Name: 신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 신생아 마우스 뇌의 선조체에 stereotaxic 수술을 이용한 유전자 조작 기법을. 이 방법은 신경발달 연구에서 특정 뇌 영역의 정밀한 유전자 변형을 가능하게 합니다.

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이 작품은 과학의 부에 의해 지원 되었다 및 기술 부여 MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, 국립 건강 연구소 부여 NHRI-EX106-10429NI, 및 추천된 지역 연구 센터 프로그램 부여 뇌 연구 센터, 대만에서 국립 양 밍 대학 교육부의 박사 친목 부여 MOST106-2811-B-010-031 (S. Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 및 MOST106-2811-B-010-030 (헤-영 규 과장).

여기에 설명 된 동물 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회의 국립 양 밍 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 신생아 강아지 Stereotaxic 장치에 대 한 소유자의 준비
<ol><li>머리 트레이 만들기: 1.5 mL 원심 분리기 튜브 (길이 15 m m)의 하단 튜브의 벽의 1/5를 제거 하 여 신생아 강아지의 머리에 맞는 모양으로 잘라.</li>
	<li>피 펫 팁 상자 stereotaxic 기구의 받침대와 맞는 적당 한 크기와 고 상단 덮개를 제거. 머리 트레이 단계 1.1 및 뜨거운 용 해 접착제로 팁 쟁반의 기지에 조직 포함 카세트에 부착 조직 포함 카세트의 높이 7 m m, 머리 고정 위치에서 강아지의 목과 시체를 지 원하는 데 사용 되는입니다.</li>
	<li>표준 stereotaxic 장치에 전체 설치를 넣습니다.</li>
</ol>2. 30 G 주입 스테인리스 바늘의 준비
<ol><li>전 3 일 동안 클로 프롬에서 그들을 몸을 담글 하 여 30 G 주사기 바늘을 청소.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 신중 하 고 천천히 당겨 바늘 화학 후드에서 폴 리 프로필 렌 그것의 허브에서.</li>
	<li>20 분 50 rpm에서 통에 70% 에탄올 린스 3 × 10 분 뒤 절대 에탄올과 바늘을 씻어. 사용까지 바늘 공기 건조, 그리고 청소 바늘 실 온 (RT)에서 깨끗 한 상자에서 저장을 하자.</li>
</ol>3. Microinjection 튜브 어댑터 준비
<ol><li>PE10 폴 리 에틸렌 튜브 (PE10 튜브) 30g 주사 바늘에 microliter 주사기를 연결 합니다. 브리징 microliter 주사기와 주사 바늘에 대 한 PE20 폴 리 에틸렌 튜브 (PE20 튜브) 어댑터를 준비 합니다. 어댑터의 사용 때문에 필요, PE10 튜브의 직경 26 G microliter 주사기의 바늘의 그것 보다 훨씬 작습니다.</li>
	<li>Microliter 주사기에 대 한 튜브를 준비: PE20 튜브 5 cm와 미리 청소 30g 주사 바늘을 연결 하 고 인스턴트 접착제로 접합 인감. 이 튜브 어댑터는 재사용 가능한. 참고: microinjection 주사기의 바늘 30 G 이면 준비 (3.1 단계) 및이 어댑터의 사용 (단계 3.3) 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>Microliter 주사기 (10 µ L) (3.1 단계에서 준비) 튜브 어댑터를 연결 합니다.</li>
	<li>PE20 튜브 어댑터의 30 G 바늘에 (더 이상 60 cm) PE10 튜브의 한쪽 끝을 연결 합니다. PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 새로운 30 G의 주사 바늘을 탑재 합니다.</li>
</ol>4. 부하 압력가 증류수, 염료와 바이러스 Microinjection 튜브
<ol><li>Microliter 주사기의 플런저를 제거 합니다. 25 G 주사기를 사용 하 여 로드 microliter 주사기 및 압력가 증류수는 배관에서 공기를 제거 하는 연결 된 PE 튜브.</li>
	<li>플런저 microliter 주사기를 다시 놓고 배럴에 증류수 남아 2 µ L까지 플런저를 밀어. 양의 증류수 2 µ L 보다 낮은 되 게 하지 마십시오.</li>
	<li>신중 하 게 마이크로 흐름 속도 주사기 펌프에 microliter 주사기를 탑재 합니다.</li>
	<li>적은 양의 0.1% 빠른 녹색 염료 (0.9% 식 염 수에 준비와 0.22 μ m 필터 필터링)와 parafilm 조각에 바이러스 액체 플라스틱</li>
	<li>Microinjection 튜브에 체액의 흐름을 테스트 하려면 30 G 주입 바늘과 튜브에 필터링 된 빠른 그린의 0.7 µ L을 로드 하 여 다음 PE10 튜브 사이 공기 방울이 볼 수 있도록 공기의 작은 금액을 철회 한다.</li>
	<li>또 다른 작은 양의 바이러스 액체 microinjection 튜브에 로드 하 여 다음 두 번째 공기 거품을 만들기 위해 공기를 철회 한다.</li>
	<li>연결 하 고 30 G microinjection 바늘 stereotaxic 기구의 팔을 확보.</li>
</ol>5입니다. 저체온증에 의해 신생아 쥐의 마 취
<ol><li>라텍스 장갑 소매에 강아지를 놓고 5 분 목까지 얼음에 몰두 합니다.</li>
	<li>되도록 그의 철수 응답 집게로 강아지의 발을 꼬집어.</li>
	<li>라텍스 장갑 소매와 강아지를 머리 트레이에 놓고 저 체온 마 취에 대 한 차가운 유지에 라텍스 슬리브 주위 일부 얼음을 넣어.</li>
	<li>가능 하면 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 강아지의 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
</ol>6입니다. microinjection
<ol><li>70% 에탄올으로 깨끗이 stereotaxic 악기를 닦아 하 여 불 임 수술을 준비 합니다. 70% 에탄올에 그들을 immersing 하 여 외과 기구를 소독.</li>
	<li>70% 에탄올과 강아지의 머리를 제거 하십시오. 두개골에 랜드마크 람다를 찾아서 람다 마커 펜으로 표시 합니다. 람다에 바늘 끝을 조 준 하 고 0으로 이전 후부 (AP) 및 중간 옆 (ML) 좌표를 설정 합니다.</li>
	<li>대상 사이트의 대상 사이트의 X 및 Y 좌표에 따라 주입 팔을 이동 합니다. 출생 후 하루 (P) 2의가 대 한 강아지, 좌표는: AP, 람다; 앞쪽 +2.4 m m ML, ± 1.0 mm; 중간에서 측면 등-복 부 (DV), 두개골에서 −1.7 m m. 펜으로 PE10 관에서 빠른 녹색 염료의 위치를 표시 합니다.</li>
	<li>30g 주사 바늘 아래로 천천히 두개골, 피부를 통해 침투 하 가져오고 두개골의 표면에서 멈출 때까지 다음 바늘 팁을가지고. 0으로 DV 좌표를 설정 합니다.</li>
	<li>내릴 30 G 주입 바늘 천천히 대상 사이트의 DV 좌표에 도달할 때까지. 실질 정상적인 모양을 다시 시작 수 있도록 1 분 기다립니다. Microinjection 프로그램 (100 nL/min)를 실행 합니다.</li>
	<li>빠른 녹색 염료의 마크는 바이러스 액체 두뇌에 주입 되도록 PE 튜브에 움직이는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>Microinjection, 종료 후 1 분 동안 대기 그리고 다음 천천히 그리고 점진적으로 30 DV 깊이의 1/2 높이에 바늘을가지고 s. 30 후 s, 천천히 강아지의 머리에서 바늘을 철회.</li>
	<li>모든 타겟된 사이트의 microinjections는 완료 될 때까지 단계 6.2 6.7를 반복 합니다.</li>
</ol>7. 강아지의 포스트 외과 복구
<ol><li>33 ° C 배양 기에 20 분 동안 강아지를 따뜻한. 강아지 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 저 체온 마 취 매 5 분에서에서 강아지의 복구를 확인 하십시오.</li>
	<li>강아지는 완 치 후에을 다시 강아지를 반환 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li>
<li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+of+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li>
<li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+neurodevelopmental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li>
<li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+circuits%2C+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li>
<li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Bull%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatal+mosaic%3A+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuit%22%5BJournal%5D)">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구에서 신생아 마우스 두뇌가 AAV 바이러스 주입에 대 한 간단 하 고 안정적인 stereotaxic 방법을 보여 줍니다. 우리는 p 2에서 Ai14 기자 쥐가 AAV eGFP Cre 바이러스 microinjected 하 고 P14에서 리포터 유전자 발현 분석. 우리는 AAV 불리고 GFP-긍정적인 세포가 rostrocaudal 수준에 걸쳐 발견. 또한, 거의 모든 GFP-긍정적인 세포 공동 tdTomato 기자 유전자 striatal 셀에 제안 하는 성공적인 Cre loxP DNA 재조합 AAV 중재 표현 Cre 활동에 의해 유도 된 표현. 우리는 더 p 2에서가 Foxp2fl/플로리다 쥐로 AAV eGFP Cre의 microinjections에 의해이 접근 방법의 효능을 확인 했다. 이중 라벨 많은 AAVs 불리고 GFP-긍정적인 세포 Foxp2 immunoreactivity P9가, 신생아가 있는 Foxp2 유전자의 성공적으로 조건부 삭제 제안에 부족을 보여주었다...

현대 연구의 구조와 뇌의 기능 일반적으로 신경 세포에 특정 유전자의 유전자 조작이 필요합니다. 다른 유전자, 돌연변이 체 대립 유전자를 포함 하 여 운반 하는 유전자 변형 마우스의 기능을 녹아웃와 대립 노크에서 정기적으로 생성. Stereotaxic 뇌 수술 성인 설치류에 대 한 로컬 설치류 두뇌1,2의 특정 지역에 약물, 바이러스, 추적기 및 다른 시 약을 제공 하는 표준 방법입니다. 유전자 변형 마우스 stereotaxic 뇌 수술을 적용 한 유전자 조작 유전자 기능과 마우스 뇌의 특정 신경 인구에 신경 활동을 허용 합니다. 셀 형식 관련 조작 두뇌3,,45의 복잡 한 신경 회로에 신경 기능을 해독 하는 강력한 접근 방식을 제공 합니다.
신 경계의 신경 개발 초기 배아 단계에서 시작 하 고 개발 프로세스 청소년 기간까지 출산 후 계속. 신경 시스템의 출생 후 성숙 뇌6의 생리 및 인지 기능을 위한 필수적인 신경 회로의 정확한 시 냅 스 배선 포함 되어 있습니다. 따라서, 신생아 시간 윈도우에서 발생 하는 개발 이벤트를 공부 뿐만 아니라 정상적인 신경 발달을 이해 하는 데 중요 하지만 neurodevelopmental과7 정신병 무질서의 병 인에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. ,8. 성인 설치류 stereotaxic 뇌 수술의 방법으로는 쉽게 사용할 수 있는2,9, 비록 몇 가지 프로토콜 신생아 쥐10,11stereotaxic 뇌 수술에 대 한 인터넷에서 사용할 수 있습니다. 사실, 신생아 마우스 새끼의 두뇌에 약의 stereotaxic microinjections는 어렵다, 신생아 강아지의 머리는 너무 연약한 표준 stereotaxic 장치에 고정 하기 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 유전자 변형 마우스 stereotaxic 뇌 수술의 응용 프로그램은 신생아 쥐12가능 합니다. 여기, 우리가 만든 설치 신생아 마우스 새끼 stereotaxic 뇌 수술을 수행 하는 간단한 방법 설명. 이 기술은 허용 하나 조건부로 AAV 표현 Cre DNA recombinase 기자 진 마우스와 조건에 따라 floxed 유전자 변형 쥐가 microinjecting floxed 유전자 삭제를 보여 줍니다. 이 기술은 또한 야생-타입 마우스의 신생아가에 시 약을 제공에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>30G PrecisionGlide 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>JT 베이커</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 마이크로리터 주사기</td><td>해밀턴&nbsp;</td>PE10 튜브에 맞는 <td>80300</td><td>30G 바늘; 26G 바늘에는 PE20 어댑터가 필요합니다.</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Micro Flow Rate Syringe Pump</td><td>Longer Precision Pump Co.</td><td>TJ-2A (컨트롤러) 및 L0107-2A (구동 장치)</td><td></td></tr> <tr><td>25G 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>0.1 %</td></tr> <tr><td>표준 입체 계측기</td><td>RWD 생명 과학</td><td>68037</td><td>68030 마우스 / 신생아 쥐 어댑터</td></tr><tr><td>Anti-FOXP2 항체</td><td>Abcam</td><td>ab16046</td><td>토끼 다클론 to FOXP2, 1 : 4,000</td></tr><tr><td>안티-RFP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>마우스 단클론 RFP, 1:1,000</td></tr><tr><td>BX63 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 접합 Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV1848</td><td>Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken actin-eGFP</td><td>AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td><td>N/A</td><td>1x1014 (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>The Jackson Labtorary&nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td><td>잭슨 랩토리&nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2fl/fl</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>Corning&nbsp; 셀그로</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 마우스 두뇌의 striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

많은 유전자는 미 발달 머리에 표현 하 고 그들 중 일부는 지속적으로 출생 후 뇌에 표현. 이러한 지속적으로 표현한 유전자에 대 한 그들은 발달 과정 및 신생아 두뇌의 생리 기능을 조절 하 작동 수 있습니다. 두뇌에 있는 특정 유전자의 neurobiological 기능 조사, 두뇌에서 유전자를 비활성화 필수적 이다. 여기, 우리 신생아 시간 창에서 유전자 변형 생쥐의 고가에 유전자 발현을 비활성화 하는 간단한 stereotaxic 방법을 설명 합니다. AAV eGFP Cre 바이러스는 출생 후 하루 (P) stereotaxic 뇌 수술에 의해 2에서 Ai14 기자 유전자 쥐가 microinjected 했다. TdTomato 기자 유전자 발현 P14가, 성공적인 Cre loxP 중재 DNA 재조합 AAV 불리고 striatal 셀에 제안에 발견 되었다. 우리는 더 AAV eGFP Cre 바이러스 P2Foxp2fl/플로리다 쥐로 microinjecting에 의해이 기술을 검증. GFP의 Foxp2 더블 라벨 GFP-긍정적인 세포 Foxp2 immunoreactivity P9가, AAV-eGFP-Cre 불리고 striatal 셀에서 Foxp2 단백질의 손실을 제안에 부족을 보여주었다. 함께 찍은, 이러한 결과 floxed 유전자 변형 생쥐의 신생아 두뇌에 있는 특정 신경 인구에 있는 stereotaxically microinjected AAV eGFP Cre 바이러스에 의해 효과적인 유전자 삭제를 보여 줍니다. 결론적으로, 우리의 stereotaxic 기술 신생아 마우스 두뇌에서 유전자 조작에 대 한는 쉽고 간단한 플랫폼을 제공합니다. 기술만 사용할 수 없는 신생아 두뇌의 특정 지구에 있는 유전자를 삭제 하 하지만 또한 사용할 수 있습니다 약물 약물, 신경 추적기, 유전자 변형된 optogenetics 및 chemogenetics 단백질, 신경 활동 지표를 삽입 하 고 신생아 마우스 두뇌의가에 다른 시 약.

실험의 첫 번째 집합에 대 한 우리 200 microinjected AAV9.hSynapsin.HI.eGFP Cre.WPRE.SV40 바이러스 (AAV-eGFP-Cre, Dulbecco의 버퍼링 인산 염 분에 1/10 희석) Cre DNA recombinase 표현의 nL Ai14 쥐의 P2가 GFP 융합. Ai14 마우스 loxP 형벌 (floxed) 정지 카세트 (그림 2F)의 Cre 중재 삭제 시 tdTomato 취재 원 유전자를 표현 한다. 두뇌는 GFP와 tdTomato의 immunostaining에 대 한 P14에서 수확 했다. 많은 AAV 불리고 GFP-긍정적인 세포 (그림 2A, C)가 걸쳐 현재 AAV eGFP Cre 바이러스에 의해 striatal 세포의 광범위 한 감염을 나타내는 했다. TdTomato의 비슷한 광범...

우리는 신생아 마우스 두뇌의가에 microinjecting 시 약에 대 한 수 제 머리 고정 장치 stereotaxic 수술의 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 신생아 마우스 두뇌의 특정 영역의 신경 세포에서 유전자 조작 가능

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

이 방법은 출생 후 발달과 같은 유전 및 신경 발달의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 집에서 만든 장치를 사용하는 간단한 기술이라는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것은 뇌에 표적 주사를 놓으려면 세부 사항에 대한 완전한 주의가 필요하기 때문에 매우 중요합니다.시작하려면 정위 장치에서 신생아 강아지를 사용할 수 있는 홀더를 만드십시오. 먼저 헤드 트레이를 만듭니다. 1.5ml 원심분리기 튜브의 바닥을 약 1/5 잘라내어 신생아 강아지의 머리를 위한 구멍을 만듭니다.다음으로, 입체택시 장치의 받침대에 맞는 빈 피펫 팁 상자를 선택합니다. 그런 다음 뜨거운 접착제를 사용하여 헤드 트레이를 팁 상자 바닥에 고정합니다. 다음으로, 머리가 고정되어 있는 동안 강아지의 몸통을 지탱할 수 있는 상자에 조직 삽입 카세트를 붙입니다.이제 주사를 위해 30 게이지 스테인리스 스틸 바늘을 준비합니다. 먼저, 유리병에 클로로포름에 3일 동안 담가 미리 세척합니다. 3 일 후, 바늘을 조심스럽게 제거하고 절대 에탄올로 20 분 동안 50rpm의 교반으로 씻으십시오.그런 다음 70 % 에탄올에 3 번 씻고 10 분 동안 교반으로 씻으십시오. 세척 후에는 바늘을 자연 건조시키고 사용할 때까지 실온의 깨끗한 상자에 보관하십시오. 미세 사출 어셈블리의 경우 PE20 폴리에틸렌 튜빙의 5cm 세그먼트를 사용하여 PE10 튜빙을 26 게이지 10 마이크로리터 주사기에 연결합니다.시아노아크릴레이트로 접합부를 고정합니다. 그런 다음 새 30게이지 주사 바늘을 PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 장착합니다. 이제 10마이크로리터 마이크로사출 주사기를 로드합니다.플런저를 제거하고 다른 25 게이지 주사기를 사용하여 어셈블리에 오토클레이브 증류수를 다시 로드하여 튜브에서 공기를 제거합니다. 그런 다음 플런저를 마이크로리터 주사기에 다시 놓고 배럴에 2마이크로리터의 증류수만 남을 때까지 플런저를 밉니다. 다음으로, 마이크로리터 주사기를 마이크로플로우 주사기 펌프에 조심스럽게 장착합니다.그런 다음 실험용 바이러스 액체에서 소량의 여과된 0.1%Fast Green 염료를 파라필름 조각에 피펫으로 넣습니다. 이제 주사 바늘과 튜브 사이에 기포가 보일 때까지 주사기로 소량의 공기를 흡입합니다. 그런 다음 0.7마이크로리터의 여과된 Fast Green 용액을 로드하여 미세 주입 튜브의 유체 흐름을 테스트합니다.흐름이 양호하면 또 다른 소량의 공기를 흡입하여 두 번째 기포를 만들고 주입 용액을 미세 주입 튜브에 로드합니다. 정위 장치에 미세 주입 바늘을 부착하고 고정하고 신생아 마우스의 미세 주입을 진행합니다. 수술을 준비하기 위해 70% 에탄올로 입체 기구를 철저히 닦고 70% 에탄올로 수술 기구를 살균합니다.그런 다음 저체온증을 사용하여 신생아를 마취합니다. 강아지를 라텍스 장갑에 넣고 으깬 얼음에 목까지 5분 동안 담급니다. 그런 다음 집게로 강아지의 발을 꼬집어 페달 반사가 없는지 확인합니다.다음으로, 장갑을 낀 강아지를 헤드 트레이에 놓고 라텍스 슬리브 주위에 으깬 얼음을 넣어 저체온증 마취를 유지합니다. 그런 다음 강아지의 머리를 70% 에탄올로 문지르고 람다 랜드마크를 찾습니다. 마커로 표시하십시오.그런 다음 바늘 끝을 람다로 향하게 하고 전방/후방 및 내측/외측 좌표를 0으로 설정합니다. 다음으로, 뇌 지도를 참조하여 주입 팔을 목표 부위로 이동합니다. 예를 들어, P2 새끼의 선조체는 람다보다 2.4mm, 정중선 양쪽으로 1.0mm, 배쪽으로 1.7mm입니다.다음으로 펜을 사용하여 PE10 튜브의 패스트 그린 염료 위치를 표시합니다. 그런 다음 바늘 끝이 두개골 표면에 닿을 때까지 피부와 두개골을 통해 바늘을 천천히 관통하기 시작합니다. 등쪽/복부 좌표를 0으로 설정합니다.그런 다음 바늘을 목표 부위로 천천히 내립니다. 제자리에 놓이면 실질이 정상 모양으로 돌아갈 때까지 1분 동안 기다립니다. 그런 다음 분당 100나노리터로 미세 주입 프로그램을 실행합니다.주입하는 동안 PE 튜브에서 Fast Green 염료가 움직이는 것을 관찰하십시오. 바늘 끝이 두개골 표면에 닿을 때까지 피부와 두개골을 통해 바늘을 천천히 관통하는 것이 중요합니다. 주입하는 동안 Fast Green 염료가 PE 튜브에서 움직이는 것을 관찰하는 것이 필수적입니다.주입이 완료된 후 1분 정도 기다렸다가 침투된 DV 깊이의 1/2까지 바늘을 천천히 올립니다. 그런 다음 강아지의 머리에서 바늘을 천천히 빼내기 전에 30초 더 기다립니다. 주사가 완료된 후 1분 정도 기다렸다가 침투된 DV 깊이의 1/2까지 바늘을 천천히 올리는 것이 중요합니다.그런 다음 강아지의 머리에서 바늘을 천천히 빼내기 전에 30초 더 기다립니다. 모든 대상 부위를 주입한 후 섭씨 33도의 인큐베이터에서 20분 동안 강아지를 워밍업합니다. 강아지가 흉골 누운 자세를 회복할 때까지 5분마다 강아지를 확인하십시오.그런 다음 강아지를 댐으로 되돌립니다.GFP와 융합된 Cre DNA 재조합효소를 발현하는 바이러스 200나노리터를 Ai14 마우스의 P2 선조체에 주입했습니다. 이 마우스는 loxP 측면 정지 카세트의 Cre 매개 결실 시 tdTomato 리포터 유전자를 발현했습니다.뇌는 GFP와 tdTomato의 면역 염색을 위해 P14에서 수확되었습니다. 많은 AAV 형질도입 GFP 양성 세포가 선조체 전체에 존재했으며, 이는 AAV EGFP Cre 바이러스에 의한 선조체 세포의 광범위한 감염을 나타냅니다. tdTomato의 유사한 광범위한 발현이 선조체에서도 발견되었습니다.고배율에서 현미경 검사에서 모든 GFP 양성 선조체 세포가 tdTomato 리포터 유전자를 공동 발현하는 것으로 밝혀졌습니다. 더욱이, tdTomato 신호는 선조체 및 선조체 돌기 뉴런의 표적 영역인 substantia nigra pars reticulata의 구상팔리두스(globus pallidus)의 축삭돌기 말단으로 추정되는 축삭 말단에서 감지되었습니다. 이러한 결과는 신생아 선조체 뉴런에서 Cre 활성의 AAV 매개 발현에 의해 유도된 성공적인 Cre loxP 매개 DNA 재조합을 시사합니다.일단 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행되면 양측 선조체 주사의 경우 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 시술을 시도하는 동안, 이 수술은 인내와 주의가 필요한 섬세한 신생아 뇌 수술이라는 것을 기억하는 것이 중요하다. 이 절차에서 산후 발달 동안의 성숙을 분석하기 위해 광유전학 및 화학유전학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

stereotaxic 좌표를 사용하여 excitotoxin의 주입에 의한 특정 뇌 영역의 타겟으로 절제 (들)은 설명되어 있습니다. 이 기술은 또한 쥐의 두뇌로 다른 화학 물질의 주입을 위해 적응 수 있습니다.

성인 쥐의 특정 두뇌 영역의 Excitotoxic 병변에 대한 Stereotaxic 외과

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

출처: Porlan, E., et al. 신경줄기세포 자율 및 비자율 효과 분석을 위한 성체 마우스 V-SVZ 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 모델에서 바이러스 운반 치료 유전자의 정위 주입을 통해 심실-뇌실하 영역(V-SVZ)에서 신경 줄기 세포(NSC)의 안정적인 유전자 변형을 보여줍니다. 바이러스는 NSC에 들어가 역전사를 거쳐 게놈에 통합되어 신경치료 응용을 위한 안정적이고 효율적인 유전자 변형을 가능하게 합니다.

마우스 모델에서 안정적인 유전자 변형을 위한 바이러스의 정위 주사

이 비디오는 신생아 마우스의 심실에 주입된 트랜스포손 DNA를 사용하여 교모세포종(GBM)을 유도하는 효율적인 기술을 설명합니다. 플라스미드를 흡수하는 뇌실하 영역의 세포는 인간 교모세포종의 조직병리학적 특성을 가진 종양을 변형, 증식 및 생성합니다.

SB 매개 전치를 사용한 교모세포종 유도: 신생아 마우스 뇌에 SB 플라스미드의 전이(Transposon) 매개 통합을 사용하여 새로운 마우스 모델을 생성하는 기술

출처: Chen, S., et al., 신생아 마우스 뇌의 선조체 세포에서 유전자 조작을 위한 정위 수술. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 Cre 재조합효소와 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 암호화하는 바이러스 벡터를 유전자 변형 마우스 새끼의 선조체에 정위 주입하여 loxP 측면 STOP 카세트를 절제하여 적색 형광 단백질 또는 RFP를 리포터로 활성화하여 유전자 조작을 달성하는 방법을 보여줍니다.

마우스 새끼 선조체에서 유전자 조작을 위한 바이러스 벡터의 정위 미세 주입

출처: Fricano-Kugler, CJ, et al. 정위 주사를 통한 고역가 CRISPR 레트로 및 렌티바이러스의 설계, 포장 및 전달. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 뇌에서 정밀한 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 치상회로의 정확한 바이러스 전달을 보장하여 형광 표지 및 CRISPR 매개 유전자 녹아웃을 가능하게 하여 생체 내에서 신경 회로, 유전자 기능 및 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 표적 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주사

출처: Gonzalez-Ramos, A., et. al., 신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마로 이식. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 흥분-억제 균형을 회복하는 것을 목표로 억제성 중간 뉴런이 감소된 유전자 변형 쥐 새끼의 해마에 인간 유래 중간 뉴런 전구체 세포를 정위 주입하는 방법을 보여줍니다.

인간 유래 중간 뉴런 전구 세포를 마우스 새끼 해마에 이식

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을...

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

설치류에 Stereotaxic 수술은 약물이나 동물을 행동 깨어 전기 자극과 녹음의 타겟 관리를위한 수 있습니다. 이 비디오 프레 젠 테이션에서 우리는이 오랜 절차를 성공적으로 향상되는 생존율 감소 수술 후 체중 감소 최근 절차 개선을 설명합니다.

행동 신경 과학에 대한 설치류 Stereotaxic 수술과 동물 복지 성과 향상

학습하세요 신생아 마우스 뇌의 선조체에 stereotaxic 수술을 이용한 유전자 조작 기법을. 이 방법은 신경발달 연구에서 특정 뇌 영역의 정밀한 유전자 변형을 가능하게 합니다.

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

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