Name: Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 학습하세요 Kaede 형광단백질 광전환을 이용하여 살아있는 zebrafish 태아의 심내막 세포를 추적하는 방법을. 이 기술은 심장판막 형성 과정에서 세포 이동을 실시간으로 관찰할 수 있게 합니다.

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우리 앤 Laure Duchemin, 데니스 Duchemin, 나탈리 Faggianelli 및 바 실 Gurchenkov 디자인 하 고 만들어서 형이이 프로토콜에서 설명 하는 데 도움 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 유럽 공동체, ERC 장부 N ° 682938, EMBO 젊은 조사 프로그램, ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), FRM (DEQ20140329553)에 의해 지원 되었다 Evalve 그랜트 ANR-10-LABX-0030-INRT에 의해 프랑스 국가 기금에 의해 관리 ANR-10-IDEX-0002-02 프레임 프로그램 Investissements d'Avenir에서 직원 회 드 라 검색 표시.

1. 금형을 준비 하 고 장착 agarose
<ol><li>3D 프린터 또는 전통적인 기계 워크숍 도구를 사용 하 여 그림 1 에 표시 된 치수와 금형을 만듭니다.</li>
	<li>35 m m 플라스틱 마운트 그릇에 녹 인된 1 %agarose 약 1.5 mL를 플라스틱. 형과 agarose 사이 트랩 공기를 피하기 위해 돌보는 액체 agarose에서 플라스틱 금형을 놓습니다. 4 ° C에서 접시를 놓고는 agarose 견고 (약 5 분이이 소요) 때까지 기다려 다음 플라스틱 몰드를 제거 합니다.</li>
	<li>나중에 사용에 대 한 장착 접시를 저장 하는 뚜껑 접시 커버 다음 접시와 뚜껑 parafilm으로 단단히 포장. 장착 요리를 저장할 수 있습니다 다음 뚜껑 면이 아래로 최대 5 일 동안에 4 ° c.</li>
	<li>1.5 mL에 0.7% 낮은 융 점 agarose의 1 mL aliquots Eppendorf 관 장착 당일 사용을 사전에 준비 합니다. 참고: 장착 접시의 agarose 우물 것 이다 변형 시간이 지남에으로 물 증발 parafilm 래핑되지 않은 요리 주위 밀접 하 게 하는 경우.</li>
</ol>2.는 Photoconversion에 대 한 배아를 얻기
<ol><li>Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) 라인과 28.5 ° c.에 어둠 속에서 배아 중간에 약 200 배아를 성장 제 브라 라인을 교차 하는 방법에 자세한 내용은 정돈 과학 교육 데이터베이스11를 참조 하십시오.</li>
	<li>5 h 후만 24 시간 전에 치료 1-페 닐-2-thiourea 색소 형성을 방지 (PTU)와 태아 (0.003% 배아 중간에 통해).</li>
	<li>약 1 h photoconversion, 형광 stereoscope 아래 화면 배아 및 선택 5 건강 한 배아의 시작 하기 전에 나타나는 밝은 녹색 형광을 표현 하. 낮은-강도 빛 머릿속 배아 때의 사용은 photoconverting가 아닌 특정 셀에 피하기 위하여 주변광을 배아의 노출을 피하기 위해 권장 됩니다.</li>
</ol>3. 포함
<ol><li>설치 미디어의 10 mL를 준비: 0.02 %tricaine 및 50 mM BDM 배아 매체에.</li>
	<li>장착 접시를 장착 중간의 2 개 mL를 추가 하 고 솔루션은 agarose로 확산을 위한 15-30 분을 허용.</li>
	<li>한편, 약 5 분 동안 70 ° C 열 블록에 튜브를 삽입 하 여 0.7% 낮은 녹는점 (LMP) agarose의 약 1 mL 수를 녹여.<ol>
<li>약간, 냉각 LMP agarose 기다립니다 다음 낮은 융 점 agarose의 튜브에 8mg/mL tricaine 솔루션의 25 µ L와 1m BDM 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. 아래로, pipetting으로 혼합 튜브 LMP agarose 액체 상태로 유지 하는 38 ° C 열 블록에 다음 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>페 트리에서 배아 매체, 신중 하 게 dechorionate와 접시는 배아를 손상 하지 않도록 주의 복용 집게를 사용 하 여 stereomicroscope에서 미리 선택 된 배아.</li>
	<li>미디어를 마운트의 2 개 mL를 포함 하는 별도 접시에는 배아를 전송 합니다.<ol>
<li>배아의 마음은 중지 하는 경우 (약 5-10 분 소요), 장착에 태아 요리 하 고 그들은 25도 각도로 거짓말 집게를 사용 하 우물에 배아 전송 잘 향하도록 노른자위의 더 깊은 부분 쪽으로 향하고 꼬리.</li>
		<li>배아 약 미디어를 제거 하는 장소에, tricaine 및 BDM, 0.7% LMP agarose의 ~ 200 µ L에 배아를 포함 하 고, 태아의 위치를 재조정 왼쪽 이나 오른쪽 필요에 따라 배아를 기울이기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMP agarose 세트 (약 5 분 소요)까지 기다려 접시에 장착 매체를 추가 합니다. 배아는 이제 photoconverted 될 준비가. 참고:는 tricaine와는 BDM 사용 됩니다 anesthetize 배아와 태아의 심장, 각각 중지. 설치 미디어 영상, 전날 준비 될 수 있다 그러나 빛에서 미디어를 보호 하기 위해 확인 한다. 참고: 태아의 정확한 위치는 하나 photoconvert을 하고자 하는 셀에 대 한 명확한 레이저 경로 허용 해야 합니다. 레이저 광은 태아를 도달 하는 멀리 여행 하지 않아도 고 배아 수 쉽게 탑재 photoconversion 후 태아의 머리 우물의 시작 가까이 위치.</li>
</ol>4입니다. Photoconversion
<ol><li>직 립 confocal 현미경 (Leica SP8) 같은 장비는 405에 nm, 488 nm 및 561 nm 레이저 소스를 찾아 태아의 백색 광 (명시)와 목표 렌즈 전송 심장 사용 하 여 (같은 Leica HCX IRAPO L, 25 × 없음 0.95 목표). 빨간 데 형광 561 nm 레이저 (즉, 561 DPSS 레이저, ~ 5% 강도로, 검출기 589-728 nm에서 설정)를 사용 하 여 확인 합니다. 그런 다음, 488 nm 레이저 (즉, 30 mW 여러 줄 아르곤 레이저 ~ 5% 강도로, 검출기 502-556 nm에서 설정)를 사용 하 여는 endocardium 시각화.</li>
	<li>현미경 수집 소프트웨어에 "FRAP" 모드를 입력 합니다. 선택 ~ 1% 레이저 전원 모두 488 nm 및 561 nm 레이저.</li>
	<li>관심의 비행기에 초점을, 관심 (ROI)의 영역을 선택 하는 다음 25% 레이저 전력, 투자 수익을 통해 세 번 검사에서 405 nm 다이오드를 사용 하 여 photoconvert 셀 레이저. 부족 한 데는 투자 수익에서 photoconverted 해야, 스캔 405 nm 레이저 지역 세 번 다시. 모든 ROIs에 대해이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>소프트웨어에 "TCS SP8" 모드를 반환 하 고 인수는 561를 사용 하 여 z-스택, nm, 488 nm 레이저 순차적으로. 이미지 속도 높이기 위해 '양방향' 옵션을 선택 해야 합니다. 참고: 얼마나 오래 걸리는 photoconvert 및 이미지 각 배아 다릅니다. 심장 박동은 정상적인 심장 밸브 개발에 대 한 중요 한, 그래서 하지 않은 시간 photoconvert 모든 5 배아 의미 하는 경우에 30 분 이상 중단 마음을 유지 하지 마십시오으로 알려져 있다. 참고: photoconversion 과정, 사용 PMT 검출기, photoconversion, 후 그것 것이 좋습니다 '계산' 모드를 설정 하는 하이브리드 감지기를 사용 하 여. 이 때문에 하이브리드 감지기 더 민감합니다와 더 나은 품질의 이미지를 생산 할 수 있다 하지만 노출 과도 의해 쉽게 손상 됩니다.</li>
</ol>5. photoconverted 배아를 마운트 해제
<ol><li>Photoconversion, 후 유리 피 펫을 사용 하 여 약간 LMP agarose 휴식 후 부드럽게 빨 아 태아 태아의 머리 위에 눌러.<ol>
<li>PTU (를 포함 하는 중간은 BDM 씻어)와 배아 매체를 포함 하는 35 mm 페 트리 접시에 유리 피 펫에서 배아를 꺼냅니다.</li>
		<li>PTU와 배아 매체를 포함 하는 6-잘 접시에 잘에 배아를 전송. 이 단계는 배아의 메모를 계속 확인이 필수적인 나중 발달 단계에서 photoconverted 셀의 위치를 연결 하는 잘로 들어간다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이제는 배아 BDM 포함 매체에서 제거 됩니다, 그들의 마음 반환 배아 배아 정상적으로 개발을 계속 있도록 28.5 ° C에서 어둠 속에 약 5 분에서 다시 치고 시작 해야 한다.</li>
</ol>6. 배아 단계 나중에 photoconverted 세포 이미징
<ol><li>원하는 단계에서 마음을 중지 하 고 다시이 프로토콜의 3 단계 같은 배아 배아 배아를 추적 하려면 별도, 표시 된 요리에서 BDM으로 대우 되어야 하는 중요 한 차이점으로 포함 합니다.</li>
	<li>62까지 배아에 대 한 hpf, z-스택 endocardium 561를 사용 하 여의 획득 nm, 488 nm 빨강 및 녹색 형광을 위한 신호를, 각각. 62 보다 오래 된 단계에서 태아에 대 한 hpf, 다 사용 하 여 레이저 세트 940 nm 녹색가 488 nm 레이저 대신 이미지.</li>
</ol>7. 이미지 분석 배아 미만 48 hpf
참고:는 AVC의 조직 움직임 때문에 그것의 복잡 한 3 차원 구조 분석 하기 어려울 수 있습니다. 두 비 photoconverted 지역 또는 비 photoconverted 지역 두 photoconverted 지역 간의 AVC에의 길이 사이 AVC에서 photoconverted 영역의 길이 계량 수에 3 차원 구조를 지도 하는 2 차원 지도입니다. Photoconverted 배아의 이미지 48 전에 얻은 hpf는 다음 메서드를 사용 하 여 분석 될 수 있다.
<ol><li>Matlab 또는 유사한 소프트웨어에 인수 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>투자 수익, 즉 endocardium, 수동으로 delimitate 고이 지역 밖에 서 신호를 제거 하는 마스크를 적용 합니다.</li>
	<li>이미지는 endocardium에 포인트를 확인 하 고 3 차원에서 플롯를 강도 임계값을 적용 합니다. 안마당에는 소프트웨어에서 지우기 명령을 사용 하 여 심 실 관심의 포인트를 수동으로 지우기 여는 AVC의 좁은 하 고 가장 직선 부분에 해당 하는 포인트를 격리 합니다.</li>
	<li>그래서 얻은 AVC를 나타내는 포인트에 맞게 실린더를 사용 합니다.</li>
	<li>여러 샘플을 비교 하는 참조 시스템을 정의 합니다. 예를 들어 참조 시스템의 기원과 z 축으로 장착 되어 실린더의 축으로 AVC 포인트의 질량 중심을 채택 한다.<ol>
<li>긍정적인 z-위치 (심 실 또는 atrial) 심장의 같은 쪽에 항상 해당 하는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>X-y 평면에서 AVC 포인트 프로젝트 고 그들을 맞는 타원을 사용 합니다.</li>
		<li>타원의 주요 축과 레퍼런스 시스템의 y는 병렬 하 고 태아에 관하여 AVC의 내부 측면에 해당 하는 긍정적인 y-값 endocardial 포인트 z 축 주위를 회전 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세그먼트는 AVC, 3 차원 데이터 집합 반 비행기를 회전 하 여 얻은 몇 가지 평면 컷 {y = 0, x > 0} z-방향에서.<ol>
<li>이 비행기에 인접 픽셀의 농도 프로젝트 하 고 일관 된 방식에서 endothelium을 정의 합니다. 예를 들어 수동으로 선을 그립니다는 심에서 endothelium의 절반 두께에서 AVC의 심 실 쪽으로.</li>
		<li>보간 스플라인 도구 상자를 사용 하 여 표면으로 AVC를 대표 하는 3 차원 스플라인 endothelium을 대표 하는 라인의 포인트. 참고: 절단 평면 수 세그먼트화의 정확도이 단계 시간 소비를 모두 결정합니다. 일반적으로, 8 비행기 좋은 결과 달성 하기에 충분 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원통형 좌표를 사용 하 여 AVC 표면에 각 점의 방위 위치를 정의 합니다.<ol>
<li>각 방위 위치에 연속 점 사이의 표면에 아크 길이 계산 하 여는 AVC의 표면 따라 파라메트릭 커브를 정의 합니다.</li>
		<li>각 매개 변수 곡선 지점을 정의 합니다 0 AVC의 센터에 가장 가까운 곡선에. AVC의 포인트는 따라서 완전히 기술 그들의 방위 위치 및 그들의 위치에 의해 파라메트릭 커브에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포인트의 파라메트릭 위치를 사용 하 여 2 차원 이미지에는 AVC를 전개.</li>
	<li>바이너리 이미지 임계 처리의 모서리는 photoconverted 농도 비 photoconverted 채널 사이의 비율 척도를 영역의 가장자리를 찾아. 필요한 경우 수동으로 결과 수정.</li>
	<li>방위 위치의 기능으로 직물의 길이 계산 하기 위해 가장자리 사이의 아크 길이 계산 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

Photoconversion의 타이밍: 비록가 남아 96 에서도 EdCs에 밝게 표현 hpf, 그 태아 성장 함에 따라 레이저 광 확산 더 장난의 한정 된 photoconversion를 더 어렵게 만드는 AVC에 도달 하기 전에 주목 해야 한다. At 배아 단계 55 보다 나중 hpf, 열기구는 심 실 및 아 트리 움의 의미 photoconversion 용 바이올렛 레이저 빔 AVC 셀 심 방 또는 심 실 첫 번째 통과 없이 연결할 수 없습니다. 55 이상 즉 hpf, photoconvert는 AVC의 EdCs 순서로 하나 해야 합니다 또한 photoconvert 추가 EdCs 심 방 및 심 실.
BDM과 tricaine: EdCs의 정확한 photoconversion 심장 박동에서 일시적으로 중지 해야 합니다. BDM (2, 3 butanedione monoxime)는 잘 알려진 심장 근육 수축12를 억...

Zebrafish는 현재 셀룰러 및 발달 과정에 vivo에서공부 하는 가장 중요 한 척추 모델 중 하나입니다. 이것은 크게 zebrafish의 광학 투명도 그리고 유전학, 그것에 게 유전으로 관련 된 광학 기술을 적용 하기 위한 강력한 모델을 순종 인코딩된 photoresponsive 단백질 기술1. 특정 심장 개발의 연구, zebrafish 받을 충분 한 산소 보급을 통해 하트 비트 없이 돌연변이 분석을 허용 하는 발달 유전자 교란된 효과에 개발의 첫 번째 주까지 살아남을 수 있는 그런 심장 morphogenesis 대부분 척추 동물2가능 하지에 혈액 흐름.
Zebrafish 심장 관 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된다. 그것의 대형 조금 후에 심장 튜브 적극적으로 치고 시작 합니다. 36에 의해 hpf, 분명 수축 분리는 심 실에서 심. 수축의이 지역에서에서 호출 됩니다 것 운하 (AVC), 그리고이 지역의 변화에 셀 편평 형태학 cuboidal 형태3. Zebrafish 것 밸브 morphogenesis 시작 약 48 h 수정 게시. 5 일에 의해 게시물 수정, 두 개의 밸브 전단지는 AVC로 확장 하 고 심장 주기4안마당에는 심 실에서 혈액의 역류를 방지. AVC 및 밸브 형성 동안 셀 추적으로 심장의 빠른 박동 어려운 전통적인 시간 경과 현미경5,6을 통해 셀을 따라 도전적 이다. 말 외., 20167에서 적응이 프로토콜 Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish 유전자 변형 라인, photoconvertible 단백질이 표시 됩니다를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 내 피 세포는 endocardium입니다. 약 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM)는 심장 박동, hpf, photoconverted EdCs 특정 발달 시간 점에서 고해상도 영상 36와 55 사이 EdCs의 정확한 photoconversion 수 있도록 일시적으로 중지 하는 데 사용 됩니다. 그것은 이전 보였다 EdCs photoconverted이이 메서드를 사용 하 여 photoconversion7시간 후에 5 일 이상 그들의 비전향된 이웃에서 구별할 수 유지 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoconverted EdCs 48 보다 어린 배아에서의 이미지 분석에 사용 되는 방법 내용을 hpf, 성공적으로 AVC 개발 (Boselli 외., 언론에서)9동안 조직의 움직임을 수행 하는 데 사용 되었습니다. 우리는 독자 것입니다 찾을 바랍니다이 프로토콜 유용한 AVC 및 밸브 개발 정상적인 배아, 그리고 돌연변이, morphants, 또는 약물 치료 배아 연구. Zebrafish 개발 하는 동안 photoconvertible 단백질을 사용 하 여 셀 추적에 관련 된 보다 일반적인 프로토콜 롬 바르도 외., 201210에 의해 문서를 참조 하십시오.

<table><tbody><tr><td>재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>물고기를 기르고 알을 모으는 데 필요한 장비(자세한 내용은 Zebrafish Book22 참조).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>정립 컨포칼 현미경(488nm, 561nm 및 405nm에서 작동하는 레이저, 조정 가능한 다광자 레이저 및 Leica HCX IRAPO L, 25 &times;, N.A. 0.95 대물렌즈 장착)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Heat</td><td>block ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm 조직 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Petri 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>금형</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력한>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL 트리카인 재고 용액&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM 원액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 저융점 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-페닐-2-티오우레아)</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>배아 배지: 30x 원액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력한>소프트웨어</ </td> 이미지 분석, 곡선 피팅, 바이오 형식 도구 상자 MathWorks8 mg/mL 트리카인 원액200 mg 트리카인 분말(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설폰산)이 장착된 strong><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Matlab Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 25 mL Danieau <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 7로 조정하고 부분 표본을 추출하여 -20°C에서 보관하십시오. 씨&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM 원액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>부분 표본 및 -20°°C에서 보관 C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium: 30x 스톡 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50.7 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0.78 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1.47 g 마그네슘 설페이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2.1g 칼슘 아질산염 사수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19.52g HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>pH 7.2로 조정하고 실온</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>곰팡이< / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasCLEAR 수지</td><td>에 보관하십시오.아시가</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플러스 39&nbsp; 자유형 Pico 3D 프린터</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish 태아에 있는 세포 photoconversion 통해 다음 endocardial 조직 움직임

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Embryogenesis, 동안 셀 셀 행동의 동적 변화를 받아야 하 고 개발 생물학의 분야에서 근본적인 목표는 이러한 변화 뒤에 세포 논리를 해독 합니다. Photoconvertible 단백질의 개발과 발견은 크게 주 었 이러한 동적 변화에 대 한 우리의 이해 광학 세포와 조직을 강조 하는 방법을 제공 하 여. 그러나, 동안 photoconversion, 시간 경과 현미경 및 후속 이미지 분석 뇌 또는 눈 등 장기 잠복 세포 역학에 매우 성공적인 것으로 입증 되었습니다,이 방법은 일반적으로 사용 하지 않습니다로 인해 개발에 심장 주기 동안 심장의 빠른 움직임으로 인 한 과제. 이 프로토콜은 두 부분으로 구성 됩니다. 첫 번째 부분에서는 photoconverting 및 이후 zebrafish 것 운하 (AVC)와 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀 (EdCs)를 추적 하는 방법을 설명 합니다. 방법은 일시적으로 마음 자리를 정확 하 게 photoconversion에서 마약을 중지 포함 한다. 마음 다시 시작할 수 있습니다 약물 및 배아 개발의 제거에 따라 박동 EdCs 발달 시간 나중에 photoconverted의 고해상도 이미징 마음 다시 중지 될 때까지 정상적으로 계속. 프로토콜의 두 번째 부분에 2 차원 지도 3 차원 구조에서 형광 신호를 매핑하여 젊은 배아에서 AVC에서 photoconverted 또는 비 photoconverted 영역의 길이 계량 하는 이미지 분석 방법을 설명 합니다. . 함께, 프로토콜의 두 부분 기원 그리고 zebrafish AVC 및 것 심장 밸브, 구성 하 고 돌연변이, morphants, 또는으로 치료 배아 연구에 대 한 잠재적으로 적용할 수 있습니다. 있는 셀의 동작을 수 AVC 및 밸브 개발을 방해 하는 시 약

48에서 태아 photoconverted의 예로 hpf 80에서 다시 몇 군데와 hpf 영화 1 , 2, 그림 2에 표시 됩니다. 그들의 차동 색깔을 녹색 또는 그들의 빨간 양식으로 따라야 하는 셀의 동작을 사용 하면 형광등 빨간 형태, 그것의 형광 녹색 양식에서 단백질에서 변환 존중 레스터가 405 nm 빛에 노출 밸브 형성 동안 이웃입니다. 그것은 48 hpf AVC의 몇 photoconverted 셀 나중 확산 및 밸브 전단의 1 개의 측에 나중에 주로 살고 볼 수 있습니다.
그림 3에서 볼 수 photoconverting EdCs 안마당에는 심 실에서 후 36 hpf 배아에 설명 하는 이미지...

이 프로토콜에가 생활의 endocardial 세포에서 형광 단백질의 photoconversion에 대 한 방법을 설명 합니다 zebrafish 태아 것 운하 및 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀의 추적을 가능 하 게 .

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

이 절차의 전반적인 목표는 방실관과 심장 판막이 형성되는 동안 심내막 세포를 추적하는 것입니다. 이 방법은 심내막 세포가 다양한 유형의 돌연변이에서 어떻게 행동하는지 이해하는 것과 같은 심장 발달 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. AVC 및 판막 형성 중 세포를 추적하는 것은 심장의 빠른 박동 때문에 어렵습니다.기존의 타임 랩스 현미경을 통해 세포를 추적하기가 어렵습니다. 이 기술의 주요 장점은 이러한 어려움 중 일부를 우회한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Renee입니다.텍스트 프로토콜에 따라 금형을 만든 후 약 1.5ml의 용융된 1% 아가로스를 35mm 플라스틱 장착 접시에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 플라스틱 몰드를 액체 아가로스에 놓고 곰팡이와 아가로스 사이에 공기가 갇히지 않도록 주의하십시오. 아가로스가 굳을 때까지 접시를 섭씨 4도에 놓습니다.그런 다음 아가로스에서 플라스틱 곰팡이를 제거합니다. 다음으로, 미리 준비된 장착 매체 2ml를 장착 접시에 첨가하고 용액이 아가로스로 확산될 때까지 15-30분 동안 기다립니다. 그 동안 튜브를 섭씨 70도의 열 블록에 약 5분 동안 넣어 0.7%의 낮은 융점(LMP)인 1mL 분취액을 녹입니다.LMP를 위아래로 피펫팅하여 약간 식힙니다. 그런 다음 25마이크로리터의 밀리리터당 8밀리그램 트리카인과 40마이크로리터의 1몰 BDM 용액을 튜브에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.그런 다음 튜브를 섭씨 38도의 열 블록으로 옮겨 LMP 아가로스를 액체 상태로 유지합니다. 배아를 2ml의 장착 매체가 들어 있는 별도의 접시로 옮깁니다. 그런 다음 심장 박동이 멈추면 배아를 장착용 접시로 옮기고 집게를 사용하여 우물에 배열하여 25도 각도로 눕고 꼬리는 우물의 더 깊은 부분을 가리키고 노른자가 위를 향하도록 합니다.배아가 대략적으로 제자리에 놓이면 배지를 제거하고 트리카인과 BDM을 함유한 약 200마이크로리터의 0.7%LMP 아가로스에 배아를 삽입하십시오. 그런 다음 배아 위치를 다시 조정하고 필요에 따라 왼쪽이나 오른쪽으로 기울입니다. 움푹 들어간 사각형의 벽을 아래로 눌러 과도한 아가로즈가 장착 접시의 측면 영역으로 넘치도록 합니다.LMP 아가로스가 굳을 때까지 약 5분 정도 기다린 다음 접시에 장착 매체를 추가합니다. 이제 배아를 광으로 변환할 준비가 되었습니다. 광변환을 수행하려면 405, 488 및 561 나노미터 레이저 소스가 장착된 직립 컨포칼 현미경에서 투과된 백색광과 대물 렌즈를 사용하여 배아의 심장을 찾습니다.561나노미터 레이저를 사용하여 적색 Kaede 형광을 확인합니다. 그런 다음 488나노미터 레이저를 사용하여 심내막을 시각화합니다. 그런 다음 현미경 수집 소프트웨어에서 FRAP 모드로 들어갑니다.그런 다음 488 및 561 나노미터 레이저 모두에 대해 약 1%의 레이저 출력을 선택합니다. 관심 평면에 초점을 맞추면서 관심 영역 또는 ROI를 선택합니다. 그런 다음 25% 레이저 출력의 405나노미터 다이오드 레이저를 사용하여 셀을 광변환하고 ROI를 세 번 스캔합니다.ROI에서 Kaede가 충분하지 않은 경우 해당 영역에 대해 405나노미터 레이저를 다시 세 번 스캔합니다. 소프트웨어에서 TCS SP8 모드로 돌아가 양방향 모드에서 561 및 488 나노미터 레이저를 순차적으로 사용하여 Z 스택을 획득합니다. 광변환 후 유리 피펫을 사용하여 배아 머리 바로 위를 약간 눌러 LMP 아가로스를 끊습니다.그런 다음 배아를 부드럽게 빨아먹습니다. BDM이 함유된 배지를 씻어내려면 유리 피펫에서 배아를 PTU가 있는 배아 배지가 들어 있는 85mm 페트리 접시로 배출합니다. 배아를 PTU가 있는 배아 배지가 들어 있는 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.이 단계에서는 어떤 배아가 어느 배아에 들어가는지 기록해 두어야 하는데, 이는 이후 발달 단계에서 광변환된 세포의 위치를 연관시키는 데 필수적이므로 반드시 기록해야 합니다. 이제 배아가 BDM을 함유한 배지에서 제거되었으므로, 약 5분 후에 배아의 심장이 다시 뛰기 시작할 것이다. 배아를 섭씨 28.5도의 어두운 곳으로 되돌려 정상적으로 계속 발달할 수 있도록 합니다.원하는 단계에서 심장을 멈추고 배아를 다시 삽입하며, 이 비디오의 앞부분에서 보여준 것처럼 배아를 추적하기 위해 별도의 표시된 접시에 BDM으로 처리해야 한다는 중요한 차이점이 있습니다. 최대 62hpf의 배아의 경우 적색 및 녹색 형광 신호에 대해 각각 561 및 488 나노미터를 사용하여 심내막의 Z 스택을 획득합니다. 62hpf보다 오래된 배아의 경우 940나노미터로 설정된 다광자 레이저를 사용하여 488나노미터 레이저 대신 녹색 Kaede를 이미지화합니다.48hpf 미만의 배아의 경우 분석을 위해 3차원 AVC를 2차원 이미지에 투영할 수 있습니다. 먼저 이미지의 임계값을 설정합니다. 그런 다음 심장 바깥쪽에 있는 점을 지웁니다.수동 분할을 수행하려면 오른쪽의 이미지와 일치하도록 왼쪽의 이미지 방향을 지정합니다. 주황색 벡터가 통과하는 하트의 측면을 분할하고 파란색 벡터 방향에 점을 추가합니다. 다음으로, 단면을 보간하고 색상 강도를 표면에 투영합니다.마지막으로 AVC의 방향을 조정하고 2D 표면에 투영합니다. 48 hpf에서 광변환 직후의 배아 심장의 예가 여기에 나와 있습니다. AVC의 상측의 여러 세포에 있는 세포질 Kaede는 녹색에서 빨간색으로 전환되었습니다.80hpf의 동일한 배아에서 광변환된 세포가 증식하여 상방실 판막의 안쪽으로 이동한 것이 분명합니다. 심방과 심실의 EdC가 광변환된 36hpf 배아의 예가 여기에 나와 있습니다. 그런 다음 AVC는 더 쉬운 시각화 및 분석을 위해 2차원으로 투영되며 두 광변환된 영역 사이의 거리를 정량화할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 정상적인 발달에 영향을 미치지 않도록 심장이 멈추는 시간을 최소한으로 유지하는 것이 중요합니다. 연습을 통해 모든 것이 미리 준비되어 있다면 약 30분 이내에 사진 변환을 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 제브라피시 배아에서 광변환 후 심내막 세포를 추적하고 데이터 세트를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

zebrafish 배아 심장의 immunostaining를 수행하는 빠른 방법이 설명되어 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 접근 방식에 비해,이 방법은 크게 크게 감소 처리 시간 이내에 심장에 세포 / subcellular 구조를 공개 고해상도 이미지를 얻는 수있는 항체의 침투를 증가시킵니다.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

본 연구에서는 살아있는 제브라피시 배아 내에서 광전환형 형광 단백질(PCFPs)의 광활성화 스위칭 방법과, 발달 과정 중 특정 시점에서 광전환된 단백질을 추적하는 방법을 제시합니다. 이 방법론을 통해 살아있는 척추동물 유기체 내에서 다양한 발달 과정의 근간이 되는 세포 생물학적 사건들을 모니터링할 수 있습니다.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

여기, 우리가 어떻게 셀 photoconversion 형광 단백질, Eos, 살아있는 동물을 표현 하는 특정 영역에 자외선 노출을 통해 이루어집니다 보여 프로토콜 제시.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

여기, 선물이 시각화 4 차원 (4d)에서 zebrafish에 마음을 개발 하는 프로토콜. 빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)를 통해 4 차원 영상, 3 차원 (3 차원) 이미지 개발 마음을 재구성 하는 시간 걸립니다. 우리 그 전단 응력 활성화 endocardial 노치 신호 챔버 개발, 심장 trabeculation를 승진 시키는 동안 질적 및 양적 보여줍니다.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

우리는 빛 시트 형광 현미경 검사법과 생체 내 제브라피시 심장을 연구하는 최적화 된 도구를 설명합니다. 특히, 우리는 밝은 심장 형질 전환선을 제안하고 발달과 심장 결함을 피하는 새로운 부드러운 임베드 및 고정 기술을 제시합니다. 심장 이미징에 적응된 가능한 데이터 수집 및 분석 파이프라인도 제공됩니다.

얼룩말 물고기 배아에서 빠른 심장 역학의 빛 시트 현미경 검사

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아의 심장 형태 및 기능을 평가하기 위한 저비용 광학 현미경 방법을 설명하여 고급 이미징 시스템 없이도 발달 심장 독성을 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

표준 현미경 및 비디오 분석을 사용한 제브라피쉬 배아의 기능적 심장 영상: 환경 및 생물 의학 연구에서의 응용

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

학습하세요 Kaede 형광단백질 광전환을 이용하여 살아있는 zebrafish 태아의 심내막 세포를 추적하는 방법을. 이 기술은 심장판막 형성 과정에서 세포 이동을 실시간으로 관찰할 수 있게 합니다.

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

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