Name: 고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 학습하세요 인간과 쥐의 폐포 대식세포 분리 및 생체 외 배양 방법을. 폐 면역학 연구에서 호흡기 감염과 염증의 역할을 밝히는 데 활용됩니다.

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원고 편집 도움에 감사 클레어 Prendergast 하 고. DKN 지원 연구 러닝 재단에서 (#2095) 부여 및 TM는 건강의 국가 학회 (R01HL056643 및 R01HL092514)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. DKN는 방법을 개발 하 고 연구를 설계 하 고, 쓴 원고; OM 지원 동물 연구와 임상 샘플 조달; SB 지원 흐름 cytometric 분석 및 세포 분류; TM 연구를 감독 하 고 원고를 검토.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 세인트 조셉의 병원 및 의료 센터에서 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다.
1. 절연 Murine Bronchoalveolar 게 (BAL) 액체에서 AMs의
<ol><li>케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는 마우스를 이동 합니다.</li>
	<li>복 부 면이 위로 향하도록 해 부 표면에 마우스를 놓습니다. 탈수를 방지 하기 위해 살 균 알코올 준비 패드 70% 소독 소 프로 파 놀과 포화와 마우스의 복 부 표면 전체를 닦아 눈에 안과 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>제 지 하는 모든 4 개의 다리와 마우스를 탑재 합니다.</li>
	<li>부드럽게 마이크로 해 부 도구와 복 부 구멍을 엽니다. 돌출 된 조직을 만들거나 어떤 내장 장기를 손상 하지 않고 가능한 많은 영역을 열고 주의 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 천천히 incising는 mediastinum 통해 흉 곽 흉 강 열. 이상적으로, 흉 곽 쪽으로 측에서 excised 될 수 있습니다. 흉 강 여는 동안 폐의 늑 막 손상 않기로 주의 기울여야 합니다.</li>
	<li>열 등 한 베 나 정 맥을 찾아서 마우스 피를 절 개 합니다. 흡수 성 목화 패드를 사용 하 여 혈액을.</li>
	<li>순환 혈액 세포를 (10 mL 주사기 및 25g 바늘을 사용 하 여) 우 심 실에 10 mL 버퍼링 차가운 인산 염 (PBS)를 삽입할. 흡수 성 목화 패드와 함께 혈액의 흐름을 흡수. 일단 완전히 끼얹는다 폐 고 게에 대 한 준비가 다음 blanched 표시 됩니다.</li>
	<li>부드럽게 피부를 자르면 고 기도 폭로 목에 근육. 신중 하 게 소비 세는 인접 근육, 연골, 및 지방 조직 기관 손상 없이.</li>
	<li>작은 절 개를 만들기 (< 2 m m) 후 두 후부 기관에. 이 절 기도 여전히 후 두에 연결 되어 있는 동안에 카 테 터 삽입에 충분 해야 합니다. 폐 쪽으로 기관지에 바늘 없이 1 인치 22 G 카 테 터를 삽입 합니다. 실크 꼰된 봉합으로 카 테 터를 확보 (4-0; 비 흡수) 광장 매듭. 참고: 카 테 터는 마우스 크기에 따라 모든 트림을 하 게 해야 합니다. 매우 짧은 또는 긴 카는 누설 하 게 동안 기도 찢 어 경향이 있습니다. 카 테 터 길이 등을 해야 그 때 완전히 삽입 팁 남아 기도 내 고 주 기관지에 도달 하지.</li>
	<li>카 테 터를 얼음 처럼 차가운 발 버퍼 (캘리포니아2 + , Mg2 + 무료 PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산, EDTA)으로 가득 1 mL 주사기를 연결 하 고 천천히 폐에 버퍼 되지 않도록. 이 폐를 부 풀 려 것입니다. 5 초에 대 한 카 테 터에 부착 된 주사기를 유지 하 고 게 액체 피스톤을 부드럽게 당겨서 발음. 이 폐 폐의 것입니다. 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에 액체를 수집 합니다.</li>
	<li>9 번에 대 한 단계 1.10을 반복 하 고 게 액체 수영장. 폐 용량을 초과 하 고 그것의 파열으로 이어질 수 있습니다 그 플러시, 당 1 mL 버퍼를 초과 하지 마십시오.</li>
	<li>IACUC 승인 프로토콜에 의해 CO2 과다와 마우스를 안락사.</li>
	<li>10 분간 4 ° C에서 250 x g에 10 mL 발 유체 원심. 셀 펠 릿 발 셀을 포함합니다. 주의: 펠 릿 매우 작을 수 있습니다, 그리고 그래서 주의 상쾌한 발음 하는 경우.</li>
	<li>흐름/정렬 버퍼 (PBS 2% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 1 mM EDTA + + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 산 (HEPES))의 100 μ에 발 셀 resuspend</li>
	<li>Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 마우스 Fc 블록을 추가 하 여 차단 (클론 2.4G2, 10 μ g/mL)와 얼음에 20 분 동안 잠복기.</li>
	<li>항 체 형광에서 1 (FMO)을 뺀 함께 얼룩을 수행 하 고 단일-얼룩 컨트롤11,25. BAL 평가 셀 분석기로 셀 단일 셀 흐름 cytometry 분석 하 여 적절 한 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조) ( 재료의 표참조).</li>
	<li>AMs 격리 형광 활성화 된 세포에 의해 정렬 ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 마우스에 있어 문화 매체 AMs에 생체 외 문화 또는 vivo에서 것입니다 때 셀 전송. 또는, 정렬 AMs 1 mL 세포의 용 해 버퍼에 10 μ/mL β-Mercaptoethanol RNA 추출에 대 한 보충 ( 재료의 표참조).</li>
</ol>2. 마우스 폐, 단일 세포 현 탁 액에서에서 AMs의 격리
<ol><li>케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는 마우스를 이동 합니다.</li>
	<li>복 부 면이 위로 향하도록 해 부 표면에 마우스를 놓습니다. 탈수를 방지 하기 위해 살 균 알코올 패드 70% 소독 소 프로 파 놀과 포화와 마우스의 복 부 표면 전체를 닦아 눈에 안과 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>제 지 하는 모든 4 개의 다리와 마우스를 탑재 합니다.</li>
	<li>부드럽게 마이크로 해 부 도구와 복 부 구멍을 엽니다. 돌출 된 조직을 만들거나 어떤 내장 장기를 손상 하지 않고 가능한 많은 영역을 열고 주의 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 천천히 incising는 mediastinum 통해 흉 곽 흉 강 열. 이상적으로, 흉 곽 쪽으로 측에서 excised 될 수 있습니다. 흉 강 여는 동안 폐의 늑 막 손상 않기로 주의 기울여야 합니다.</li>
	<li>열 등 한 베 나 정 맥을 찾아서 마우스 피를 절 개 합니다. 흡수 성 목화 패드를 사용 하 여 혈액을.</li>
	<li>순환 혈액 세포를 (10 mL 주사기 및 25g 바늘을 사용 하 여) 우 심 실에 10 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 삽입할. 일단 완전히 끼얹는다 폐 고 수확에 대 한 준비가 blanched 표시 됩니다.</li>
	<li>추위의 5 mL 15 mL 원뿔 튜브로 기관, 혈관, 인 대를 절단 하 여 폐 밖으로 해 부 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM). 다음 단계까지 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>IACUC 승인 프로토콜에 의해 CO2 과다와 마우스를 안락사.</li>
	<li>Perfused 폐 3 mL DMEM와 멸 균 및 pyrogen 무료 60 m m 문화 접시에 전송 합니다. 있는 경우 집게 해 부의 도움으로 기도와 다른 하드 비 폐 조직 소재, 애타게. 하 메스와 폐 조직 말하다 < 1 m m 크기.</li>
	<li>300 µ g/mL Liberase TL과 5 U/mL을 추가 DNase I, pipetting으로 혼합 하 고 25 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어. 부드럽게 한 번 10 분 후 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>50 mL 원뿔 튜브에 설치 된 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 천연된 폐를 전달 합니다. 1 mL 주사기에서 플런저의 뒷면을 사용 하 여 필터에 세포 덩어리를 매 시. 20 mL 워시 버퍼 필터 세척 (PBS + 2% 열 사 FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>4 ° C에서 500 x g에서 5 분간 원심. 삭제는 상쾌한 고 셀 펠 릿 20 mL 워시 버퍼에서 resuspend.</li>
	<li>단계 반복 2.12 2.13 두 번 필터와 튜브 각 시간을 변경 합니다. 전 5 분 이상 워시 버퍼에 필터를 몸을 담글 오전 수확량을 증가 합니다. 100을 추가 하 여 단일 세포 현 탁 액을 준비 μ 흐름/정렬 셀 펠 릿에 버퍼.</li>
	<li>Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 마우스 Fc 블록을 추가 하 여 차단 (클론 2.4G2, 10 μ g/mL)와 얼음에 20 분 동안 잠복기.</li>
	<li>항 체 단일 얼룩 컨트롤11,25FMO와 얼룩을 수행 합니다. 평가 하는 폐 세포 분석기로 셀 단일 셀 cytometry 분석 하 여 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>셀 정렬 하 여 정렬 AMs ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 마우스에 있어 문화 매체 AMs에 생체 외 문화 또는 vivo에서 것입니다 때 셀 전송. 또는, 1 mL 세포의 용 해 버퍼 10 μ/mL β-Mercaptoethanol RNA 추출에 대 한 보충으로 AMs를 정렬 합니다.</li>
</ol>3. 인간의 발 액체에서 AMs의 격리
<ol><li>4 ° c.에 실험실을 병원에서 인간의 발 액체의 이동 정렬</li>
	<li>10 분 동안 발 유체 (10-50 mL) 4 ° C에서 250 x g에서 원심. 셀 펠 릿 발 셀11포함 되어 있습니다.</li>
	<li>20 mL 워시 버퍼와 펠 릿을 세척 (PBS + 2% 열 사 FBS + 2 mM EDTA)와 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.</li>
	<li>발 셀 흐름/정렬 버퍼의 100 μ에는 resuspend (PBS + 2% 열 사 FBS 1 mM EDTA + 25mm HEPES).</li>
	<li>인간의 Fc 블록 (클론 Fc1.3070, 25 μ g/mL)을 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 배양 하 여 Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 차단.</li>
	<li>항 체 단일 얼룩 컨트롤11,24FMO와 얼룩을 수행 합니다. BAL 평가 셀 분석기로 셀 단일 셀 cytometry 분석 하 여 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>셀 정렬 하 여 정렬 AMs ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 인간의 오전 문화 매체 또는 1 mL 세포의 용 해 버퍼에 보충 10 μ/mL β-Mercaptoethanol.</li>
</ol>4. 문화 체 외에서 AMs에의
<ol><li>셀 정렬, 다음 10 분 동안 4 ° C에서 250 x g에서 centrifuging 여 세포를 수확.</li>
	<li>1 mL 인간의 오전 문화 매체 [로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 1640 보충 10 %FBS, 20 %L-929 문화 (의 소스로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF), 100 U/mL 최종 농도), 표면에 뜨는 인간의 AMs resuspend 1mm 나트륨 pyruvate, 10 m m N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 산 (HEPES), 및 (옵션) 1 x 페니실린/스]. 마찬가지로, 마우스 AMs 1 mL 마우스 오전 문화 매체 [DMEM 10 %FBS, 20 %L-929 문화 (의 소스로 M-CSF, 100 U/mL 최종 농도), 표면에 뜨는 1mm 나트륨 Pyruvate, 10 mM HEPES, 및 (선택 사항 1 x 페니실린/스 보충을 resuspend합니다 )].</li>
	<li>Trypan 블루 제외 가능한 셀 셀 카운터로 열거 하 고 1 x 106/mL에서 실행 가능한 세포 농도 조정 합니다. 참고: 이상적으로, 최대 5 x 105 AMs 수 발 유체는 8 10 주 오래 된 C57BL/6 남성 마우스에서 수집 으로부터 격리. 마우스 폐 다이제스트에서 오전 항복 변수 이며 마우스 발 액체의 보다 약간 덜 수 있습니다. 인간의 발 액체에서 오전 항복 발 액, 게, 그리고 환자의 임상 상태에 사용 하는 염 분의 총 볼륨의 볼륨에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>수율과 실험 필요성에 따라, 챔버 슬라이드, 문화 요리 또는 문화 플라스 크에 세포 씨앗. 이상적으로, 1 x 105/mL T25 조직 배양 플라스 크에 10 mL 매체에 AMs 씨앗.</li>
	<li>셀 5% CO2 분위기 37 ° C 습도 인큐베이터에 품 어. 참고: AMs 부착 세포로 성장할 것입니다 그리고 매우 느린-성장 하는 (시간을 두 배로 > 7 일).</li>
	<li>24 시간 후 시드, AMs 되어야 점착 및 문화 매체의 부드러운 변화에 의해 분리 되지 것입니다. 한쪽에서 포부에 의해 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 신선한 매체와 보충 참고: 셀 이제 오전 생리학 또는 자극의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. AMs 성장 챔버 슬라이드에 적절 한 항 체와 편리 하 게 얼룩이 질 수 있다 고 현미경 시각화에 이상적입니다. 흐름 cytometric 평가, AMs 비 효소 셀 솔루션 해리 외피에 의해 수확.</li>
	<li>문화 매체를 발음 하 고 문화 표면 (T25 플라스 크 당 약 2 mL)와 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어 충분히 출신과 솔루션을 추가 합니다. 아니 된다고 해야 합니다, 그리고 세포를 기계적으로 긁어 권장 되지 않습니다. 부드럽게 양쪽, 1-2 mL 흐름/정렬 버퍼 추가 누르고 부드럽게 위아래로 분리 부착 세포의 대부분을 플라스틱.</li>
	<li>RNA 연구에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 여 문화 접시에 직접 세포를 lyse.</li>
</ol>

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<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
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</ol>

저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.

AMs는 출생 시 시작 및26의 전체 수명 동안 지속 폐를 채우는 긴-생활 폐 상주 세포. 폐 생리학7 과 병리학12 및 폐 면역24 의 그들의 잠재력에서 그들의 역할을 인정 받고 있다. AMs 폐11,27 에 있는 장기 존재와 그들이 활성화 및 면역 반응11,24, 다른 만성 염증 및 거리 폐에 그들의 역할의 진행에 관여 하는 있기 때문에 질병 평가 될 필요가 있다. 역사적으로, AMs 혼란된 정체성 졌고 종종 오인 했다. 최근 채택된 phenotypic 마커25,<sup class="xr...

폐 microenvironment 정교한 공기 도관, 맥 관 구조는 고유 하 게 복잡 한 생태계 이다. 흡입된 공기 혈액 공기 가스 교환 발생 하는 위치는 폐 포에 도달 하기 전에 기관 그리고 기관지 및 bronchioles의 수많은 분 지를 통해 여행. 분위기와 직접 상호 작용을 인해 호흡기 표면 공 수 입자와 오염 물질의 잠재적으로 유해한 영향 으로부터 보호를 요구 한다. 다양 한 물리, 화학, 및 면역학 장벽 폐를 보호합니다. 특히, 호흡기 표면에 phagocytes의 배포는 중요 한 첫 번째-라인 방어 시스템을 제공합니다. 치경 세포 (AMs)는 한 가지 유형의 폐 상주 식 세포, 그리고 그들은 폐 대 식 세포 수영장의 대부분을. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, AMs 주로 치경 루멘에 지역화 하 고 지속적으로 주변 분위기를 샘플 하 고 치경 상피1와 통신 하는 무 셀으로 발생 합니다. 정상 상태 폐에서 치조 공간에서 식 세포의 95%는 AMs2, 염증, 감염, 또는 오염 물질에 만성 노출의 구성을 변경할 수 있습니다.
AMs 폐에 로컬 될 수 있는 함수 및/또는 조직의 중요성의 광범위에 참가 한다. 예를 들어 AMs는 개발 및 폐;의 최적의 기능에 필수적 면역 감시; 그리고 세포 파편, 병원 균와 흡입된 입자3,,45,,67의. AMs의 타겟된 고갈 호흡기 바이러스 및 박테리아4,8의 손상으로 알려져 있다. 식 세포와 폐 항상성의 첫 줄 수비수로 서 자신의 역할, 외 AMs 알려져 있습니다 T 도출에 세포를 항 원 제시 세포 면역9, 작동 potentiating intranasal 백신10 의 효능과 폐 이식11,12후 폐 제한 면역에 영향을 미치는. 오전 기능 결핍 폐 치조 proteinosis (PAP), 유전자 변이, 악성 종양 또는 감염 폐 계면 활성 제13,14의 손상 발생 조건에 연결 되었습니다. AMs의 이식 PAP 15,16의 처리를 위한 치료 방법으로 탐험 되 고 지금입니다.
AMs는 embryogenesis 동안 발생 하 고 인생을 통해 폐 순환 백혈구2,17로 대체 되 고 없이 유지 알려져 있습니다. 오전 매출의 다양 한 수준의 인플루엔자 바이러스4, myeloablative 조사18도에 노출에 의해 감염을 포함 하 여 특정 임상 상황에 보고 되었습니다 비록, 오전 회전율 homeostatic 폐에서 감지, 19, 그리고 나이20. AMs는 낮은 확산17,21를 통해 자기 갱신으로 하지만 일부 최근 연구 monocytes 혈관 내 폐 세포22,23 아래에서 인구를 야기할 수 있는 주장 하지만 이러한 새로 변환 된 폐 세포의 기능 실험 조건, 폐 질환에 정의 하 아직 있다. 또한, 폐 염증 신호 및 immunoregulatory 기계 사이 균형을 유지 하는 시도 잠재적으로 흥미로운 영역입니다 오전 활성화의 맥락에서 자극의 임계값을 이해.
면역 규칙의 손실 생리 또는 pathologic 변경 다양 한 임상 설정 (예: 호흡기 감염, 염증 성 폐 질환과 거리 폐 질환)에서 평가에 중요 하다. 그럼에도 불구 하 고, AMs는 지표 또는 폐 건강11,24의 심지어 결정 요인으로 점점 인식 된다. 현재, 수확, 특성화, 또는 인간 및 전 임상 murine 모델에서 유지 AMs 사용할 수 없는 통합된 프로토콜 있습니다. 오전 선구자 및 고기, 합의의 부족 및 상세한 방법론의 부재 폐 건강 및 질병에 오전의 해독 역할에서 주요 장애물이 있었다. 다음 프로토콜 최종 식별, 격리 및 생체 외에서 문화 전략을 크게 오전 동작의 이해를 전진 하 고 오전 대상으로 진단 및 치료 연구를 용이 하 게 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>비효소 세포 해리 용액</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G 카테터;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 비흡수성 실크 브레이디드 봉합사&nbsp;</td><td>켄트 사이언티픽</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' S 인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Fc 블록&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>용해 완충액 (PureLink RNA Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>밀리포어-시그마</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II 세포 분류기&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>케타민&nbsp; (케타테시아)</td><td>헨리 샤인</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>자일라진&nbsp; (아나세드)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>애틀랜타 생물학적 S11150H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-929 세포주</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 조직 배양 플라스크</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>156367</tr><tr><td>60mm 배양 접시&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSR포르테사 세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FlowJo</td><td>FlowJo v10.4</td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (마우스)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>클론 BM8, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>클론 OX-62, BV650 활용</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>127015 101216</td><td>클론 927, APC 활용</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>클론 SA011F11, BV785 활용</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Human)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Human)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td></tr></tbody></table>

고립과 murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

치경 대 식 세포는 태아 근원의 말기 분화, 폐 상주 대 식 세포. 치경 대 식 세포는 그들의 긴 수명 및 폐 지역화 감염 및 염증 응답 뿐만 아니라 폐 개발 및 기능, 그들의 중요 한 역할에서 고유. 날짜 하려면, 식별, 격리, 및 인간과 쥐에서 치경 대 식 세포의 취급에 대 한 통합된 방법 존재 합니다. 이러한 메서드는 다양 한 실험 설정에서 이러한 중요 한 타고 난 면역 세포에 대 한 연구에 대 한 필요 하다. 쉽게 어떤 연구소에 의해 채택 될 수 있습니다, 여기에, 설명 하는 방법을 bronchoalveolar 게 액체 또는 폐 조직에서 치경 대 식 세포를 수확 하 고 그들 에 시험관을 유지 하는 간단한 접근 방법입니다. 치경 대 식 세포는 폐 포에 부착 세포로 주로 발생 하기 때문에이 방법의 초점은 수확 및 식별 하기 전에 그들을 dislodging에 있습니다. 폐는 매우 vascularized 기관 그리고 골수성과 림프 근원의 다양 한 셀 형식 서식, 상호 작용, 폐 microenvironment에 의해 좌우 된다. 여기 설명 된 표면 마커 집합을 사용 하 여 연구원 수를 쉽고 명확 하 게 다른 백혈구에서 치경 대 식 세포를 구별 고 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들을 정화. 여기 개발 문화 메서드 두 인간을 지원 하 고 치경 대 식 세포에 체 외 성장에 대 한 마우스 세포질이 고 분자 연구와 호환 됩니다.

흐름 cytometric 접근 마우스 AMs를 식별 하는 그림 1에 표시 됩니다. 이 표면 마커 다른 폐 상주 또는 폐에 침투 식 세포에서 AMs를 구별 하는 데 필요한 최소한의 분석을 포함 한다. 차동 분석은 긍정적으로 중간 세포, 수지상 세포, 호 중구, monocytes, 및 폐에서 발생 하는 monocyte 파생 된 폐 세포에서 AMs를 식별 해야 합니다. 표면 마커 다음 구성표 쉽게 구별이 세포 유형 서로 어디 AMs CD45는 채택 될 수 있다+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+-A+ b, f 4/80-, CD11b- ; 중간 대 식 세포 는 CD45+, CD11b+</s...

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

이 절차의 전반적인 목표는 폐와 기관지폐포 세척액에서 인간과 생쥐의 폐포 대식세포를 분리하고 체외 배양을 위한 방법을 개발하는 것입니다. 이 방법은 호흡기 감염, 염증 및 자가면역에서 폐포 대식세포의 역할과 같은 폐 면역학 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 폐포 대식세포를 다른 폐 백혈구와 구별하고 실험 목적으로 고도로 정제된 폐포 대식세포 집단을 얻을 수 있다는 것입니다.마취된 마우스를 복부 쪽이 위를 향하도록 해부 표면에 놓습니다. 탈수를 방지하기 위해 안과 수의사 연고를 눈에 바르십시오. 70% 이소프로판올로 포화된 멸균 알코올 준비 패드로 마우스의 전체 복부 표면을 닦아 소독합니다.네 다리를 모두 유지한 상태로 마우스를 장착합니다. 마이크로 박리 도구로 복강을 부드럽게 엽니다. 내장 기관을 손상시키거나 돌출된 조직을 생성하지 않고 가능한 한 많은 영역을 열도록 주의해야 합니다.종격동을 통해 흉곽을 천천히 절개하여 흉강을 부드럽게 엽니다. 이상적으로는 흉곽을 좌우로 절제할 수 있습니다. 흉강을 여는 동안 폐의 흉막을 손상시키지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다.하대정맥을 찾아 절개하여 쥐의 출혈을 유발합니다. 흡수성 화장솜을 사용하여 혈액을 흡수하십시오. 10ml의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수를 우심실에 주입하여 순환하는 혈액 세포를 씻어냅니다.흡수성 화장솜으로 혈액의 흐름을 흡수하십시오. 완전히 관류되면 폐가 희어진 것처럼 보이고 세척할 준비가 됩니다. 목의 피부와 근육을 부드럽게 잘라 기도가 드러나도록 합니다.기관을 손상시키지 않고 인접한 근육, 연골 및 지방 조직을 조심스럽게 절제합니다. 다음으로, 후두 뒤쪽의 기관을 작게 절개합니다. 이 절개 부위는 기관이 후두에 연결되어 있는 동안 카테터를 삽입할 수 있을 정도여야 합니다.BAL 유체를 채취하는 데 가장 중요한 단일 단계는 세척 중 누출을 최소화하기 위해 카테터를 기관에 단단히 부착하는 것입니다. 바늘이 없는 1인치 22게이지 카테터를 폐 쪽의 기관에 삽입합니다. 실크 꼰 봉합사와 사각 매듭으로 카테터를 고정합니다.튼튼한 손을 가지고 이 단계를 따르기 위해 천천히 그리고 부드럽게 기관과 폐의 파열을 방지합니다. 얼음처럼 차가운 BAL 완충액으로 채워진 1ml 주사기를 카테터에 부착하고 완충액을 폐에 천천히 주입합니다. 이것은 폐를 팽창시킬 것입니다.주사기를 카테터에 5초 동안 부착한 상태로 유지한 다음 피스톤을 부드럽게 당겨 세척액을 흡입합니다. 이것은 폐를 수축시킬 것입니다. 얼음 위에 놓인 15ml 원뿔형 튜브에 액체를 모으십시오.팽창과 수축을 9회 더 반복하고 세척액을 모읍니다. 폐활량을 초과하여 파열을 유발할 수 있으므로 세척당 1ml의 완충액을 초과하지 마십시오. 10ml의 BAL 유체를 250배 g, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.세포 펠릿에는 BAL 세포가 포함되어 있습니다. BAL 세포를 100마이크로리터의 흐름 분류 버퍼에 재현탁합니다. text protocol에 설명된 대로 세포를 염색하고 분류합니다.마취된 마우스를 해부를 준비하고, 절개를 수행하고, 이전과 같이 마우스의 출혈을 수행합니다. 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 우심실에 주입하여 순환하는 혈액 세포를 씻어냅니다. 완전히 관류되면 폐가 희게 보이고 수확할 준비가 됩니다.기관, 혈관 및 인대를 절단하여 15ml 원뿔형 튜브와 5ml의 차가운 DMEM으로 폐를 절개합니다. 다음 단계까지 얼음 위에서 유지하십시오. 관류된 폐를 3ml의 DMEM이 함유된 멸균 및 발열원이 없는 60mm 배양 접시에 옮깁니다.겸자 해부의 도움으로 기도 및 기타 단단한 폐가 아닌 조직 물질(있는 경우)을 추출합니다. 메스로 폐 조직을 1mm 미만으로 다지십시오. Liberase TL의 밀리리터당 300마이크로그램과 DNAse 1의 밀리리터당 5단위를 추가합니다.피펫팅으로 혼합하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 25분 동안 배양합니다. 10분 후, 피펫팅으로 한 번 부드럽게 섞습니다. 해리된 폐를 50ml 원뿔형 튜브에 설치된 100미크론 세포 여과기에 통과시킵니다.1ml 주사기의 플런저 뒷면을 사용하여 필터의 세포 덩어리를 으깨십시오. 20ml의 세척 버퍼로 필터를 세척하십시오. 500 회 g과 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리기.상층액을 버리고 세포 펠릿을 20ml의 세척 완충액에 재현탁합니다. 변형 및 원심분리 단계를 두 번 반복하여 매번 필터와 튜브를 교체합니다. 마지막으로, 세포 펠릿에 100마이크로리터의 유동 분류 완충액을 추가하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 항체 염색 및 세포 분류를 수행합니다. 세포 분류 후 250배 g, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 1ml의 마우스 AM 배양 배지에 마우스 AM을 재현탁시킵니다.수율과 실험적 필요성에 따라 챔버 슬라이드, 배양 접시 또는 배양 플라스크에 세포를 파종합니다. 이상적으로는 T 25 조직 배양 플라스크에 10ml의 배지를 사용하여 AM을 밀리리터당 100, 000으로 시딩하는 것이 좋습니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소 분위기로 세포를 배양합니다.파종 후 24시간이 지나면 AM이 부착되어야 하며 배양 배지의 부드러운 변화로 인해 분리되지 않습니다. 한쪽 끝에서 흡인으로 매체를 제거하고 섭씨 37도로 예열된 새로운 배지로 보충합니다. 마지막으로 도립 현미경으로 플라스크를 관찰합니다.마우스 기관지 폐포 세척액에서 폐포 대식세포의 유세포 분석 평가가 표시됩니다. 폐포 대식세포는 CD45 양성, CD11c 양성 및 Siglec-F 양성 세포로 확인됩니다. 여기에 보이는 것은 24시간 동안 체외에서 배양된 쥐 폐포 대식세포의 대표적인 결과입니다.세포가 부착되고 배양 배지를 부드럽게 변경해도 세포가 분리되지 않습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스와 인간 폐포 대식세포를 다른 폐 세포와 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.또한, 다운스트림 실험을 위한 아름다운 폐포 대식세포 개체군을 얻기 위한 절차로서. 이 절차를 시도하는 동안 모든 폐 상주 대식세포 또는 식세포가 폐포 대식세포는 아니라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 폐포 대식세포(alveolar macrophage)는 태어날 때부터 폐에 존재하는 특수 세포의 일종입니다.폐포 대식세포를 분리하기 위해서는 폐포 미시 환경에서 실행 가능한 추출 방법에 초점을 맞춰야 합니다. 여기에서 개발된 체외 배양 방법은 분자 및 세포 분석에 활용할 수 있는 실험실 조건에서 폐포 대식세포의 성장을 지원합니다. 이 절차에 따라 폐포 대식세포의 생물학에 대한 추가 질문에 답하기 위해 양자 세포 전달, 항원 제시 및 염증 자극에 대한 반응 평가와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

여기서는 쥐 복막 대식세포를 분리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 절차 다음에는 RNA 추출을 수행하여 Toll-like receptor 자극에 대한 유전자 발현 분석을 수행합니다.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)로 배양된 골수 세포는 대식세포와 수지상 세포(DC)를 포함하는 이종 배양을 생성합니다. 이 방법은 MHCII 및 히알루로난(HA) 결합을 사용하여 GM-CSF 배양의 DC와 대식세포를 구별하는 방법을 강조합니다. 이 문화권의 대식세포는 폐포 대식세포와 많은 유사점을 가지고 있습니다.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

우리는 폐 HIV 저수지를 평가하기 위하여 항레트로바이러스 치료에 만성 HIV 에 감염된 개별에게서 기관지 정맥 세척 액 및 일치한 말초 혈액을 처리하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법은 초과민성 중합효소 연쇄 반응에 의한 면역phenotyping 및 HIV DNA/RNA 정량화에 사용될 수 있는 고순도 CD4 T 세포 및 폐포 대식세포의 획득을 초래한다.

기관지 충혈 유체 및 폐포 대식세포 및 CD4+ T 세포 면역체노티핑 및 HIV 저수지 평가를 위한 일치하는 혈액 처리

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

여기에 제시된 1 차적인 인간 혈액 단화 절연을 위한 프로토콜은 대식세포 및 수지상 세포로의 분화뿐만 아니라 다세포 인간 폐 모델로 상피 세포를 조립한다. 염증 성 자극에 노출되면 갓 분리되거나 해동 된 단핵구로부터 분화 된 면역 세포로 구성된 공동 배양의 생물학적 반응이 비교됩니다.

유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

학습하세요 인간과 쥐의 폐포 대식세포 분리 및 생체 외 배양 방법을. 폐 면역학 연구에서 호흡기 감염과 염증의 역할을 밝히는 데 활용됩니다.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

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