신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

이 방법은 출생 후 발달과 같은 유전 및 신경 발달의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 집에서 만든 장치를 사용하는 간단한 기술이라는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것은 뇌에 표적 주사를 놓으려면 세부 사항에 대한 완전한 주의가 필요하기 때문에 매우 중요합니다.

시작하려면 정위 장치에서 신생아 강아지를 사용할 수 있는 홀더를 만드십시오. 먼저 헤드 트레이를 만듭니다. 1.5ml 원심분리기 튜브의 바닥을 약 1/5 잘라내어 신생아 강아지의 머리를 위한 구멍을 만듭니다.

다음으로, 입체택시 장치의 받침대에 맞는 빈 피펫 팁 상자를 선택합니다. 그런 다음 뜨거운 접착제를 사용하여 헤드 트레이를 팁 상자 바닥에 고정합니다. 다음으로, 머리가 고정되어 있는 동안 강아지의 몸통을 지탱할 수 있는 상자에 조직 삽입 카세트를 붙입니다.

이제 주사를 위해 30 게이지 스테인리스 스틸 바늘을 준비합니다. 먼저, 유리병에 클로로포름에 3일 동안 담가 미리 세척합니다. 3 일 후, 바늘을 조심스럽게 제거하고 절대 에탄올로 20 분 동안 50rpm의 교반으로 씻으십시오.

그런 다음 70 % 에탄올에 3 번 씻고 10 분 동안 교반으로 씻으십시오. 세척 후에는 바늘을 자연 건조시키고 사용할 때까지 실온의 깨끗한 상자에 보관하십시오. 미세 사출 어셈블리의 경우 PE20 폴리에틸렌 튜빙의 5cm 세그먼트를 사용하여 PE10 튜빙을 26 게이지 10 마이크로리터 주사기에 연결합니다.

시아노아크릴레이트로 접합부를 고정합니다. 그런 다음 새 30게이지 주사 바늘을 PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 장착합니다. 이제 10마이크로리터 마이크로사출 주사기를 로드합니다.

플런저를 제거하고 다른 25 게이지 주사기를 사용하여 어셈블리에 오토클레이브 증류수를 다시 로드하여 튜브에서 공기를 제거합니다. 그런 다음 플런저를 마이크로리터 주사기에 다시 놓고 배럴에 2마이크로리터의 증류수만 남을 때까지 플런저를 밉니다. 다음으로, 마이크로리터 주사기를 마이크로플로우 주사기 펌프에 조심스럽게 장착합니다.

그런 다음 실험용 바이러스 액체에서 소량의 여과된 0.1%Fast Green 염료를 파라필름 조각에 피펫으로 넣습니다. 이제 주사 바늘과 튜브 사이에 기포가 보일 때까지 주사기로 소량의 공기를 흡입합니다. 그런 다음 0.7마이크로리터의 여과된 Fast Green 용액을 로드하여 미세 주입 튜브의 유체 흐름을 테스트합니다.

흐름이 양호하면 또 다른 소량의 공기를 흡입하여 두 번째 기포를 만들고 주입 용액을 미세 주입 튜브에 로드합니다. 정위 장치에 미세 주입 바늘을 부착하고 고정하고 신생아 마우스의 미세 주입을 진행합니다. 수술을 준비하기 위해 70% 에탄올로 입체 기구를 철저히 닦고 70% 에탄올로 수술 기구를 살균합니다.

그런 다음 저체온증을 사용하여 신생아를 마취합니다. 강아지를 라텍스 장갑에 넣고 으깬 얼음에 목까지 5분 동안 담급니다. 그런 다음 집게로 강아지의 발을 꼬집어 페달 반사가 없는지 확인합니다.

다음으로, 장갑을 낀 강아지를 헤드 트레이에 놓고 라텍스 슬리브 주위에 으깬 얼음을 넣어 저체온증 마취를 유지합니다. 그런 다음 강아지의 머리를 70% 에탄올로 문지르고 람다 랜드마크를 찾습니다. 마커로 표시하십시오.

그런 다음 바늘 끝을 람다로 향하게 하고 전방/후방 및 내측/외측 좌표를 0으로 설정합니다. 다음으로, 뇌 지도를 참조하여 주입 팔을 목표 부위로 이동합니다. 예를 들어, P2 새끼의 선조체는 람다보다 2.4mm, 정중선 양쪽으로 1.0mm, 배쪽으로 1.7mm입니다.

다음으로 펜을 사용하여 PE10 튜브의 패스트 그린 염료 위치를 표시합니다. 그런 다음 바늘 끝이 두개골 표면에 닿을 때까지 피부와 두개골을 통해 바늘을 천천히 관통하기 시작합니다. 등쪽/복부 좌표를 0으로 설정합니다.

그런 다음 바늘을 목표 부위로 천천히 내립니다. 제자리에 놓이면 실질이 정상 모양으로 돌아갈 때까지 1분 동안 기다립니다. 그런 다음 분당 100나노리터로 미세 주입 프로그램을 실행합니다.

주입하는 동안 PE 튜브에서 Fast Green 염료가 움직이는 것을 관찰하십시오. 바늘 끝이 두개골 표면에 닿을 때까지 피부와 두개골을 통해 바늘을 천천히 관통하는 것이 중요합니다. 주입하는 동안 Fast Green 염료가 PE 튜브에서 움직이는 것을 관찰하는 것이 필수적입니다.

주입이 완료된 후 1분 정도 기다렸다가 침투된 DV 깊이의 1/2까지 바늘을 천천히 올립니다. 그런 다음 강아지의 머리에서 바늘을 천천히 빼내기 전에 30초 더 기다립니다. 주사가 완료된 후 1분 정도 기다렸다가 침투된 DV 깊이의 1/2까지 바늘을 천천히 올리는 것이 중요합니다.

그런 다음 강아지의 머리에서 바늘을 천천히 빼내기 전에 30초 더 기다립니다. 모든 대상 부위를 주입한 후 섭씨 33도의 인큐베이터에서 20분 동안 강아지를 워밍업합니다. 강아지가 흉골 누운 자세를 회복할 때까지 5분마다 강아지를 확인하십시오.

그런 다음 강아지를 댐으로 되돌립니다.GFP와 융합된 Cre DNA 재조합효소를 발현하는 바이러스 200나노리터를 Ai14 마우스의 P2 선조체에 주입했습니다. 이 마우스는 loxP 측면 정지 카세트의 Cre 매개 결실 시 tdTomato 리포터 유전자를 발현했습니다.

뇌는 GFP와 tdTomato의 면역 염색을 위해 P14에서 수확되었습니다. 많은 AAV 형질도입 GFP 양성 세포가 선조체 전체에 존재했으며, 이는 AAV EGFP Cre 바이러스에 의한 선조체 세포의 광범위한 감염을 나타냅니다. tdTomato의 유사한 광범위한 발현이 선조체에서도 발견되었습니다.

고배율에서 현미경 검사에서 모든 GFP 양성 선조체 세포가 tdTomato 리포터 유전자를 공동 발현하는 것으로 밝혀졌습니다. 더욱이, tdTomato 신호는 선조체 및 선조체 돌기 뉴런의 표적 영역인 substantia nigra pars reticulata의 구상팔리두스(globus pallidus)의 축삭돌기 말단으로 추정되는 축삭 말단에서 감지되었습니다. 이러한 결과는 신생아 선조체 뉴런에서 Cre 활성의 AAV 매개 발현에 의해 유도된 성공적인 Cre loxP 매개 DNA 재조합을 시사합니다.

일단 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행되면 양측 선조체 주사의 경우 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 시술을 시도하는 동안, 이 수술은 인내와 주의가 필요한 섬세한 신생아 뇌 수술이라는 것을 기억하는 것이 중요하다. 이 절차에서 산후 발달 동안의 성숙을 분석하기 위해 광유전학 및 화학유전학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.