Name: 곰 팡이 병원 체 Ustilago Maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 배우세요 액체 형광 회복법을 이용하여 Ustilago maydis의 지질 인덱스를 측정하는 방법을. BODIPY 493/503 형광 염료로 고처리량 스크리닝이 가능하며, 질소 결핍 조건에서 지질 축적 동태를 효율적으로 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 교부 금에 의해 지원 되었다 Instituto Politécnico Nacional Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), 프로그램이 de Apoyo 있습니다 드 Investigación e Innovación 협력 (PAPIIT IN222117)-(대학 나시오날 Autónoma 드 멕시코 운 암)와 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (CONACyT 254904 JPP 및 256520 GGS). Fundação 드 Amparo를 검색 할 리오 데 자네이 (FAPERJ-Cientistas Nosso 스타 할: E 26/103.353/2011). QFB 덕분에 우리입니다. 오스카 이반 Luqueño Bocardo에 대 한 도식 개요입니다. LDs의 confocal 현미경 검사 법에서 귀중 한 도움에 감사 박사 미겔 Tapia 로드리게스 하 고. 우리가 미국 maydis에 대 한 적응 S. cerevisiae 에 기술 개발에 그의 개척 일 박사 브루노 Bozaquel Morais 감사 하 길.

1입니다. 버퍼 솔루션의 준비
<ol><li>인산 염의 1 리터를 준비 하려면 식 염 수 (PBS, pH 7) 버퍼링, NaCl, KCl, 0.2 g Na2HPO4, KH2포4 distillated 물 800 ml에서의 0.24 g 1.44 g 8 g을 분해. HCl와 7.0에 pH를 조정 하 고 추가 물 1 L. PBS의 마지막 볼륨에 대 한 재고 솔루션 x 10로 만든 고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>담합 솔루션의 10 mL를 준비 하려면 3.7%의 최종 농도 도달 하는 PBS의 9 mL을 37% 포름알데히드의 1 mL를 추가 합니다. 그냥 사용 하기 전에이 솔루션을 준비 합니다. 주의: 글러브를 사용 하 여 포름알데히드 솔루션 처리.</li>
	<li>냉각-솔루션 (500mm)를 준비 하려면 8.3 g 기의 100 mL의 증류수에 녹. 사용 하기 전에이 솔루션을 준비 하 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>BODIPY 10 m m 재고 솔루션을 준비, 10 mg BODIPY 493/503의 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 3.8 mL에 녹. 어둠 속에서-70 ° c.에 100 µ L aliquots를 유지</li>
	<li>BODIPY 5 µ M 냉각 솔루션을 준비, 10 m m BODIPY 500 mM 냉각 솔루션의 493/503 2 mL의 1 µ L를 추가 합니다. LFR 분석 결과 대 한 BODIPY의 5 µ M의 최종 농도 필요 합니다.</li>
	<li>미네랄 솔루션을 준비 하려면 추가 0.06 g H3보의3, MnCl2-4 H2O, ZnCl2, 나2의 0.04 g 0.4 g의 0.14 g MoO4-2 H2O, 0.1 g FeCl3-6 H2O와 CuSO의 0.4 g의 4-5 H2O 증류수 1 l.</li>
	<li>소금 솔루션을 준비, KH2포4나2그래서4, KCl의 8 g, MgSO4의 2 세대, CaCl2, 1 g, 1 l의 미네랄 솔루션의 8 mL 증류수의 4 g 16 g를 추가 합니다.</li>
	<li>준비 (a2b2), 미국 maydis f b 2에 대 한 질소 소스 없이 최소한의 매체 추가할 10 g의 포도 당 및 62.5 mL 소금 솔루션의 1 l 증류수, 할러데이, 외. 31. 7.0에 pH를 조정 하 고 분배 250 mL 플라스 크에 미디어의 100 mL 그들을 소독. 액체 주기 또는 필터에 15 psi (1.05 k g/c m2)에서 20 분 동안 오토 클레이 브 소독.</li>
	<li>준비 효 모 펩 포도 당 매체 (YPD), 효 모 5 g 추출, 펩, 2.5 g 그리고 증류수 1 리터에 포도의 5 g을 추가 합니다. 250 mL 플라스 크에 솔루션의 100 mL를 분배 하 고 그들을 소독. 액체 주기 또는 필터에 15 psi (1.05 k g/c m2)에서 20 분 동안 오토 클레이 브 소독.</li>
</ol>2. 문화 조건과 셀 고정
참고: 셀을 최대한 빨리 수정 하 여 Ld의 구조를 유지 합니다. Microcentrifuge 튜브에 고정을 할 수 있습니다. 고정된 셀 수 보관 4 ° C에서 최대 한 달 동안 경우 탈수는 물의 얇은 층을 떠나.
<ol><li>문화 조건 하에서 미국 maydis 세포 성장 관련 연구에 대 한. 0.05는 초기 세600 문화 시작 (1.15 × 106 셀 / mL). 28 ° C, 24 h에 대 한 180 rpm에서 세포를 품 어. 2.3 × 107 셀에 해당 하는 1의 OD600 / mL.</li>
	<li>선택 된 셀의 약 수를 철회 하는 시간. 미국 maydis 에 대 한 첫 번째 8 h 동안 5 mL 매 2 시간을 철회 한다. 성장의 8 h 후 2 mL의 aliquots는 충분 하다.</li>
	<li>600에서 광학 밀도 측정 각 약 수의 nm.</li>
	<li>탁상 원심 분리기를 사용 하 여 4 ° C에서 1 분 동안 14000 x g에 세포 현 탁 액 원심 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>1 mL의 PBS 포름알데히드 3.7% 버퍼에 셀의 펠 릿을 일시 중단 합니다. 실 온에서 15 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>부 화 후 4 ° c.에 1 분 동안 14000 x g에 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>증류수 (1 mL)의 비슷한 볼륨으로 두 번 셀 펠 릿을 세척. 14000 x g 4 ° c.에 1 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 각 세척 단계 후에 상쾌한 폐기.</li>
	<li>5 세600 셀 펠 릿을 조정 (1.15 x 108 셀 / mL)와 증류수 (식 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq1.jpg">    방정식 1입니다.
</li>
	<li>그것의 사용까지 4 ° C에서 샘플을 유지.</li>
</ol>3. 액체 형광 복구 분석 결과 (LFR)
<ol><li>분 광 광도 계를 켜고 Skanlt 소프트웨어를 엽니다. 새 세션을 시작 하 고 Varioskan 럭 스를 선택. 세션 트리에서 프로토콜 을 선택 하 고 (여기 485 nm/방출 510 nm; 광학 밀도 600 nm) 형광 파장에 대 한 설정을 입력 한 자동 광 전 증폭 관 이득 선택. 여기 대역폭, 선택 12 nm 광학에서 위쪽을 선택 (샘플의 여기는 우물의 상단에서).</li>
	<li>온화 하 고 지속적인 동요 (300 rpm)를 입력 합니다. 실행 판 밖으로, 그리고 일시 중지 될 때까지 사용자 액션 (우물에 샘플의 추가 대 한 사용 되는 시간)를 선택 합니다. 프로토콜 5 번 반복 합니다. 저장 을 클릭 하 고 세션 이름 세션 이름 필드에 쓰기. 프로토콜은 이제 샘플 분석에 대 한 준비.</li>
	<li>BODIPY 5 µ M의 200 µ L 래 96 잘 블랙 클리어 바닥판의 각 음에 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>챔버 내부에 분 광 광도 계는 접시를 놓고 30 ° c.에서 5 분을 품 어 이 시점에서 빛에서 접시를 최대한 보호 합니다.</li>
	<li>시작 단추를 클릭 하 고 (여기 485/방출 510) 형광 및 OD600 에 해당 하는 공백.</li>
	<li>일시 중지 시간 동안 우물을 포름알데히드 고정 셀 서 스 펜 션의 5 µ L를 추가 합니다. 신중 하 게 피펫으로 샘플 혼합. 분 광 광도 계 안에 접시를 넣어 하 고 계속을 클릭 합니다. 그런 다음 샘플 위에 설계 된 프로토콜에 따라 처리 됩니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 5 µ L의 3 개의 연속적인 추가 반복 합니다. 셀 침전 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. (그림 1)입니다.</li>
</ol>4입니다. LD 색인의 계산
<ol><li>미 판에서 각 샘플에 대 한 형광 및 각 연속 추가 (5 포인트 블랭크를 포함 하 여)의 볼륨에 대 한 흡 광도 그래프를 플롯 합니다. 이 연구에서는 Microsoft Excel 소프트웨어를 사용 하 여 계산에 대 한. 데이터를 첫 번째, 볼륨, 형광, 및 흡 광도 데이터 입력, 데이터 시트의 두 번째 및 세 번째 열 각각. 그런 다음 커서를 사용 하 여 전체 데이터를 선택 하 고 삽입을 클릭 합니다 (XY) 분산형을 선택 합니다.</li>
	<li>그래프에서 각 줄에 대 한 포인트를 선택 하 고 선택 표시 수식 상자와 해당 추세선 을 삽입. 2 개의 직선, 방정식 2에 따라의의 값을 적어: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq2.jpg">    공식 2 여기서 y = 형광 또는 광학 밀도, x = 샘플의 볼륨 (0, 5, 10, 15, 20 µ L), m 형광 또는 광학 밀도 라인과 b의 기울기 = = y 절편.</li>
	<li>LD 인덱스, 방정식 3 광학 밀도 선의 기울기에 의해 형광 선의 기울기를 나눕니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq3.jpg">    식 3 LD 인덱스 형광의 몫에 해당 하며 광학 밀도 슬로프.</li>
</ol>5. 데이터 품질 분석
<ol><li>각 직선의 상관 계수를 계산: 함수 마법사 (fx)를 클릭 하 고 선택 CORREL. 만약 r &lt; 0.9, 데이터를 삭제 하 고 읽기를 반복. R ≥ 0.9, 판독 하는 경우 신뢰할 수 있는입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
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<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605(2013).</li>
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<li>Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+neutral+lipids%3A+synthesis%2C+storage+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).</li>
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<li>Filipe, A., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+and+lipid+droplets%3A+finding+a+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).</li>
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</ol>

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LFR은 성공적으로 했다 지질 대사 S. cerevisiae 에서 공부를 처음으로 적용 된 새로운 방법 미국 maydis20,21에서 구현. LD 인덱스 태그 셀에 축적의 절대 값에 영향을 주지 않는다, 비록 세포의 지질 콘텐츠의 빠른 생각을 LD 인덱스 두 개 이상의 실험 조건에서 비교 했을 때 데이터의 해석은 간단. BODIPY 493/503 중립 지질, 민 변의 주요 구성 요소에 대 한 매우 구체적인 이며 그것이 셀 confocal 여 공부는 미토 추적기 또는 CMAC 블루 같은 염료에서 오는 다른 신호의 동시 탐지를 용이 하 게 좁은 방출 스펙트럼 현미경 검사 법26. 많은 형광 분자 처럼 BODIPY 493/503 photobleaching에 민감한 형광 현미경 실험, 동안 이지만이 과정 photobleaching 시 약 안티 빛<sup cl...

지질 작은 물방울 (LDs)는 중성 지질, 주로 태그와 sterol 에스테 르 (SE)의 핵심의 구성 하는 유비 쿼터 스 세포내 지방 시체. 핵심은 perilipin diacylglycerol acyl-전이 효소, 아 세 틸 coa carboxylase acyl CoA synthase1등 중립 지질 합성에 관련 된 효소 같은 단백질 상호 작용 하는 인지질 단층에 의해 둘러싸여 있습니다. 인지질 단층에는 그것의 동적 행동 때문은 태그와 SE2triacylglycerol lipases를 또한 포함 되어 있습니다. 셀 유형 및 유기 체에 따라 저장 된 중성 지질 에너지를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다 또는 합성 인지질 및 신호 분자. 효 모와 다른 균 류, LDs의 콘텐츠 변화 감소 질소 가용성 증가 중립 지질 생산3,4 키 수 있습니다 나타내는 배양에 질소/탄소 비율에 대 한 응답 변경 ,5. 효 모에 태그의 높은 금액의 생산에 생명 공학의 잠재적인 사용을 사용 하 여 식품 산업 및 바이오 연료의 소스로 합니다. 오메가 3와 오메가 6, 영양과 식이 중요성 6,7,8,,910 와 같은 고도 불포화 지방산의 높은 비율을 포함 하는 일부 저장 된 지질 , 11. 인간 세포를 포함 한 포유류 세포의 LDs 태그와 콜레스테롤 에스테 르를 포함. LDs, 효 모에 설명 된 단백질의 동종 포유류와 추가 단백질, 결 석 perilipin 인지질 단층 작용 하는 S. cerevisiae12. 하나 제안 인지질 단층 및 그 관련 된 단백질에 대 한 역할은 LDs 구조를 안정화 하 고 미토 콘 드리 아, 바인딩과 그물, peroxisomes, 및 그들, 주로 지질 exchange 에 대 한 세포와 LDs의 상호 작용 13,14. 흥미롭게도, 인간에서 LDs 것 처럼 타입 2 당뇨병, 동맥 경화, steatohepatitis, 그리고는 그들의 번호 15,16,17 증가 관상 동맥 심장 질환 같은 병 리에 관여 . 일부 유형의 바이러스 플랫폼으로 LDs를 사용 하 여 조립 virions 2,,1819.
때문에 인간의 병 리 및 그들의 잠재적인 바이오 사용에 LDs의 의미, LDs 형성의 정확한 실험 결정 중요 한 작업입니다. 이 문서에서는 신뢰할 수 있는 분석 결과 형광 (LFR) BODIPY 493/503의 회복에 따라 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-보라-3a, 4a-diaza-s-indacene), 셀에 중립 지질 콘텐츠의 상대적 가치를 얻으려면. 이 분석 결과, 그것은 미국 maydis 와 S. cerevisiae, 같은 균 류와 포유류 세포, 지질 추출 20. 의 필요 없이 중립 지질 축적의 역학에 따라 가능 방법은 단백질 가수분해를 식별 하기 위해 S. cerevisiae 에 처음으로 적용 된 및 kinases 지질 물질 대사의 규칙. 이것은 지질 추출 또는 단백질 정화21,22없이 가능 했다. LFR 또한 복 막 대 식 세포23에 LDs 형성의 역학을 설정할 사용 되었습니다. 사용 BODIPY 493/503의 나 일 빨강으로 다른 중립 지질 염료 몇 가지 이점이 있다. BODIPY 493/503 중립 지질에 대 한 매우 구체적인 이며 좁은 방출 스펙트럼, confocal 현미경 검사 법에 의해 샘플을 분석할 때 붉은 형광 단백질 또는 미토-추적기 같은 염료에서 신호의 동시 탐지를 촉진 합니다. 불행 하 게도, BODIPY 493/503 photobleaching에 민감 하지만 빛24노출 시 antiquenching 시 약을 사용 하 여이 프로세스를 피할 수 있다.
효 모 세포에서 LFR 시험을 수행 하기 그들은 원하는 영양 조건 하에서 경작 하 고 aliquots는 서로 다른 시간에 철회 된다. 다음으로, 셀 포 름 알 데히드, 4 ° c.에 세포는 저장 하는 때 달 동안 LDs의 무결성을 보존 고정 됩니다. 다른 고정 기법 피해 야 한다, 특히 그 이후 그들은 셀24내 LDs의 저하로 이어질 찬 아세톤 또는 메탄올을 사용 하 여. LD 색인을 측정 하기 위해 포름알데히드 고정 셀 정의 농도를 물에 중단 된다. 그리고, fluorophore BODIPY 493/503 기에 의해 침묵을 포함 하는 솔루션에 추가 되는 fluorophore 셀 들어가고 Ld와 때 그것의 형광의 복구는. 형광 측정 (485 nm/510 nm)에 수 반하는, 셀의 농도 600에서 광학 밀도 측정 하 여 정량 nm. 각 샘플 잘 같은 포름알데히드-고정 셀 서 스 펜 션의 후속 5 µ L aliquots를 추가 하 여 4 번 읽습니다. 형광 및 흡 광도의 공백 셀의 추가 하기 전에 획득 됩니다. 형광의 흡 광도 데이터 품질 측정의 선형성을 확인 하 여 평가: 만약 r < 0.9, 데이터는 삭제 됩니다. R 값은 기본적으로 형광의 강도 증가 셀 농도에 선형 응답을 생성 해야 하기 때문에 중요 하다. 세포 농도가 너무 높은 경우에, 선형 손실 됩니다. LFR 분석 결과 높은 처리량 실험에서 원하는 LD 표현 형을 선택 하려면 빠르고, 간단 하 고 경제적인 방법을 제공 한다. 원하는 조건을 선택한 후 개별 셀의 LD 콘텐츠 같은 포름알데히드-고정 셀 셀에서 Ld의 이미지를 제공 하는 BODIPY와 스테인드를 사용 하 여 하는 confocal 현미경 검사 법에 의해 공부 될 수 있다. 그들의 태그와 SE 콘텐츠 수 이제 더 분석 얇은 층 크로마토그래피에 의해.

<table><tbody><tr><td>분광 광도계</td><td>Varioskan Lux 다중 모드 마이크로 플레이트, reade</td><td>D5879</td><td>필터 493/503 또는 모노 크로 메이터</td></tr><tr><td>검출기 플레이트 costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3615</td><td>96 웰 블랙 월 / 투명 바닥</td></tr><tr><td>플레이트 costar</td><td>Corning Inc</td><td>3598</td><td>96 웰 세포 배양 플레이트 costar</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen / Thermofisher</td><td>D3922</td><td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td></tr><tr><td>포름 알데히드 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>ACS 시약, H2O에 37 wt %는 중합을 방지하기 위해 10-15 % 메탄올을 함유합니다</td>.</tr><tr><td>요오드화 칼</td>륨 <td>Sigma Aldrich</td><td>60399</td><td>BioUltra, &ge; 99.5% (AT)</td></tr><tr><td>FB2 Ustilago maydis</td><td>ATCC</td><td>201384</td><td>담자균-효모</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746398</td><td>ACS 시약, 무기 염</td></tr> 인<tr><td>산칼륨 일염기</td><td>성 Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td>ACS 시약</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>선택 Sigma Aldrich</td><td>Y100</td><td>배양 매체용 아미니산, 펩타이드, 수용성, 비타민 및 탄수화물 혼합물</td></tr><tr><td>N-Z 케이스 플러스</td><td>Sigma aldrich</td><td>N4642</td><td>카제인 효소 가수분해물 소 우유</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-8270</td><td>D (+) 포도</td></tr>당 <tr><td>Skaker 플라스크</td><td>Pirex</td><td>CLS4450250-6EA</td><td>Borosiicate 유리</td></tr><tr><td>셰이커</td><td>SEV M&eacute; xico</td><td>INO650V-7</td><td>오비탈 쉐이커</td></tr><tr><td>원심분리기 테이블</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>마이크로튜브</td><td>, Sigma Aldrich</td><td>Z606340</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Axygen scientific</td><td>T-200-Y</td><td>Universal Pipet 팁, 비스듬한 끝단, 200 마이크로리터, 비멸균</td></tr><tr><td>mLine 피펫</td><td>Biohit</td><td>725130</td><td>8 채널, 부피 범위 5-100 uL</td></tr></tbody></table>

곰 팡이 병원 체 ustilago maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

문서는 triacylglycerols (태그) 지질 작은 물방울 (LDs)에서 축적을 결정 하는 민감한 microplate 분석 결과 LD 인덱스 분석 결과 구현 하는 방법을 보여 줍니다. LD 인덱스 지질 추출 없이 얻은 것입니다. 그것은 풍부한 성장 또는 질소 고갈 미디어와 같은 다른 조건 하에서 높은 처리량 실험에서 LDs 콘텐츠 측정 있습니다. 메서드가 Saccharomyces cerevisiae 에 지질 작은 물방울 대사 연구를 처음으로 기술 되었다 쓰 신 담 Ustilago maydis에 성공적으로 적용 되었다. 흥미롭게도, LDs 세포 진 핵 세포에 phylogenetically 보존 하기 때문에 메서드를 적용할 수 있는 셀의 큰 다양성에 누 룩을 포유류 세포에서. LD 인덱스 기반 액체 형광 복구 분석 결과 (LFR)의 BODIPY 493/503 냉각 조건 하에서 포 름 알 데히드. 고정 셀의 추가 의해 칼륨 요오드 형광 끄는로 사용 됩니다. 형광 및 광학 밀도 슬로프 사이 비율 LD 인덱스를 이름입니다. 사면 때 얻은 직선에서 계산 됩니다 BODIPY 형광 및 광학 밀도 600 nm (OD600) 샘플 추가 대해 그려집니다. 최적의 데이터 품질 0.9 (r ≥ 0.9) 이상 동일한 상관 관계 계수에 의해 반영 된다. 미 판에서 구현 될 수 있습니다 여러 샘플을 동시에 읽을 수 있습니다. 이므로 BODIPY 493/503 닥터지 형광 염색 그 파티션을 지질 작은 물방울으로, 많은 유형의 LDs 누적 셀에 사용할 수 있습니다.

LFR, BODIPY와 493 일부/503 형광 프로브로 공부 미국 maydis, 관계 없이에 LDs의 동적 축적 성장 조건에 안정적이 고 쉬운 방법입니다. 셀 YPD 매체에 경작 되었다 때 증가 LD 인덱스 지 수 단계 뒤에 고정 단계 (그림 2A)에서 감소 했다. 반면, 질소 기아에서 성장 하는 셀에 모두 지 수 및 고정 단계에서 (그림 2B) LD 인덱스에 꾸준히 증가 했다. 두 문화는 동일한 광학 밀도 (셀의 유사한 수)와 함께 시작 했다, 때문에 결과 지질 내용 (그림 2)에서 작은 변화를 감지 하 LFR 분석 결과의 높은 용량을 보여. 방법의 감도 confocal 현미경 검사 법에 의해 뒷받침 했다: 동안 질소 기아에서 (그림 2, ...

여기, 우리가 셀 높은 처리량 실험에서 경작된에 triacylglycerols의 역학을 공부 하는 지질 작은 물방울 인덱스 (LD)를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. LD 인덱스 분석 결과 BODIPY 493/503을 사용 하는 쉽고 안정적인 방법입니다. 이 분석 결과 dispendious 지질 추출 또는 현미경 분석 필요 하지 않습니다.

곰 팡이 병원 체 Ustilago Maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 영양 조건에서 배양된 세포의 지질 방울 지수를 측정하는 것입니다. 이 방법은 지질 방울 및 지질 장에서 축적의 역학 및 다양한 영양 상태와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마이크로플레이트에서 구현할 수 있기 때문에 여러 샘플을 동시에 읽을 수 있다는 것입니다.이 방법의 시작과 함께 질소 결핍 상태에서 배양된 Ustilago maydis 세포의 굴절을 관찰한 다음 이것이 이러한 강사가 지질 방울일 수 있음을 의미할 수 있음을 깨달을 때. 그래서 우리는 브라질 리우데자네이루 연방대학교(Universidade Federale do Rio de Janeiro)의 모니카 몬테로(Monica Montero)에게 연락하여 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 지질 방울에 대한 액체 형광 회수 분석을 구현하여 Ustilago maydis에 대한 절차를 조정하기 위한 협력을 시작했습니다. 이 프로토콜의 첫 번째 단계는 필요한 버퍼 및 솔루션을 준비하는 것입니다.10밀리몰 BO-DP 원액을 준비하려면 10밀리그램의 BO-DP 493-503과 3.8밀리리터의 디메틸설폭사이드를 용해합니다. 100마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 그런 다음 영하 70도의 어둠 속에서 유지하십시오.2밀리리터의 500 밀리몰 담금질 용액에 10 밀리몰 BO-DP 493-503 1 마이크로리터를 첨가하여 액체 형광 회수를 위한 5 마이크로몰 BO-DP 담금질 용액 또는 LFR-Assay를 준비합니다. 이 연구를 위해 초기 광학 밀도가 600나노미터의 05로 배양을 시작하여 우메다 세포를 성장시킵니다. 세포를 섭씨 28도 및 180rpm에서 24시간 동안 배양합니다.선택한 시간에 세포의 부분 표본을 회수합니다. 처음 8시간 동안은 2시간마다 5밀리리터를 빼냅니다. 8시간 동안 성장한 후에는 2밀리리터의 분취량으로 충분합니다.각 분취량의 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 14, 000 시간 G에 세포 현탁액을 4 섭씨 온도에 1 분 동안 원심 분리하십시오. 그리고 상층액은 버리십시오.PBS에 3.7% 포름알데히드를 함유한 1ml의 고정 용액에 세포 펠릿을 현탁시킵니다. 세포를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 15 분 후에, 1 분 동안 14의, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에 세포 현탁액을 원심 분리하십시오.상등액을 버리십시오. 세

lipid-index-determination-liquid-fluorescence-recovery-fungal

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

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그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

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