고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

이 절차의 전반적인 목표는 폐와 기관지폐포 세척액에서 인간과 생쥐의 폐포 대식세포를 분리하고 체외 배양을 위한 방법을 개발하는 것입니다. 이 방법은 호흡기 감염, 염증 및 자가면역에서 폐포 대식세포의 역할과 같은 폐 면역학 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 폐포 대식세포를 다른 폐 백혈구와 구별하고 실험 목적으로 고도로 정제된 폐포 대식세포 집단을 얻을 수

마취된 마우스를 복부 쪽이 위를 향하도록 해부 표면에 놓습니다. 탈수를 방지하기 위해 안과 수의사 연고를 눈에 바르십시오. 70% 이소프로판올로 포화된 멸균 알코올 준비 패드로 마우스의 전체 복부 표면을 닦아 소독합니다.

네 다리를 모두 유지한 상태로 마우스를 장착합니다. 마이크로 박리 도구로 복강을 부드럽게 엽니다. 내장 기관을 손상시키거나 돌출된 조직을 생성하지 않고 가능한 한 많은 영역을 열도록 주의해야 합니다.

종격동을 통해 흉곽을 천천히 절개하여 흉강을 부드럽게 엽니다. 이상적으로는 흉곽을 좌우로 절제할 수 있습니다. 흉강을 여는 동안 폐의 흉막을 손상시키지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다.

하대정맥을 찾아 절개하여 쥐의 출혈을 유발합니다. 흡수성 화장솜을 사용하여 혈액을 흡수하십시오. 10ml의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수를 우심실에 주입하여 순환하는 혈액 세포를 씻어냅니다.

흡수성 화장솜으로 혈액의 흐름을 흡수하십시오. 완전히 관류되면 폐가 희어진 것처럼 보이고 세척할 준비가 됩니다. 목의 피부와 근육을 부드럽게 잘라 기도가 드러나도록 합니다.

기관을 손상시키지 않고 인접한 근육, 연골 및 지방 조직을 조심스럽게 절제합니다. 다음으로, 후두 뒤쪽의 기관을 작게 절개합니다. 이 절개 부위는 기관이 후두에 연결되어 있는 동안 카테터를 삽입할 수 있을 정도여야 합니다.

BAL 유체를 채취하는 데 가장 중요한 단일 단계는 세척 중 누출을 최소화하기 위해 카테터를 기관에 단단히 부착하는 것입니다. 바늘이 없는 1인치 22게이지 카테터를 폐 쪽의 기관에 삽입합니다. 실크 꼰 봉합사와 사각 매듭으로 카테터를 고정합니다.

튼튼한 손을 가지고 이 단계를 따르기 위해 천천히 그리고 부드럽게 기관과 폐의 파열을 방지합니다. 얼음처럼 차가운 BAL 완충액으로 채워진 1ml 주사기를 카테터에 부착하고 완충액을 폐에 천천히 주입합니다. 이것은 폐를 팽창시킬 것입니다.

주사기를 카테터에 5초 동안 부착한 상태로 유지한 다음 피스톤을 부드럽게 당겨 세척액을 흡입합니다. 이것은 폐를 수축시킬 것입니다. 얼음 위에 놓인 15ml 원뿔형 튜브에 액체를 모으십시오.

팽창과 수축을 9회 더 반복하고 세척액을 모읍니다. 폐활량을 초과하여 파열을 유발할 수 있으므로 세척당 1ml의 완충액을 초과하지 마십시오. 10ml의 BAL 유체를 250배 g, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.

세포 펠릿에는 BAL 세포가 포함되어 있습니다. BAL 세포를 100마이크로리터의 흐름 분류 버퍼에 재현탁합니다. text protocol에 설명된 대로 세포를 염색하고 분류합니다.

마취된 마우스를 해부를 준비하고, 절개를 수행하고, 이전과 같이 마우스의 출혈을 수행합니다. 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 우심실에 주입하여 순환하는 혈액 세포를 씻어냅니다. 완전히 관류되면 폐가 희게 보이고 수확할 준비가 됩니다.

기관, 혈관 및 인대를 절단하여 15ml 원뿔형 튜브와 5ml의 차가운 DMEM으로 폐를 절개합니다. 다음 단계까지 얼음 위에서 유지하십시오. 관류된 폐를 3ml의 DMEM이 함유된 멸균 및 발열원이 없는 60mm 배양 접시에 옮깁니다.

겸자 해부의 도움으로 기도 및 기타 단단한 폐가 아닌 조직 물질(있는 경우)을 추출합니다. 메스로 폐 조직을 1mm 미만으로 다지십시오. Liberase TL의 밀리리터당 300마이크로그램과 DNAse 1의 밀리리터당 5단위를 추가합니다.

피펫팅으로 혼합하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 25분 동안 배양합니다. 10분 후, 피펫팅으로 한 번 부드럽게 섞습니다. 해리된 폐를 50ml 원뿔형 튜브에 설치된 100미크론 세포 여과기에 통과시킵니다.

1ml 주사기의 플런저 뒷면을 사용하여 필터의 세포 덩어리를 으깨십시오. 20ml의 세척 버퍼로 필터를 세척하십시오. 500 회 g과 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리기

상층액을 버리고 세포 펠릿을 20ml의 세척 완충액에 재현탁합니다. 변형 및 원심분리 단계를 두 번 반복하여 매번 필터와 튜브를 교체합니다. 마지막으로, 세포 펠릿에 100마이크로리터의 유동 분류 완충액을 추가하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 항체 염색 및 세포 분류를 수행합니다. 세포 분류 후 250배 g, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 1ml의 마우스 AM 배양 배지에 마우스 AM을 재현탁시킵니다.

수율과 실험적 필요성에 따라 챔버 슬라이드, 배양 접시 또는 배양 플라스크에 세포를 파종합니다. 이상적으로는 T 25 조직 배양 플라스크에 10ml의 배지를 사용하여 AM을 밀리리터당 100, 000으로 시딩하는 것이 좋습니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소 분위기로 세포를 배양합니다.

파종 후 24시간이 지나면 AM이 부착되어야 하며 배양 배지의 부드러운 변화로 인해 분리되지 않습니다. 한쪽 끝에서 흡인으로 매체를 제거하고 섭씨 37도로 예열된 새로운 배지로 보충합니다. 마지막으로 도립 현미경으로 플라스크를 관찰합니다.

마우스 기관지 폐포 세척액에서 폐포 대식세포의 유세포 분석 평가가 표시됩니다. 폐포 대식세포는 CD45 양성, CD11c 양성 및 Siglec-F 양성 세포로 확인됩니다. 여기에 보이는 것은 24시간 동안 체외에서 배양된 쥐 폐포 대식세포의 대표적인 결과입니다.

세포가 부착되고 배양 배지를 부드럽게 변경해도 세포가 분리되지 않습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스와 인간 폐포 대식세포를 다른 폐 세포와 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

또한, 다운스트림 실험을 위한 아름다운 폐포 대식세포 개체군을 얻기 위한 절차로서. 이 절차를 시도하는 동안 모든 폐 상주 대식세포 또는 식세포가 폐포 대식세포는 아니라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 폐포 대식세포(alveolar macrophage)는 태어날 때부터 폐에 존재하는 특수 세포의 일종입니다.

폐포 대식세포를 분리하기 위해서는 폐포 미시 환경에서 실행 가능한 추출 방법에 초점을 맞춰야 합니다. 여기에서 개발된 체외 배양 방법은 분자 및 세포 분석에 활용할 수 있는 실험실 조건에서 폐포 대식세포의 성장을 지원합니다. 이 절차에 따라 폐포 대식세포의 생물학에 대한 추가 질문에 답하기 위해 양자 세포 전달, 항원 제시 및 염증 자극에 대한 반응 평가와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.