돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

이 모델의 전반적인 목표는 면역 능력이 있는 마우스의 췌장암에 대한 비가역적 전기천공법(IRE)의 영향을 연구하는 것입니다. 이 모델은 췌장암에서 IRE의 역할에 관한 많은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, IRE는 국소 종양 미세환경에 어떤 영향을 미칩니까?

이 모델의 주요 장점은 녹아웃 또는 돌연변이 마우스 모델 없이 면역 역량 시스템에서 정확한 종양 성장 평가를 용이하게 한다는 것입니다. 이 방법은 췌장암의 면역 능력이 있는 마우스 모델에서 IRE가 면역 체계에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 피하 종양 유도의 경우 먼저 마취된 6주 된 수컷 C57 블랙 식스 마우스의 주사 부위를 면도하고 알코올 면봉을 사용하여 해당 부위를 두 번 청소합니다.

다음으로, 1밀리리터 당 7개의 셀과 250마이크로리터의 기저막 매트릭스에 1-2배 10을 넣은 차가운 1밀리리터 주사기를 로드합니다. 주사기에 25게이지 바늘을 부착하고 바늘에 종양 세포 현탁액을 로드합니다. 플런저를 몇 번 눌렀다 다시 집어넣어 기포를 제거합니다.

주사 부위의 피부 아래에 30도 각도로 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 바늘을 몸과 평행하게 하여 종양 세포를 50마이크로리터씩 천천히 주입합니다. 10초 후 바늘을 천천히 빼내고 옆으로 움직이지 않고 평행을 유지하고 알코올 면봉으로 주사 부위를 부드럽게 닦은 후 마우스를 케이지로 되돌립니다.

종양이 5-7mm에 도달하면 멸균 집게와 마이크로 가위를 사용하여 생물 안전 레벨 2 후드의 멸균 상태에서 복강에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 피하 종양을 절제합니다. 즉시 절제된 종양을 멸균 PBS로 두 번 세척합니다. 그리고 멸균 메스를 사용하여 종양을 1-2개의 입방체 밀리미터 조각으로 다지십시오.

그런 다음 종양 조각을 얼음 위에 차갑고 멸균된 DMEM 기저 배지가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 종양 조각을 이식하려면 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후 마취된 수혜 동물의 눈에 연고를 바르고 마우스를 오른쪽에 놓아 복부 왼쪽이 노출되도록 합니다. 제모 크림으로 복모를 제거하고 거즈로 크림을 제거합니다.

노출된 피부를 10% 포비돈과 요오드 및 알코올 물티슈 3회를 연속적으로 소독한 후 멸균 메스를 사용하여 피부를 1.5cm, 정중선 왼쪽으로 1cm, 흉곽 아래, 비장 약간 내측으로 절개합니다. 끝이 평평한 집게와 멸균 면 어플리케이터로 비장을 부드럽게 바깥쪽으로 만들고 집게를 사용하여 비장 아래쪽에 있는 췌장 꼬리를 옆으로 집어넣습니다. 멸균 겸자를 사용하여 미세하게 다진 종양 조각 하나를 잡고 미세한 6-O 멸균 봉합 바늘을 조각에 통과시킵니다.

종양 조각이 들어있는 바늘을 췌장 꼬리에 삽입하고 봉합사를 조직을 통해 천천히 통과시킵니다. 종양이 발생하지 않도록 종양과 복벽 근육 및 복막 사이의 접촉을 피하도록 주의하십시오. 종양 조각이 고정되면 조직에서 바늘을 완전히 제거하고 장기를 완전히 외부화한 상태로 60초 동안 유지하면서 출혈의 징후가 있는지 검사합니다.

출혈이 관찰되지 않으면 뭉툭한 집게나 면봉 어플리케이터를 사용하여 비장, 췌장 및 종양을 복강으로 부드럽게 되돌려 놓습니다. 종양의 직경이 6mm에 도달하기 전에 마취된 동물을 종양에 접근할 수 있도록 오른쪽에 눕히고 이발기와 알코올 면봉을 사용하여 종양 부위를 청소합니다. 겸자를 사용하여 종양 바로 아래의 피부를 들어 올리고 몸과 평행하게 피부를 통해 두 개의 바늘 배열 전극을 삽입하여 전극이 복막강을 관통하지 않도록 주의하면서 종양을 브래킷화합니다.

electroporator가 100 헤르츠 주파수에서 1500 볼트/센티미터로 총 150 펄스에 대해 150 마이크로 초 펄스를 전달하도록 설정하고 풋 페달을 사용하여 펄스를 전달하고 각 10 펄스 세트를 10 초씩 분리하여 각 펄스 세트 사이의 열 방출을 허용합니다. IRE 전달 중에 근육 경련이 발생하고 초기 펄스 세트 중에 더 뚜렷하게 나타나므로 전극이 여전히 원하는 위치에 있고 각 펄스 세트 후에 동물이 여전히 진정되었는지 확인하십시오. 투여 200초 이상 경과하지 않은 후 전극을 제거하고 전기천공기에 표시된 대로 전달된 실제 전압을 기록합니다.

그런 다음 마우스를 케이지로 되돌립니다. 종양 이식 후 8-10일 후에 정소성 종양의 IRE의 경우, 뭉툭한 코 집게를 사용하여 집게로 종양을 외부화하고, 핀셋의 백금 전극으로 종양을 단단히 포획하고, 방금 설명한 대로 전기천공 펄스를 전달하여 최소 60초 동안 마지막 펄스 세트 동안 종양을 외부화된 상태로 유지합니다. 출혈의 징후를 모니터링합니다. 그런 다음 종양을 복강으로 되돌리고 시연된 대로 절개 부위를 봉합하고 동물이 완전히 회복될 때까지 동물을 모니터링합니다.

이 대표적인 실험에서, 거의 50%의 쥐에서 피하 종양이 150번의 IRE 펄스 후에 완전히 퇴행했으며, 75번의 펄스 후에 경미한 퇴행만 있었습니다. IRE가 있은 지 일주일 후, 종양 조직에 대한 조직학적 분석을 통해 대조군에서 관찰되지 않은 큰 부위의 중심 종양 괴사가 밝혀졌고, 치료되지 않은 종양이 발견되었으며, 불완전한 종양 퇴행의 경우 살아있는 종양 조직이 측면에 있었습니다. 이식된 정소성 종양의 성장률을 모니터링한 결과, 수용 동물에서 시간이 지남에 따라 일관된 종양 성장이 나타났으며, 이는 IRE에 의해 중단될 수도 있으며, 이는 면역 능력이 있는 마우스 모델에서 IRE의 효과를 시뮬레이션할 수 있는 이 모델의 능력을 입증했습니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 마우스 한 마리당 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 종양이 클수록 불완전한 절제술로 인해 일관되지 않은 반응을 일으키기 때문에 사용 가능한 IRE 전극의 작동 거리 내에서 종양 크기를 유지하는 것이 중요합니다. 방사선 요법 또는 화학요법과 같은 다른 치료 접근법도 치료를 결합하는 것이 IRE에 대한 종양 반응을 개선할 수 있는지에 대한 추가 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 생쥐에서 피하 및 정소성 췌장암을 확립하는 방법과 이러한 종양에 IRE를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.