀의 수에는 소화의 효율 및 품질, 조직의 금액에 따라 달라 집니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 셀 확장
참고: 시작 하기 전에 TMES 중간 준비 해야 합니다.
<ol><li>세포가 80 %confluent, 전송 하는 경우 새로운 살 균 60 m m 조직 문화에 소화 작은 bioptic 샘플 접시, 처리 하 고 신선한 TMES 매체의 3 개 mL를 추가. 참고: Bioptic 샘플 C-MSC 격리 추가 대 한 다시 사용 수 있습니다. 그것은 고립 된 세포 수가 될 때까지이 절차를 반복 수 있습니다.</li>
	<li>워시 살 균 PBS의 3 mL로 두 번 연결 된 셀. 트립 신-EDTA 솔루션 (0.5 mL 60 mm 접시에 대 한), 추가 하 고 셀 분리 수 있도록 3-5 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>셀은 접시의 표면에서 분리 때 하는 트립 신을 비활성화 하 고 새로운 50 mL 무 균 튜브에 세포를 수집 살 균 FBS의 0.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>접시 같은 튜브를 나머지 셀을 추가할 살 균 PBS의 5 mL로 두 번 씻는 다.</li>
	<li>실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 세포를 원심</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 TMES 매체의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>챔버를 계산 하는 셀에 셀 서 스 펜 션의 10 µ L을 로드 합니다. 참고: 셀은 너무 집중, PBS에서 초기 정지 1시 10분 희석 하 고 챔버를 계산 하는 셀에 희석 셀 10 µ L를 로드 하십시오.</li>
	<li>현미경에서 셀 3 큰 사각에 및 그들의 측면의 두 라인에 하 고 셀의 평균 수를 계산 합니다. 참고: 셀/mL의 수를, 계산된 셀의 평균을 곱합니다 104, 챔버를 계산 하는 셀의 희석 비율. 셀 더 희석 된, 경우 희석 비율에 대 한 증식. 씨앗을 셀 수와 세포 농도 (셀/mL의 수) 사이의 비율 초기 정지 (3.9 점) 다음 단계에 대 한 도금의 (mL)에 있는 볼륨에 해당 합니다.</li>
	<li>5000-10000 셀/c m2 의 최종 농도에 처리 살 균 100 m m 조직 문화 접시에 물의 resuspension 플레이트와 8 mL의 최종 볼륨을 TMES 매체를 추가 합니다. 셀 문화 인큐베이터에 접시를 품 어. 참고: 세포는 70-80% 합칠 때 셀 확장 절차를 반복 합니다. 모든 통로 (P)에 셀과 접시 나머지 금액의 일부를 cryopreserve 하는 것이 좋습니다. P3 또는 P4 셀을 확장 하 고 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 분석 (제 4) 및 adipogenic 차별화 (5 절)에 대 한 사용.</li>
	<li>실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 셀 원심 분리 후 cryopreservation에 대 한</li>
	<li>수 셀으로 (단계 3.7-3.8)을 설명 하 고 살 균 FBS의 900 µ L에 1 x 106 셀 resuspend. 메 마른 곳을 알아내는-유리병에 전송 및 살 균 DMSO와 섞어 100 µ L를 추가.</li>
	<li>신속 하 게 적어도 2 일 동안-80 ° C에서 냉동 컨테이너로 cryo-튜브를 저장 하 고 액체 질소에 튜브를 전송.</li>
</ol>4. Cytometry에 의해 심장 중간 엽 기질 세포의 특성
참고: 시작 하기 전에, 셀 분리 시, 세척 버퍼, 그리고 준비 하는 특정 항 체를가지고 있는지 확인 합니다.
<ol><li>휴대폰 번호에 도달 하면 적어도 3 x 106 (3.7-3.8에 설명 된 대로 셀 개수) 살 균 PBS의 10 mL로 두 번 100 mm 접시 세척.</li>
	<li>셀 분리 시 약의 5 mL을 추가 하 고 셀 분리 수 있도록 RT에서 7-10 분을 기다립니다.</li>
	<li>셀은 접시의 표면에서 분리 때 살 균 세척 버퍼의 15 mL를 추가 하 고 새로운 50 mL 무 균 튜브에 정지를 수집 합니다.</li>
	<li>두 번 버퍼를 세척의 10 mL와 함께 접시를 세척 하 고 나머지 셀 같은 관을 추가.</li>
	<li>RT에서 10 분에 대 한 400 x g에서 세포를 원심 및 버퍼 세척의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>단계로 설명 (3.7-3.8), 셀을 계산 하 고 새로운 무 균 튜브에 3 x 106 셀을 전송 1.5 mL의 최종 볼륨을 세척 버퍼를 추가. 참고: 총 셀 번호와 세척 버퍼의 총 볼륨 선택된 마커 분석 (각 FACS 폴리스 티 렌 튜브에 대 한 100 µ L에서 3 x 105 셀)에 대 한 사용의 수에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>100 µ L 12 다른 FACS 폴리스 티 렌 튜브에 세포 현 탁 액의 고 농도 제품 데이터 시트에 표시 된에서 특정 항 체를 추가. 참고: C-MSC 특성에 사용 되는 항 체 있습니다 CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14, 및 HLA-DR (표 1). 그것은 resuspended 세포 isotype 컨트롤 신호의 특이성을 확인을 물 들일의 100 µ L의 구성 컨트롤 샘플을 준비 하는 것이 중요.</li>
	<li>어둠 속에서 15 분 샘플을 품 어.</li>
	<li>반응을 중지를 각 튜브를 살 균 세척 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실시간에서 10 분에 대 한 400 x g에서 세포를 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 세척 버퍼의 250 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>Cytometry와 C-MSC 특성화를 진행 합니다.</li>
</ol>5. Adipogenic 심장 중간 엽 기질 세포의 분화
참고: 시작 하기 전에, T. ADIPO 매체와 오로 작업 솔루션을 준비 해야 합니다.
<ol><li>
T. ADIPO 매체 문화
	<ol>
<li>분리 하 고 셀 섹션 3에에서 설명 된 대로.</li>
		<li>살 균 6 잘 조직 문화의 각 음에 접시 3 x 105 셀 T. ADIPO 매체의 2 mL에 접시를 취급.</li>
		<li>C-MSC T. ADIPO 매체 72 h 또는 1 주, 보통 2-3 일 마다 변경 차별화 하자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기름 빨간 O 얼룩 참고: 사용 오일 레드 O (오로) C-MSC에서 지질 축적을 테스트 하려면 얼룩.<ol>
<li>6 잘 조직 문화 plateunder 연기 후드를 놓습니다.</li>
		<li>Adipogenic 매체를 제거 하 고 세척 2 mL의 PBS로 두 번 셀.</li>
		<li>각 커버 4 %paraformaldehyde (PFA)의 충분 한 볼륨 추가 잘. 실시간에서 5 분에 대 한 셀을 수정</li>
		<li>PFA 무시 하 고 PBS의 2 mL로 두 번 셀을 씻어.</li>
		<li>고정된 셀 오로 충분 한 볼륨을 사용 하 여 각을 커버 하는 RT에 1 시간에 대 한 작업 솔루션을 품 어 잘. 참고: 오로 작업 솔루션의 증발을 피하기 위해 오로 부 화 하는 동안 연기 후드 6 잘 조직 배양 플레이트를 보관 하지 마십시오.</li>
		<li>모든 오로 작업 솔루션을 제거 하 고 씻어 2 mL PBS 3-5 번까지 접시 완전히 청소 된다; 세척을 삭제 합니다. PBS 사용은 분명 하다 고 표시 되지 않으면, 현미경, 불특정 세포에서 얼룩이 지는 세척을 중지 합니다.</li>
		<li>거꾸로 조직 문화 단계 대조 현미경을 사용 하 여 각 잘 20 배 확대에 20 이미지를 캡처하십시오.</li>
		<li>셀 오로 누적 계량을 이미지 프로세싱 프로그램 그림을 엽니다.</li>
		<li>255-레드 채널에서 휘도을 측정 하기 위해 "채널 분할" 기능을 통해 다른 색상 채널을 구분 합니다.</li>
		<li>핵을 계산 하 여 각 사진에 대 한 셀의 개수를 계산. 휴대폰 번호에 오로 신호 강도 정상화.</li>
		<li>동일한 샘플의 각 그림에 대 한 얻은 결과의 평균을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

MSC와 C-MSC: MSC multipotent 셀 다른 성인 조직, 골 수, 지방 조직, 연골, 뇌, 피부, 태아 부속, 및 심장12등의 실질 부분에 있습니다. 다른 연구 분리 하 고 기본 및 변환 연구12,13의 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 특성 수행 되었습니다.
건강 한 조건에서 MSC는 무부하, 낮은 속도14에서 자체 갱신. 이후 그들은 환경 병 적인 변화에 노출 되는, 그들은 직접 transdifferentiation, 매트릭스 증 착, 또는 paracrine 효과14를 통해 육성 조직 리 모델링 반응.
심장 MSC (C-MSC) 심장4의 큰 비 myocyte 세포 인구를 나타냅니다. 그들은 epicardium에서 발생 하 고 상피-엽 전환15의 과정을 겪고 심근으로 마이그레이션할. 그들은 심장 구조, 생리와 cardiomyocytes와 세포 외 기질 항상성7,16상호 작용을 통해 병 적인 상태에서의 기계적 / 전기적 무결성에 기여할. 그러나, 광범위 한 범위의 C-MSC 기능은 아직도 완전히 이해 된다. 생리와 병 적인 조건에서 둘 다 생체 외에서 학문에 의해 촉진 될 수 그들의 역할의 더 깊은 지식을 그들의 격리 후 수행 합니다.
C-MSC는 인간의 마음, 심 방 부속 기2,17 등 우 심 실18의 다른 지구에서 얻은 되었습니다.
최근, C-MSC에서 인간의 오른쪽 심 실 endomyocardial bioptic 샘플을 되었습니다 가져올8, 소스 조직으로 3-5 밀리 그램으로 작은 것을 보여주는.
가능한 응용 프로그램: 이 원고에 설명 된 방법은 매우 작은 심장 표본에서 소화와 플라스틱 준수에 대 한 선택과 같은 몇 가지 간단한 구절에 포함 된 셀을 취득 수 있습니다.
C-MSC 이후 그들은 증폭 하 고 생체 외에서유지 하기 쉬운 엽 혈통 (endothelium, osteocytes, adipocytes)의 세포로 분화 할 수 셀 모델을 여겨질 수 있다. 또한, 환자에서 직접 셀을 얻기의 가능성 맞춤/정밀 의학의 맥락에서 기계 론 적인 연구에 대 한 훌륭한 체 외에 도구를 구성 합니다. 사실, 이러한 세포 유전 배경 및 기증자, 결국 특정 돌연변이 수행 하 고 임상 조건, 나이, 성별, 라이프 스타일, 그리고 약물 등 특정 환자의 특성에 의해 영향을 받습니다. 또한, 다른 표식에 대 한 정렬 가능성 특정 C-MSC 하위 집합19의 연구를 허용할 수 있습니다.
C-MSC는 다른 심혈 관 질환, 주로 심장의 개장 하는 불리 한 특징에서 활성 플레이어 알려져 있습니다. 따라서, 그들은 심장 질환8,20중화 소설 치료 전략에 대 한 후보 대상을 나타냅니다.
C-MSC 줄기 같은 속성 및 그들의 부족의 중요 한 immunogenicity 심장 재생 의학에 대 한 세포 치료에 그들의 잠재적인 응용 프로그램을 제안 합니다. 실제로, 골 수 또는 다른 소스에서 MSC, 같은 C-MSC 잠재적으로 사용할 수 헌와 기증자와 받는 사람21사이 일치를 위한 필요 없이 allogenic 설정에서.
또한, C-MSC, 직접 심장 조직에서에서 고립 되는 심장 마이크로-환경과 epigenetic 프로 파일에 의해 preconditioned 되 고의 이점이 있다. 심장 재생 의학의 맥락에서 특히 중요 한 성공적인 결과를 얻을 수 있습니다.
날짜 하려면, 재생 의학의 전 임상 연구 C-MSC 및 그들의 paracrine 활동18,,2223에 유용한 치료 가능성 확인. 중요 한 것은, 있는 셀 소스는 마음은 임상 시험 진행 cardiosfere 파생 셀 또는 C-MSC13,,2425의 부분 모집단 있습니다. 그러나, MSC 뼈 골 수 유래에 관해서는 다른 프로토콜 임상 등급 C-MSC26를 얻기 위해 필요한 수 있습니다.
C-MSC ACM에: 제시 프로토콜은 주로 endocardial 생 검 표시 된 병 리의 연구에 적합 하다. ACM 환자 진단 목적27bioptic 절차를 거칩니다. 그들의 심근 점차적으로 adipocytes과 섬유 증의 구성 전기 불활성 조직의 흉터 조직으로 대체 됩니다. 어디 진단 수율은 최대한, 흉터 영역에 bioptic 샘플링을 안내 하기 위해 endomyocardial 매핑 사용된10,,2829입니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 샘플 질병 심근의 테두리 영역에서 찍힌다.
Sommariva 외. 최근 ACM8, 때문에 그 마음에 preadipocytes는 엽 근원의 이다 C-MSC는 ACM 심장 지질에 적극적인 선수 시연의 병 인에서 C-MSC의 중추적인 역할을 정의 했습니다. 또한, C-MSC 격리 컨트롤 보다 지질 축적과 지질 둘 다 더 많은 경향을 보여 ACM 환자의 생 검에서 현재 프로토콜. 이러한 이유로,이 세포 일부 기계 연구9셀 모델의 적합성을 증명 하는 ACM의 분자 메커니즘을 확인 사용 수 있습니다.
제한 및 중요 한 단계: 환자 (단락 "가능한 응용 프로그램" 참조)에서 직접 C-MSC의 장점에도 불구 하 고이 프로토콜은 다른 제한을 받게 됩니다.
우선, 심장 bioptic 절차는 침략을 자주 엄격 하 게 필요한 경우. 실제로, 심장 조직 샘플링 윤리적으로 그리고 기술적으로 문제 이다. 심장 생을 수행 하기 위한 이유 차별 진단, 심장 이식의 상태를 모니터링 하거나 심장 종양30의 존재를 확인 cardiomyopathies의 맥락에서 확실 한 진단 달성 될 수 있습니다. 따라서, 단지 환자는 endomyocardial 생 검 합의 문을31 으로 표시 됩니다 C-msc 연구 등록할 수 있습니다. 또한, 심장 bioptic 절차 수 있다 임상 합병증, 특히 cardiomyopathic 마음에. 따라서, electrophysiologist의 samplings은 항상 신중 하 고 bioptic 샘플 셀의 절연 저하, 매우 작은 수 있습니다. 미래 실험 콜라 농도 조정 또는 소화의 타이밍이이 문제를 해결할 수 있습니다.
C-MSC, 모든 기본 인간 세포로 모든 고기에 다른 과목 중 높은 가변성을 표시 합니다. 실제로, 다른 과목에서 셀 변수 환경 조절에 다른 유전자 뿐만 아니라 또한 복종 있습니다. 특히,이 실험에서 세포 격리, 성장, 및 adipogenic 분화에 높은 가변성 관찰 됩니다.
현재의 프로토콜의 중요 한 단계는 인정 해야 합니다. Bioptic 샘플 모 세관을 포함 하는 경우 그들은 C-MSC 문화를 오염 시킬 수 있습니다 및 FACS 분석 (CD31 양성)에 의해 명시 될 수 있다 내 피 세포의 병렬 분리를 피하기 위해 제거 되어야 합니다. 효율적인 adipogenic 차별화를, 세포 활성 성장 단계에 있어야 합니다. 합류의 정도 지질 축적에도 영향을 미칠 수 있습니다.
방법의 중요성: 중간 엽 기질 세포의 고립의 이전 방법에 관하여 이것이 처음으로 인간의 심 실 bioptic 샘플에서 직접 C-MSC 획득의 설명 자세히 제시 된다. 이 메서드는 ACM 환자 샘플의 처리에 대 한 제안, 하지만 잠재적으로 심장 생 검 표시 된 모든 환자에 적용 됩니다.
이 프로토콜은 종종 수집 하기 어려운 더 큰 심장 샘플32필요한 셀의 획득에 대 한 이전 방법의 유용한 구현을 나타냅니다.
또한, 샘플 소스 흥미로운 혁신을 구성합니다. 심 실 생 심장33에 일반적으로 수행 하는 동안이 프로토콜 오른쪽 심 실 무료 벽에서 가져온 계정 샘플에 걸립니다. 병 오른쪽 심 실 지역에서 파생 된 셀 버스와 관련 된 질병의 pathologic 상태의 대표 될 수 있습니다.
또한, 현재 프로토콜에 사용 된 시 약의 일부는 다른 C-MSC 격리와 차별화 방법32에 관하여 다른. 예를 들어 콜라가이 원고에 제안 된 형식이 혼합 클래스 I 및 클래스 II collagenases 분해 활동의 균형 비율. 또한, 소화 솔루션 같은 기저 매체 (IMDM) C-MSC 문화 매체, 고립 된 C-MSC 미래 성장 조건에 적응할 수 있도록 준비에 대 한 사용에 녹아 콜라 혼합 구성 되어 있습니다.
또한, 비록 전체 C-MSC 인구를 사용 하 여 셀 배치를 표준화 수 정렬 절차만 이러한 셀의 플라스틱 준수 속성을 통해 고립, 단순화는 immunophenotypic를 변경 하지 않고 구성 C-MSC의 특성입니다. T. ADIPO이이 원고에 제안 된 구성 adipogenic 차별화, 피하 인슐린 같은 다른 구성 요소에 의해 유도 된 변화 dysregulation 이어질 수 있다.
오로 색도계 강도 평가에 근거 하는 지질 축적 정량화의 제안된 방법 방법 백분율을 기준으로 비교 하는 경우 누적된 지질의 수량에 대 한 더 많은 정보를 제공 하는 또한, 오로 얼룩 긍정적인 세포. 종종 지질 축적에 오로 추출 하 여 계량 소 프로 파 놀과 그 흡 광도 측정 셀으로. 그러나,이 메서드는 더 많은 구절을 필요로 하며 가변성 소 프로 파 놀 증발 때문에 복종 된다.

중간 엽 기질 세포 (MSC)는 많은 조직1에 중요 한 지원 기능을 가진 성인 세포 이다. 골, MSC의 역사적 소스 하지만 그들은 태 반, 지방 조직, 탯 줄 혈액, 간, 그리고 심장1,2를 포함 하 여 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다.
2006 년에, 국제 사회에 대 한 세포 치료 (ISCT) 지정, 처음으로 인간 MSC3를 정의 하는 최소한의 조건을. 특히, MSC 플라스틱을 준수 하는 능력을가지고 있어야 합니다. 그들은 특정 표면 항 원 표현:는 양성 CD44, CD105, CD29, CD90 엽 마커 및 부정적 CD14, CD45, CD34, CD31 조 혈과 내 피 마커 특징 MSC. HLA-DR의 부족 표현으로 인해 MSC는 alloreactivity를 실행할 수 수 없습니다. 또한, 그들은 adipogenic, chondrocyte, 및 osteoblast 계보1,3으로 차별화 하는 잠재력을 가진 multipotent 셀.
심장 세포 구성에 초점을 맞추고, 심장 중간 엽 기질 세포 (C-MSC) 정상적인 성인 심장4,5에서 풍부한 있습니다. 그들은 모두 정상적인 심장 기능 및 병 적인 조건에 중요 한 역할. 순수, 심근의 구조 및 기능적 무결성을 지 원하는 microenvironment를 제공 하는 C-MSC, 심장 질환에서 그들은 상처 치유와6을 개장 하는 거리에 참여 하는 심장 부상에 대 한 응답에서 활성화 됩니다 ,7.
최근, arrhythmogenic 심근 (ACM) 지방 대체에서 C-MSC의 참여 시연된8되었습니다. 특히, ACM 주로 우 심 실9에서 주로 심근 fibro 지방산 보충 하는 desmosomal 유전자에 있는 돌연변이 의해 발생 하는 유전 질환 이다. Endocardium, epicardium에서 연장 하는이 대체 비 전도성 기판 elicits 진보적인 심장 마비를 악화, 심한 경우, 갑작스런 죽음에 지도할 수 있는 심 실 부정맥을 만듭니다. Sommariva 외. 시연 사전 adipocytes의 간 엽 기원 ACM 환자의 explanted 심장 섹션에 존재. 또한, C-MSC ACM 마음 익스프레스 desmosomal 유전자의 endomyocardial 생 검에서 격리 하 고 따라서 그들의 변이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 특히, 조건 하에서 adipogenic, ACM C-MSC 제어 마음에서 그 보다 더 많은 지질 축적. 이 증거 C MSC와 질병 병 인에 있는 활동적인 역할 ACM 공부를 유효한 셀 모델을 나타내는 결론에 이르게.
이런이 맥락에서 또는 다른 심장 질환 심장 생은 표시에서 미래 연구를 촉진 하기 위하여 상세한 프로토콜 endomyocardial 조직, 그들의 확장, 그들의 면역 phenotypical의 작은 파편에서 C-MSC의 격리에 대 한 제시 특성, 그리고 adipogenic 차별화입니다.

<table><tbody><tr>Life Technologies의 <td>IMDM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>12440053</tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토 마이신</td><td>생명 기술 이탈리아</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 NB4</td><td>서비스</td><td>17454.02</td><td></td></tr><tr><td>기본 섬유 아세포 성장 인자</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>L- 글루타민</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Tryple select 1X (세포 해리 시약)</td><td>Gibco</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 솔루션&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6689</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>3-이소부틸-1-메틸크산틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>시그마-알드리치</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>인도메타신</td><td>시그마-알드리치</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>시그마-알드리치</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA) 용액 4%, PBS,</td><td>DBA, Italia S.r.l.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>항체 CD14-FITC (M&phi; P9)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>345784</td><td></td></tr><tr><td>항체 Integrin &beta; 1 (CD29)-PE (clone MAR4)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561795</td><td></td></tr><tr><td>항체 PECAM-1 (CD31)- APC&nbsp; (클론 9G11)</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>항체 Hematopoietic 전구 세포 항원 (CD34)-APC (클론 581)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>CD34-581-05</td><td></td></tr><tr><td>항체 H-CAM (CD44)-PE&nbsp; (클론 G44-26)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>항체 L-CA (CD45)-APC (clone HI30)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD4505-4</td><td></td></tr><tr><td>항체 THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561969</td><td></td></tr><tr><td>항체 Endoglin (CD105)-APC (clone 266)</td><td>Becton Dickinson</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>항체 HLA-DR-FITC (클론 L243)</td><td>Becton Dickinson</td><td> 347400</td><td></td></tr><tr><td>Gima Quick Plus 살균기</td><td>Gima&nbsp;</td><td>35642</td><td></td></tr><tr><td>벤치 원심분리기 Sigma 3-16K</td><td>Sigma 원심분리기</td><td>10330</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 냉동 컨테이너</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>AxioVert 200M 현미경&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>B 40-080 e 03/01</td><td></td></tr><tr><td>FACS Gallios</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>773231AF</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (이미지 처리 프로그램)</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup 필터 유닛</td><td>Merck S.P.A.&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGPU05RE</tr><tr><td>코니컬 튜브, 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122178</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tubes, 15 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC 처리 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC 처리 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 TC 처리된 다중 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드-바텀 튜브, 5 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>브랜드&nbsp; 계수 챔버 BLAUBRAND B&uuml; rker-T&uuml; rk</td><td>시그마-알드리치</td><td>BR719520</td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 endomyocardial bioptic 샘플의 arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

정상적인 성인 심장 중 심장 mesenchymal stromal 세포는 풍부한 인구를 대표 하는 여러 다른 세포 유형, 구성 됩니다. 이러한 셀의 심장 질병에 그들의 참여의 가능성을 제공 하 고, 또한, 생물 학적 메커니즘을 조사 하는 유용한 1 차 셀 모델을 제공 합니다.
여기, arrhythmogenic 심근 환자의 bioptic 샘플에서 C-MSC의 격리에 대 한 방법을 설명 합니다. Endomyocardial 생 검 샘플링 전기 해부학 매핑에서 시각 흉터에 인접 한 오른쪽 심 실 지역에서 가이드입니다. 콜라와 C-MSC 성장 수 있도록 문화 매체에서 플라스틱 접시에 그들의 도금 biopsies의 소화 설명 되어 있습니다. 몇 구절에 대 한 문화에서 고립 된 셀을 확장할 수 있습니다. 확인 하 고 그들의 엽 형, 면역 phenotypical 특성의 설명 제공 됩니다. C-MSC adipocytes, chondrocytes, osteoblasts 같은 여러 세포 유형으로 분화 할 수 있다: 맥락에서 ACM의, 환자의 마음에 체형 예금, C-MSC의 adipogenic 차별화에 대 한 프로토콜 특징 및 지질 방울 축적의 특성을 설명 합니다.

심장 stromal 세포 격리: Endomyocardial 생 검 절차에서 C-MSC 격리는 그림 1에 요약 됩니다.
심장 stromal 세포 엽 특성: 세포 치료 (ISCT)에 대 한 국제 사회에 의해 설립, multipotent mesenchymal stromal 세포를 정의 하기 위한 최소한의 기준을 자신의 면역 phenotypic 특성3포함 되어 있습니다. 특히, 그들의 엽 계보를 확인 하려면 셀 적절 한 FITC/PE/APC 활용 된 항 체와 알을 품 이며 cytometry에 의해 분석. C-MSC 특성에 사용 되는 항 체의 모든 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
그림 2에서 볼 수 있듯이 생 검에서 얻은 C-MSC는 특정 엽 표면 항 CD29, CD44와 CD105에 대 한 긍정적 이다. 11이전 보고 CD90 긍정적인 세포의 비율 변수입니다. 내 피 (CD31, CD34), monocyte/대 식 세포 (CD14), 조 혈 (CD45) 마커, 및 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (HLA-DR) 되지 않습니다 (그림 2)를 표현.
심장 mesenchymal stromal 세포 adipogenic 차별화: 그들의 adipogenic 차별화를, C-MSC ACM 및 HC에 의해 영향을 받는 환자에서 얻은 T. ADIPO 매체에 경작 될 필요가 (솔루션 섹션 참조). 셀 교체 매체 일주일에 두 번 72 h 또는 1 주에 대 한 문화에서 유지 됩니다.
세포내 지질 방울의 축적은 오로 얼룩 (그림 3)에 의해 입증 됩니다. ACM 및 HC에서 얻은 세포 사이 능력 뿐만 아니라, 차별화의 정도에 차이 관찰할 수 있습니다. 대표 이미지 에서처럼 ACM C-MSC 문화 adipogenic 매체 (그림 3)에서 72 h 후 더 많은 지질 방울 HC C-MSC 보다 축적. 이러한 차이 셀 더 긴 기간 (1 주) (그림 3)에 대 한 adipogenic 차별화 조건에 노출 되 면 또한 유지 됩니다.
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57263/57263video1.jpg"> 비디오 1: Electroanatomical 지도 intracardiac 심장 초음파의 통합. Endocardial 유 니 폴라 electroanatomical endomyocardial 생 검 (낮은 패널)를 겪 습 환자에서 우 심 실 (왼쪽된 앞쪽 오블리크 및 오른쪽 앞쪽 간접 보기)의 지도. 낮은 전압 (빨강/녹색)의 제한 된 영역 꼭대기에서 볼 수 있습니다. Endomyocardial bioptic 샘플 (태그 원)는 질병 심근을 interventricular 심장 서신에 수집 됩니다. 실시간 intracardiac 심장 초음파 검사 대상 지역 (위 패널)에서 bioptome의 정확한 위치를 수 있습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_1.avi" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/57263/57263video2.jpg"> 비디오 2: 오른쪽 앞쪽에 경사 보기에서 Fluoroscopy 비디오. bioptome 장기 deflectable 덮개를 통해 삽입 하 고는 심 실에 고급. 심근과 bioptome 접촉의 주의 깊은 검사 후 문 턱은 열리고 샘플을 수집 하도록 단단히 폐쇄. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_2.avi" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig1.jpg"> 그림 1: 절차 초안. Endomyocardial bioptic 샘플 bioptome 카 테 터, 작은 협공 모양의 절단 장비를 사용 하 여 수집 됩니다. 얻은 생의 무게는 약 5 m g (A). Endomyocardial bioptic 샘플은 무 균가 위 (B), 0.5-1 m m3 조각으로 다진 고 콜라 솔루션 추가 됩니다. 샘플은 소화 (C)의 1.5 h에 대 한 회전 플랫폼 믹서에 37 ° C 배양 기에 배치 됩니다. 소화 솔루션 centrifuged 이며 플라스틱 접시 (D)에 TMES에 도금. C-MSC 그들의 플라스틱 준수 속성 단일 셀 또는 클론, 또는 작은 소화 되지 않은 bioptic 조각 (E)에서 돋 아에서 얻을 수 있습니다. C-MSC cytometry (F) 다음 특징입니다. C-MSC는 adipogenic 매체에 도금 고 지질 방울 축적 기름 빨간 O 얼룩 (G)에 의해 테스트 됩니다. 눈금 막대 표시 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig2.jpg"> 그림 2: C-MSC의 대표적인 cyto-fluorimetric 프로필. 각 히스토그램 표시 된 채널에서 형광의 강도 대 셀 수를 보여 주는 (PE: phycoerythrin; APC: allophycocyanin; FITC: fluorescein-isothyocyanate). 각 그래프 isotype 제어 (화이트)와 샘플 특정 셀 활용 된 표면 마커 항 체 (레드)이 표시 됩니다. C-MSC는 엽 표면 항 원 CD29, CD44, CD105와, 부분적으로, CD90, 긍정적인 CD31, CD34, CD14, CD45, 및 HLA-박사를 표현 하지 않는 반면 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig3.jpg"> 그림 3: Adipogenic C-MSC의 차별화. ACM 및 HC C-MSC, 72 h 및 1 주, adipogenic 매체에서 경작의 대표 이미지 오로 물 들일 (왼쪽된 사진; n = 3). 오른쪽 그래프에서 255-레드 채널 얼룩의 광도의 정량화 보고: 강도 임의의 단위 (거리)에 표시 됩니다. ACM C-MSC 컨트롤 보다 더 많은 지질 방울 축적. 스튜던트 T-검정 사용 되었다 *: p &lt; 0.05. 눈금 막대 표시 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 문서에서는, endomyocardial bioptic 샘플의 arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 mesenchymal stromal 세포를 분리 하는 방법을 제공 됩니다. 그들의 특성 및 그들의 adipogenic 차별화를 강화 하는 프로토콜을 설명 합니다.

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 부정맥성 심근병증 환자로부터 심장 중간엽 기질 세포를 분리하고, 지방 분화 적성을 테스트하고, 표면 마커를 표현형화하는 것입니다. 이 방법은 부정맥성 심근병증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 지방 치환 및 밑줄 분자 메커니즘에 심장 기질 세포의 관여와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 작은 심장 표본에서 몇 가지 간단한 통로로 장루 세포를 분리할 수 있다는 것입니다.이 방법은 부정맥성 심근병증 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 심근 생검이 필요한 심혈관 질환 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 우리는 장루 세포 분리 절차를 축소하여 심장 생검 및 전기 생리학에 적용할 수 있다는 것을 이해했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 연구했습니다.이 프로토콜의 경우, 통합 전기해부학 매핑 및 심장 형광투시법을 사용하여 ACM 환자의 우심실에서 심내막 생검을 수집합니다. 약 5g의 조직을 TMES 배지에 담아 실험실로 보냅니다. 실험실에서 엔체틱 분해까지 절차를 수행하기 위해 필요에 따라 생물학적 안전 캐비닛을 설정합니다.그런 다음 생검 결과를 플레이트에 옮기고 PBS로 두 번 세척합니다. 이 시점에서 생검은 현미경으로 사진을 문서화할 수 있습니다. 다음으로, 1ml의 콜라겐분해효소 용액이 들어 있는 2ml 튜브로 생검을 옮깁니다.그 안에서 샘플을 0.5에서 1mm 너비의 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 90분 동안 조직을 지속적인 회전 교반으로 배양합니다. 다음으로, 분해된 용액을 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠릿을 PBS 1ml에 다시 현탁시킵니다.그런 다음 튜브를 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 펠릿을 1ml의 TMES에 다시 현탁시킵니다. 이제 60mm 플레이트에 서스펜션을 플레이트하고 TMES를 사용하여 플레이트를 최대 3밀리리터까지 채우되 그 이상은 채우지 않습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 배양하고 확장하십시오.시작하기 전에 세포 해리 시약, 세척 완충액 및 필요한 항체를 사용할 준비를 하십시오. 배양물의 추정 세포 수가 300만 개에 도달하면 100mm 플레이트를 10ml의 멸균 PBS로 두 번 세척합니다. 다음으로, 세포 해리 시약 5ml를 세포에 첨가하고 실온에서 7-10분 동안 플레이트를 배양하여 세포를 분리합니다.세포가 분리되면 15ml의 PBS를 세포에 추가하고 현탁액을 50ml 튜브로 옮깁니다. 이제 세포를 원심 분리하고 펠릿을 1ml의 세척 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 세고 300만 개를 1.5ml의 세척 버퍼의 최종 부피에 있는 새 튜브로 옮깁니다.다음으로, 서스펜션을 12개의 팩스 튜브로 나눕니다. 각 튜브에 권장 농도에서 CMSC를 특성화하는 데 사용되는 항체를 추가합니다. isotype 컨트롤을 포함해야 합니다.준비가 완료되면 튜브를 빛으로부터 차폐된 실온에서 15분 동안 배양합니다. 나중에 각 튜브에 1ml의 세척 버퍼를 추가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거한 다음 펠릿을 250마이크로리터의 세척 버퍼에 다시 현탁시킵니다.이제 유세포 분석을 사용하여 세포를 특성화합니다. 세포의 지방형성 분화 후 ORO 염색을 사용하여 지질 축적을 테스트합니다. 시작하기 전에 ORO 작업 솔루션이 있는지 확인하십시오.세포를 염색하기 전에 배지를 제거하고 2ml의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 4% 파라포름알데히드로 덮고 실온에서 5분 동안 고정시킵니다. 다음으로 파라 포름 알데히드를 버리고 2 밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 씻습니다.두 번째 세척 후 세포를 덮을 수 있을 만큼 충분한 ORO 작업 용액을 추가합니다. 그런 다음 실온에서 한 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이 배양은 자동 솔루션이 작동하지 않는 환경에서 수행해야 하므로 전체 방은 권장되지 않습니다.배양 후 ORO 용액을 흡인하고 PBS 세척에서 염색이 보이지 않을 때까지 그리고 현미경으로 볼 때 비특이적 염색이 검출되지 않을 때까지 2ml의 PBS로 세포를 여러 번 세척합니다. 이제 도립 조직 배양 위상차 현미경을 사용하여 20배 배율로 각 웰의 이미지 20개를 캡처할 수 있습니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다.CMSC는 설명된 대로 심내막 생검에서 분리했습니다. 중간엽 계통을 확인하기 위해 세포를 적절한 플로로포어 접합 항체와 함께 배양하고 유세포 분석으로 분석했습니다. CMSC는 특정 중간엽 표면 항원 CD29, CD44 및 CD105에 대해 양성이었습니다.CD90 양성 세포의 분율은 가변적인 것으로 알려져 있습니다. 내피 유산(endothelial heritage), 단핵구(monocyte) 또는 대식세포 유산(monocyte or macrophage heritage), 의성어(onomatopoetic heritage) 및 주요 조직적합성 복합체(histo-compatibility complex)에 대한 마커는 발현되지 않았다. 다음으로, CMSC를 지방생성 분화를 위해 T.ADIPO 배지에서 배양하고 ORO로 염색하여 세포 내 지질 방울을 찾았습니다.부정맥성 심근병증 환자의 CMSC는 건강한 대조군의 세포보다 더 많은 지질 방울을 축적했습니다. 이러한 차이는 72시간 및 7일의 분화 조건에서 측정되었습니다. 일단 마스터하면 세포 해상도는 3시간, 염색은 2시간, 팩스 분석은 3시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라 동일한 환자의 장루 세포를 사용하여 다른 자극에 반응할 수 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 약물 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 부정맥성 심근병증 분야의 연구자들이 인간 심장 기질 세포가 질병 발병에 관여하는 것을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

isolation-characterization-cardiac-mesenchymal-stromal-cells-from

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

여기서 제시된 프로토콜은 효소 소화를 통해 단일 세포 현탁액을 준비시킴으로써 인간 및 마우스 심근으로부터 대식세포 및 기타 비면역 세포의 다양한 서브세트를 분리하는 프로토콜이다. 유세포분석 기반 식별 및 절연 대식세포의 특성화를 위한 게이팅 방식도 제시된다.

인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

배우세요 심장 중간 엽 기질 세포를 절연 및 특성화하는 방법을 부정맥성 심근병증 환자의 심내막 생검에서. 이 기법은 지방 대체 과정과 질병 기전 연구에 활용됩니다.

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

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