Name: 돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 학습하세요 췌장암에서 돌이킬 수 없는 전기천공(IRE)의 효과를 면역유능한 시스네직 마우스 모델을 사용하여 연구하는 방법을. 이 기법은 종양 미세환경과 면역 반응에 대한 통찰을 제공합니다.

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이 공동 번역 상 연구 보조금 샌디에고 C3 박찬호 페달에 의해 자금 원인 (#PTC2017) 작동 RRW 지원을 받고 있다.

모든 동물 실험 수행 다음이이 프로토콜 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인을 받아야 한다. 여기에서 설명한 모든 절차는 IACUC UCSD에 의해 승인 되었습니다.
1. 조달 받는 동물
참고: KPC 뤽 4580 셀 라인 LSL Kra에서 발생 하는 종양에서 설립 되었다G12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL ROSA26 루크 / + 마우스 (KPC), C57BL/6 배경에 PC의 유전자 조작된 모델입니다. 이 셀 라인의 장점은 그것 constitutively orthotopic 모델에서 종양 모니터링 luciferase 활성화 표현 한다입니다. 그러나, 다른 셀 라인으로 그들은 받는 사람 쥐의 유전 배경와 호환 사용할 수도 있습니다.
<ol><li>사전에 실험 그룹 및 그룹 당 동물의 수를 결정 합니다.</li>
	<li>나이 (6-10 주 오래 된 마우스 권장)을 선택 하 고 섹스 가설 및 셀 선 사용 되는 동물의 사용.</li>
</ol>2. 문화 셀
<ol><li>사용 Dulbecco의 독수리 매체 (DMEM)을 수정: 영양소 혼합 F12 (50: 50) 미디어 KPC 뤽 4580 세포 성장 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린 스 항생제 (완전 한 성장 매체).</li>
	<li>동결, 해빙 세포 종양 이식 전에 4 일.</li>
	<li>무 균 조건 하에서 5% CO2 와 95% 습도 37 ° C에서 세포 성장.</li>
	<li>0.25% 셀 trypsinize 37 ° c를 도달 하기 전에 5 분 동안 트립 신 > 80 %confluency 트립 신 완전 한 성장 매체의 볼륨을 두 번 추가 하 여 무력화. 참고: 이러한 셀 할 설정 하지 종양 효율적으로 쥐에 그들은 100 %confluency 사용 하는 경우 또는 그들은 이상 12 회에 대 한 passaged는 경우. 따라서, 그것은 최적의 confluency에서 이전 구절에서 세포를 고정 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 적절 한 숫자는 존재 하는 경우 종양 유도를 진행 (0.5-1 x 106 셀/마우스). 그렇지 않은 경우에 적절 한 세포 수는 때까지 한 더 많은 통로 대 한 셀을 확장.</li>
</ol>3입니다. 평방 종양의 유도
<ol><li>필요한 재료 준비: P1000 및 P100 펫, 팁, 1 mL 주사기 25 G 바늘, 지하실 멤브레인 매트릭스 (BMM) DMEM 기저 미디어, 1.5 mL 튜브 원심. 프로시저의 끝까지 모든 재료 살 균과 감기 (4 ° C)를 유지. 또한 발기를 유지 하 고 알코올 면봉 동물 사용에 대 한 준비.</li>
	<li>Trypsinize (에 의하여 2.4 단계) 하 고 셀, 2 배속 감기 DMEM의 107 셀/mL의 농도에서 그들을 resuspend.</li>
	<li>100%의 동일한 볼륨을 추가 50%에서 최종 세포 현 탁 액을 만들기 위해 BMM BMM. 마지막 볼륨 세포 현 탁 액 요구 각 마우스의 50 µ L를 도달 해야 한다. 주사기에 pipetting 오류에 대 한 죽은 공간에 맞게 초과에서 10%를 준비 합니다.</li>
	<li>Aliquot 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 550 µ L 볼륨에 정지 얼음에 배치.</li>
	<li>동물 (6 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐)는 restrainer를 사용 하 여 억제 또는 수동으로. 참고: 또는, 쥐 수 수 anaesthetized 2.5 %isoflurane 정밀 기화 기를 사용 하 여 2 L/min의 유량에서 산소 가스에서와 함께.</li>
	<li>면도 선호 다리 위에 측면에 사용 하는 어 선 주사의 사이트. 알코올 면봉을 사용 하 여 두 번 주사의 사이트를 청소.</li>
	<li>감기 1 mL 주사기에 107 셀/mL x 1-2의 최종 농도에 세포 현 탁 액의 250 µ L 그리고 피스톤을 아래로 이동 하 여 모든 기포를 제거. 주사기에 25g 바늘을 연결 하 고 바늘 내 공간을 채우기 위해 확인 한다.</li>
	<li>조심 스럽게 옆구리, 복 막 구멍 또는 사지의 근육 바늘 피어스 하지 않습니다 확인 하 고 근처 시체에 30 ° 각도로 피부 밑에 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>평행 본문, 바늘을 평평 하 게 피부에 주름을 평평 하 게. 세포 현 탁 액의 50 µ L를 천천히 주사. 10에 대 한 주입의 위치에 바늘을 잡고 어떤 누설을 방지 하기 위해 응고 BMM 있도록 s.</li>
	<li>천천히 그것을 유지 하는 어떤 측면 운동 없이 병렬 바늘 철회. 부드럽게 알코올 면봉과 주사의 사이트를 청소 하 고 그 주택에 마우스를 놓습니다. 참고: 마우스는 절차 동안 마 취를 하는 경우 그것은 righting 반사를 차릴 때까지 동물을 모니터링 합니다.</li>
	<li>직경에서 5mm를 도달할 때까지 정기적으로 캘리퍼스를 사용 하 여 종양의 성장을 모니터링 합니다.</li>
</ol>4입니다. 유도 Orthotopic 종양의
<ol><li>필요한 재료를 준비 합니다. 오토 클레이 브는 수술 도구 등 지적 scalpels, 바늘 드라이버가 위 및 평면 밀고 집게. 편리한 무 균 봉합 (흡수 6-0 및 비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, 10 %povidone 요오드 솔루션, 수술 커튼, 난방 패드, buprenorphine, 및 마 취 에이전트 유지.</li>
	<li>(되도록이면 같은 배경 orthotopic 모델에 필요한)의 기증자 마우스를 안락사 느린 채우기 CO2 챔버를 사용 하 여 SQ KPC 종양을 들고. 소독 집게와 곧 orthotopic 이식 전에 microscissors를 사용 하 여 BSL-2 후드에서 무 균 조건 하에서 신중 하 게 평방 종양 삭제하시오 종양 절제 동안 복 막 구멍 찌를 세척 살 균 PBS의 2 교류와 즉시 종양을 주의.</li>
	<li>살 균 scalpels를 사용 하 여 1 m m3 조각으로 삭제 종양을 말하다, 그들 감기 균 DMEM 기저 미디어를 포함 하는 배양 접시에 놓고 이식까지 얼음에 저장.</li>
	<li>관리 받는 사람 마우스 0.05-1 mg/kg buprenorphine 진통제 SQ, 수술 전에 30 분.</li>
	<li>정밀 기화 기 (또는 다른 마 취 에이전트)를 사용 하 여 산소 (2 L/min)에서 2-3 %isoflurane 받는 사람 마우스 anesthetize 프로시저의 전체에 대 한 패드를가 열 하는 37 ° C에 마우스를 유지. 건조를 방지 하기 위해 눈에 윤활제를 적용 합니다. 놀라운 반사 처음의 부족에 의해 마 취의 깊이 테스트 하 고 부드러운 발가락 핀치에 페달 반사의 부족에 의해 외과 비행기 마 취를 확인 합니다. 전체 수술 중 마 취를 유지 합니다.</li>
	<li>그것의 뒤에 마우스를 놓고 부드럽게 복 부의 왼쪽 노출 되도록 그것의 오른쪽으로 설정 합니다. Depilatory 크림을 사용 하 여 마우스의 복 부를 제거 하 고 무료로 머리카락 복 부 게시물 절 개 입력 되도록 거 즈로 청소. 피부 소독에 알코올 잎사귀 뒤 10 %povidone 요오드의 3 주기를 사용 하 여 수술에 대 한 왼쪽된 복 부를 준비 합니다.</li>
	<li>살 균 메스를 사용 하 여 만들 1.5 c m 가로 또는 경사 절 개 피부, 흉 곽, 아래 중간의 왼쪽에 1 cm에서에서 비장을 약간 중간. 그런 다음, 복 부 근육, 미러링 overlying 표면 절 개를 통해 절 개를 확장 합니다.</li>
	<li>평면을 사용 하 여 비장 집게를 밀고 찾아서 부드럽게 복 부 구멍에서 그것을 외부화. 메 마른 면 주걱을 사용 하 여 비장을 철회 하 고 비장의 하단에 부착 된 췌 장의 꼬리를 찾을.</li>
	<li>평면 밀고 집게를 사용 하 여, 췌 장의 꼬리 옆으로 철회.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 위치를 벌금 (6-0) 살 균 suturing 바늘의 팁과 기증자 마우스에서 하나의 잘게 다진된 종양 조각 들고.</li>
	<li>동안 부드럽게 췌 장의 꼬리/몸 옆으로 축소, 췌 장의 꼬리에 종양 조각 포함 된 봉합 바늘을 삽입 합니다. 천천히 들고 췌 장 꼬리를 접촉 하 여 종양 조직을 통해 봉합을 전달 합니다. 조직에 관하여 단편의 방향에 따라 하나 또는 두 개의 추가 봉합을 적용 합니다.</li>
	<li>조직에서 바늘을 완전히 제거 하 고 췌 장/비장 추가 60 externalized 계속 출혈 또는 누출의 어떤 표시 든 지를 검사 하는 동안 s. 무딘 집게를 사용 하 여 복 부 구멍으로 그들을 부드럽게 internalize 다음.</li>
	<li>복 부 근육으로 6-0 흡수 봉합 사를 사용 하 여 연속 또는 중단 스티치 닫고 overlying 피부는 3-0 6-0 비 흡수 중단된 봉합 사를 사용 하 여 닫습니다. 이 시점에서 마 취를 중단 합니다.</li>
	<li>마우스와 음식 및 물의 홈 장에 복구를 허용 합니다. 회복을 촉진 하는 생리대에 케이지를 놓습니다. 복구 프로세스 동안 관류 등, 호흡 등 생체 신호를 모니터링 합니다.</li>
	<li>일단 마우스를 복구, 그리고 다음 반환 케이지 일반 주택 수 있는 반사를 righting의 징후를 확인 합니다.</li>
	<li>Buprenorphine 0.05-0.1 mg/kg를 관리, 수술 후 8-12 h 그리고 고통의 표시를 위해 필요에 따라 절차 후 모든 8-12 h.</li>
	<li>종양의 성장은 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 모니터링 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>이미징 orthotopic 이식 후 4 일에 시작 하 여 종양의 성장에 따라 고 이미징 일주일에 두 번 수행 합니다.</li>
		<li>화상의 날 (복 주입) 관리 D-소는 마 취에 30 mg/kg (산소 (2 L/min)에서 2-3 %isoflurane) 받는 사람 마우스 이미징 하기 전에 10 분.</li>
		<li>5 s 노출 자동 형광 무료 열띤된 무대와 쥐에 대 한 마 취 유지 하면서 발광 영상에서의 최소 배출 필터 없이 발광 설정을 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. SQ 종양의 분노
<ol><li>필요한 재료 준비: 정사각형 웨이브 electroporator, 안전 발 스위치, 전극 (족집게 trode 대 바늘 배열), 및 어댑터. 무 균 봉합 (비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, buprenorphine, 및 마 취약 또한 근처.</li>
	<li>족집게를 소독 하거나 살 균 가스를 사용 하 여 배열 전극 바늘. 압력가 마로 소독을 권장 하지 않습니다. 유리 구슬 소독 기를 사용 하 여 동물 사이의 전극 소독.</li>
	<li>관리 buprenorphine 0.05-0.1 mg/Kg는 종양 방위 쥐 절차 전에 30 분.</li>
	<li>단계 4.4-4.5 평방 종양 이식 5 m m 직경에 도달 하면 성공적으로 마우스 마 취를 유도 합니다.</li>
	<li>측면에 평방 종양에 액세스 하는 측면에 마 취 마우스를 놓습니다. 머리 깍 고 알코올 면봉을 사용 하 여 깨끗 한 피부를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>평방 종양 2 바늘 배열 전극 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 종양 사이트 바로 아래 피부를 상승 하 고 복 막 구멍을 침투 하지 않는 다는 것을 확인 하는 신체에 평행 하 게 피부를 통해 전극을 삽입. 일단 피부를 통해 그들은 종양 대괄호 같은 방법으로 전극 위치.</li>
	<li>100 µs 펄스 150 펄스의 총 1500 V/cm에서 1 Hz의 주파수에 전달 하기 위해 electroporator 프로그램. 발 페달을 사용 하 여 펄스를 제공 합니다. 10 10 펄스의 각 집합을 별도 s, 방열에 대 한 허용 하 고 전극의 올바른 위치를 확인. 참고: 마비 에이전트를 사용 하지 않고 마우스는 수동으로 확보 하지 않는 한 전극의 변위를 일으킬 수 있는 분노와 근육 수축 발생 합니다.</li>
	<li>electroporator에 표시 되는 실제 전압 전달, 200 미 레코드를 초과 하지 않아야 완전 한 주입 후 전극을 제거 합니다. 수 단계 4.14-4.16 당 분노를 다음 복구 하 쥐.</li>
</ol>6입니다. Orthotopic 종양의 분노
참고: orthotopic 종양의 분노는 따라서 시작 하기 전에 현지 IACUC에서 특별 한 승인 요구 같은 마우스에 두 번째 생존 수술을 포함 한다.
<ol><li>필요한 재료 준비: 압력솥 scalpels,가 위, 바늘 드라이버, 수술 도구 겸 자, 그리고 평면 집게를 밀고. 뿐만 아니라 인근 다음 유지: 무 균 봉합 (흡수 6-0 및 비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, 10 %povidone 요오드 솔루션, 수술 커튼, 난방 패드, 구형 파 electroporator 안전 발 스위치, 전극 및 그들의 어댑터, buprenorphine, 및 마 취약.</li>
	<li>Vivo에서 화상 진 찰에 의해 orthotopic 종양 성장 위한 쥐를 평가 (단계 4.17 참조) intraperitoneally D 소의 30 mg/kg을 주입 하 여. 참고: orthotopic 종양 종양 췌 장에 Luciferase 발광 이미지 ( 대표 결과참조)에서 볼 수 명확 하 게 표시 하 고 여전히 제한 된 때 분노 치료 8 ~ 10 일 포스트 주입에 이상적입니다.</li>
	<li>단계 4.4-4.9, 이식된 종양을 찾으려고 합니다. 종양 쉽게 찾을 하지 않으면 무딘 코 집게를 사용 하 여 위장과 비장 종양 식별을 부드럽게 이동.</li>
	<li>무딘 코 집게와 종양을 외부화 하 고 족집게 trode의 백 금 전극으로 단단히 종양. 단계 10 펄스 발 스위치에 의해 제어의 세트에서 구형 파 electroporator를 사용 하 여 5.7에서에서 프로그래밍 electroporation 펄스를 제공 합니다.</li>
	<li>적어도 60 s 게시물 출혈의 어떤 표시 든 지에 대 한 모니터링을 분노 externalized 종양을 유지. 기술된 이전 (단계 4.13-4.16)로 절 개 종양 복 부 구멍에 다시 삽입 닫고 복구 될 때까지 마우스를 모니터링 합니다.</li>
	<li>단계 4.17에 의하여 luciferase 이미징 vivo에서 를 사용 하 여 종양의 성장에 분노의 효과 모니터링 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 아무 관련 재정 공개를 있다.

이 연구에서 우리가 종양 성장에 분노의 효과 연구 하는 데 사용할 수 있는 PC에 대 한 immunocompetent 마우스 모델을 증명 하고있다. 현재, 분노 먼 질병의 수술 치료의 달 후에 진행 하지 않은 매우 선택한 로컬 고급 PC 환자에만 비 열 제거 기법으로 사용 됩니다. 그것의 사용 그러므로 제한 되었습니다 로컬 고급 PC 가진 대부분의 환자는 먼 전이성 질환20를 개발 하기 때문에. 이 모델은 다양 한 확장된 치료 매개 변수 및 조합을 사용 하 여 PC에 분노의 효과 평가 하는 연구를 기반으로 될 것입니다.
프로토콜 중 고려해 야 할 가장 중요 한 것은 분노를 수행 하는 종양의 크기. 쥐 모델에 대 한 상업적으로 이용 가능한 프로브는 그들의 전극 거리 (5-10 m m)에 의해 제한 됩니다. 따라서,에서 전극 거리 보다 훨씬 더 큰 종양, 불완전 절제가 일어난다. 평방 종양에 대 한 트위터-trodes 이상의 2 바늘 배열 ...

췌 장 ductal 선 암 (PC) 20201주위 미국에서 암 사망의 두 번째 주요 원인이 될 전망 이다. PC 진단 환자의 대부분은 먼 전이성 질환2에서 결국 죽을 것 이다. PC microenvironment는 악명 높게 면역 및 chemoresistant. 그것의 desmoplastic 기질 포함 이펙터 (안티 종양) T 세포의 부족 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam)을 포함 한 면역 백혈구의 굴지, 골수성 파생된 억제기 세포 (MDSCs), 및 규제 T 세포 (Tregs)3 . 이 microenvironment의 이러한 효과 중화 하는 복합 전략을 개발할 필요가 기반이 됩니다.
분노는 종양 절제의 비 열 방법으로 개발 되었습니다. 열 제거 기술, 달리 분노 빠른 coagulative 괴 사를 발생 하지 않습니다 있지만 대신 점진적 apoptotic 세포 죽음4에 결과. 중요 한 것은 췌 장 종양에 대 한 분노는 "열 싱크" 효과에 취약 하 고 혈관5옆 바로 수행할 수 있습니다. 이 기술은6 FDA 510(k) 허가 있으며 현재 사용 되 고 임상, 선택한 로컬 고급 또는 경계선 불과하다 췌장암 환자. 가장 큰 출판된 시리즈에서 분노의 PC7대, 분노를 받은 환자의 평균 생존 약 두 번 절제8,9없이 혼자 현대 화학 요법으로 치료 하는 환자의 생존이 했다.
몇몇 학문은 그 열 제거 (검토 추 외 에 다른 종양 유형에서 조직의 면역 반응 유도 설명 했다 10). 고주파 제거 (RFA) 동물 종양 모델 리드 증가 T 세포에에서 침투11,12, 간세포 암 환자13, 활성화 된 자연 킬러 (NK) 세포에 있는 증가 포함 하 여 14, 그리고 면역 Tregs 폐 암 환자15감소. 연구의 많은 더 작은 수는 면역, microenvironmental, 그리고 부상 응답 분노16을 시험 했다. 분노는 보조 (contralateral) 신장 세포 이식의 성장 또는 감소 했다 2 주 기본 종양의 분노를 예방할 immunocompetent 마우스 모델에서 조직의 면역 반응을 자극 하 표시 되었습니다 이전17. 그들은 또한 immunocompetent 쥐 immunocompromised 쥐 보다 완벽 한 회귀에 대 한 더 적은 전압 필요한 관찰. 그것은 분노의 열 제거, coagulative 괴에 비해 향상 된 항 원 프레 젠 테이 션 될 수 있습니다 하지만이 특별히 공부 하지는 가설 되어 있다.
KPC-뤽 4580 셀 선 (제이 예치 노스캐롤라이나 대학에서에서 선물), 남성 LSL Kra 개발한 종양에서 파생 되었다에서 PC의 syngeneic 마우스 모델 개발 했습니다G12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL ROSA26 루크 / + 마우스, 분노18,19의 지역 및 조직의 효과 공부 하. 이 luciferase 표현 셀 라인 면역성 이며 또한 immunocompetent C57BL/6 쥐에 tumorigenic SQ orthotopically를 주입 하 고 안정적으로 생산 하는 간 전이 비장에 주입 했을 때. 우리 두 바늘 배열 조사 (5 m m 구분) 또는 광장 또는 orthotopic 종양, 플래티넘 트위터-trodes를 사용 하 여 1500 V/cm의 비 전압/거리에 전기의 100 µs 펄스를 제공 하는 프로그래밍 가능 구형 파 펄스 발생기 활용에서 각각, 작은 동물에 분노의 효과 모델링 하 쥐.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 사각 파 전기포레이터</td><td>하버드 장치</td><td>BTX # 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr><tr><td>2 바늘 배열 전극</td><td>하버드 장치</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>안전 풋 스위치</td><td>하버드 장치</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 핀셋 트로드</td><td>하버드 장치</td><td>&nbsp; 45-0486</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>시그마-알드리치, Inc.</td><td></td><td></td>792632</tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>19090646</tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>NC1292810</tr><tr><td>D-luciferrin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; 스펙트럼 In Vivo 이미징 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Mouse strain C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>000664/블랙 6</td><td></td></tr><tr><td>세포주(KPC-Luc 4580)</td><td>노스캐롤라이나</td><td></td><td></td>대학교 J.J. Yeh Lab</tr><tr><td>BD Precisionglide 주사기 바늘</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>Z192406</tr><tr><td>알코올 면봉 (70 % 이소 프로필 알코올</td>) <td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>디지털 캘리퍼스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스, 멸균</td><td>VWR</td><td>21909</td><td></td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터</td><td>VWR</td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>봉합 바늘, 45cm, 크기 6-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>봉합 바늘, 45 cm, 사이즈 4-0</td><td>하버드 장치</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드 10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>일회용 보온 패드&nbsp;</td><td>켄트 사이언티픽 코퍼레이션</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>마우스 이발기</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>외과용 드레이프</td><td>하버드 장치</td><td>59-7421</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

돌이킬 수 없는 electroporation의 효과 공부 하는 syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

췌장암 (PC), 미국에서 약 40000 환자 년 죽이 질병은 성공적으로 유망한 immunotherapeutic 전략을 포함 한 여러 치료 접근을 피할 수 있습니다. 돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 따라서 종양 혈관 가까이 매우에 수행 하는 절차를 사용 하면 인접 한 collagenous 구조의 파괴 없이 종양 세포 죽음을 유도 하는 비 열 제거 기술 이다. 열 제거 기술, 달리 분노 유발 즉시 제거 괴 사, 함께 점진적 apoptotic 세포 죽음에 결과 이며 현재 로컬 고급 PC 선택 된 환자에 대 한 임상 사용. 융 제, 분노 같은 비 대상 특정 절차 종양 microenvironment에 반응의 무수 한을 유도할 수 있다. 몇 가지 연구는 다른 종양 유형, 종양 성장에 분노의 영향을 해결 하지만 아무도 PC에 집중 했다. 우리는 다양 한 경도 연구 포스트 절차를 용이 하 게 높은 통제 속에서 분노와 피하 (SQ)와 orthotopic 종양 대우 될 수 있다 성공적으로 PC의 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다. 이 동물 모델 분노와 분노의 임상 효능을 개선 하는 방법의 효과 연구 하는 강력한 시스템 역할을 합니다.

우리는 절차를 따라 위에서 설명한 고 5-6 주 오래 된 야생 타입 C57BL/6 쥐 50 %1 x 106 세포 주사에 평방 종양 생성 BMM. 종양 크기 직경에서 5-6 m m에 도달 하면 쥐의 몇 가지 했다 안락사, 그들의 종양 excised 했다 orthotopically 받는 사람 C57BL/6 쥐에 이식. 그림 1에 타임 라인에 같이 분노 수행된 10 일 게시물을 이식 했다. 분노는 베어링 평방 종양 나머지 쥐에서 수행 되었다.
SQ에 종양, 분노 전압 및 펄스 기간 했다 일정 하 게 유지 1500 V/cm 및 100 µs, 각각, 하지만 펄스 수 변화. 그림 2 는 몇 가지 생쥐에서 평방 종양 150 펄스 분노 하지만 뿐만 아니...

돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 로컬 고급 췌장암의 치료에 사용 하는 비 열 제거 기술입니다. 비교적 새로운 기술 이기 때문에, 종양 성장에 분노의 효과 제대로 이해 된다. 췌장암에 대 한 분노의 효과 공부 하 고 용이 하 게 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다.

돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

이 모델의 전반적인 목표는 면역 능력이 있는 마우스의 췌장암에 대한 비가역적 전기천공법(IRE)의 영향을 연구하는 것입니다. 이 모델은 췌장암에서 IRE의 역할에 관한 많은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, IRE는 국소 종양 미세환경에 어떤 영향을 미칩니까?이 모델의 주요 장점은 녹아웃 또는 돌연변이 마우스 모델 없이 면역 역량 시스템에서 정확한 종양 성장 평가를 용이하게 한다는 것입니다. 이 방법은 췌장암의 면역 능력이 있는 마우스 모델에서 IRE가 면역 체계에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 피하 종양 유도의 경우 먼저 마취된 6주 된 수컷 C57 블랙 식스 마우스의 주사 부위를 면도하고 알코올 면봉을 사용하여 해당 부위를 두 번 청소합니다.다음으로, 1밀리리터 당 7개의 셀과 250마이크로리터의 기저막 매트릭스에 1-2배 10을 넣은 차가운 1밀리리터 주사기를 로드합니다. 주사기에 25게이지 바늘을 부착하고 바늘에 종양 세포 현탁액을 로드합니다. 플런저를 몇 번 눌렀다 다시 집어넣어 기포를 제거합니다.주사 부위의 피부 아래에 30도 각도로 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 바늘을 몸과 평행하게 하여 종양 세포를 50마이크로리터씩 천천히 주입합니다. 10초 후 바늘을 천천히 빼내고 옆으로 움직이지 않고 평행을 유지하고 알코올 면봉으로 주사 부위를 부드럽게 닦은 후 마우스를 케이지로 되돌립니다.종양이 5-7mm에 도달하면 멸균 집게와 마이크로 가위를 사용하여 생물 안전 레벨 2 후드의 멸균 상태에서 복강에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 피하 종양을 절제합니다. 즉시 절제된 종양을 멸균 PBS로 두 번 세척합니다. 그리고 멸균 메스를 사용하여 종양을 1-2개의 입방체 밀리미터 조각으로 다지십시오.그런 다음 종양 조각을 얼음 위에 차갑고 멸균된 DMEM 기저 배지가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 종양 조각을 이식하려면 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후 마취된 수혜 동물의 눈에 연고를 바르고 마우스를 오른쪽에 놓아 복부 왼쪽이 노출되도록 합니다. 제모 크림으로 복모를 제거하고 거즈로 크림을 제거합니다.노출된 피부를 10% 포비돈과 요오드 및 알코올 물티슈 3회를 연속적으로 소독한 후 멸균 메스를 사용하여 피부를 1.5cm, 정중선 왼쪽으로 1cm, 흉곽 아래, 비장 약간 내측으로 절개합니다. 끝이 평평한 집게와 멸균 면 어플리케이터로 비장을 부드럽게 바깥

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 췌장암 발병을 위해 암성 기증자의 종양 조각을 비암성 수용자 마우스의 췌장으로 이식하는 단계적 수술 방법을 설명합니다. 정소적으로 이식된 PDAC는 기존의 피하(SC) 모델보다 인간 췌장암의 조직 미세환경을 더 정확하게 재현할 수 있습니다.

정소성 동종이식 종양 이식: 췌장 종양 마우스 모델을 생성하는 기술

이 비디오는 마우스에서 췌장 종양의 비열 절제를 위해 비가역적 전기천공법(IRE)을 수행하는 절차를 설명합니다. 피하(SQ) 종양과 정소성 종양 모두 고도로 통제된 환경에서 IRE로 성공적으로 치료할 수 있어 시술 후 다양한 연구를 촉진할 수 있습니다.

비가역적 전기천공법: 마우스의 췌장 종양을 절제하는 기술

이 비디오는 녹색 형광 단백질 발현 췌장암 세포를 마우스의 췌장에 이식하는 프로토콜을 보여줍니다. 정소성 마우스 모델은 원발성 및 전이성 종양에 대한 새로운 치료법의 효능을 조사하는 데 도움이 됩니다.

형광 정교성 마우스 모델: 생체 내 종양 진행을 평가하기 위해 암세포를 발현하는 GFP를 마우스에 이식

이 비디오는 종양 진행의 비침습적 모니터링을 위해 국소 세포 전달 및 생체 내 생물 발광 이미징을 위해 Matrigel을 활용하는 췌장암의 정소성 모델을 보여줍니다. 정소성 모델은 신유전 및 이종 이식 모델 모두에 적합하며 원발성 췌장 종양의 성장 및 전이에 대한 새로운 항암 치료제의 영향을 조사하기 위한 전임상 시험에 사용할 수 있습니다.

생물 발광 직소성 췌장암 마우스 모델: 마우스의 암 진행을 모니터링하기 위한 비침습적 기술

간 전이 전임상, 뮤린 모델 hemispleen 주입 기법을 통해 수행 하였다.

간 전이의 전임상 쥐과 모델

이 프로토콜의 목표는 마우스의 정소성 췌장 종양 이종 이식편에 동적 대비 강화 자기 공명 영상(DCE-MRI)을 적용하는 것입니다. DCE-MRI는 표적 조직의 미세혈관 구조를 분석하는 비침습적 방법이며, 새로운 요법 후 종양의 혈관 반응을 평가하는 데 유용합니다.

동소 이식 췌장 암 마우스 모델의 동적 대비 강화 된 자기 공명 영상

Balb-c Ola Hsd-Fox1nu 마우스의 췌장에 녹색 형광 단백질 발현 췌장암 세포(PANC-1 GFP)를 항소적으로 이식하여 종양 진행 및 전이를 평가하는 절차가 여기에 나와 있습니다.

췌장암의 형광 동소 이식 마우스 모델

우리는 모린 유래 췌장 선암 세포주를 직접 네이티브 종양 부위로 유도하는 초음파 유도 이식프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 주사 후 2-4주 이내에 초음파 스캐닝에 의해 검출가능한 췌장 종양을 초래하고, 외과 정형외과 이식에 비해 각막벽에 종양 세포 파종을 현저히 감소시켰다.

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

임상 맥락에서, 국소췌암을 가진 환자는 부주 처리를 선행한 pancreatectomy를 겪게 될 것입니다. 여기에서 보고된 이 프로토콜은 말단 판생성 절제술 및 비장 절제술다음에 췌장암의 정형소 이식을 통해 누드 마우스에서 이 임상 시나리오를 모델링하는 안전하고 효과적인 방법을 확립하는 것을 목표로 합니다.

췌장암의 정형소 절제술 마우스 모델

췌관 선암종(PDAC)의 Syngeneic mouse orthotopic 동종이식편은 질병 아형의 생물학, 표현형 및 치료 반응을 요약합니다. 빠르고 재현 가능한 종양 진행으로 인해 전임상 연구에 널리 사용됩니다. 여기에서는 syngeneic murine PDAC 배양을 췌장에 주입하여 이러한 모델을 생성하는 일반적인 방법을 보여줍니다.

췌장암을 모델링하기 위한 Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts

본 프로토콜은 췌관 폐쇄를 유발하기 위해 췌관의 시각화 및 췌관의 전기응고를 포함하는 만성 폐쇄성 췌장염을 모델링하는 새로운 접근 방식을 설명합니다.

전기응고술을 통해 확립된 폐쇄성 만성 췌장염 모델

학습하세요 췌장암에서 돌이킬 수 없는 전기천공(IRE)의 효과를 면역유능한 시스네직 마우스 모델을 사용하여 연구하는 방법을. 이 기법은 종양 미세환경과 면역 반응에 대한 통찰을 제공합니다.

돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

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