Name: 꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 배우세요 꼬마 선 충에서 rec-8 RNAi를 이용한 안정적인 사배체 및 삼배체 생성 방법입니다. 이 기술은 전체 게놈 배수성 조작이 유전자 용량, 생물학적 스케일링 및 종 분화 메커니즘에 미치는 영향을 연구하는 데 필수적입니다.

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긴장에 감사 꼬마 유전학 센터 (건강의 국가 학회 (NIH) 사무실의 연구 인프라 프로그램 P40 OD010440에 의해 자금) 하 고. 저자 뱁 티 스 트 Roelens 및 Eli Lessman, 건설적인 의견 및 마 노 연구소 CCNY, 촬영의 일부에 대 한 그리고 그들의 도움에 대 한 그들의 실험실의 사용을 위한 CUNY에서 제공 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 PSC CUNY 수상 TRADB-46-113에 의해 지원 되 고 NIH 부여 1SC2GM118275-01. 석사 박사 건강 (CIHR) 친교의 캐나다 학회에 의해 부분적으로 지원 되었다 그리고 E.K. NIH/NIGMS 상승에 의해 지원 되었다 GM062981를 부여.

1. 설정 rec-8 RNAi ( 그림 2의 일 1-3)
이 프로토콜은 Kamath 및 Ahringer30에서 수정 됩니다.
<ol><li>대장균에 rec-8 dsRNA 식의 유도, 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 천 격판덮개31 1mm 이소프로필-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG)와 100 µ g/mL의 최종 농도와 보완을 준비합니다 암 피 실린입니다. 사용, 최대 4 주까지 4 ° C에서 어둠 속에 저장 합니다.</li>
	<li>100 µ g/mL 암 피 실린과 50 µ g/mL 항생물질 보충 Luria 국물 (파운드) 접시에 Ahringer 연구소 도서관30 rec-8 클론에서 rec-8 (W02A2.6) 복제를 들고 행진 HT115 박테리아. 37 ° c.에 통에 하룻밤 성장</li>
	<li>주 1 4 mL 파운드 포함 100 µ g/mL 암 피 실린 및 50 µ g/mL 항생물질으로 rec-8 RNAi 클론을 들고 HT115 대장균 박테리아의 갓 질주 된 단일 식민지에서 단일 식민지 접종. 성장 통 또는 37 ° c.에 롤러 드럼에 하룻밤 박테리아 문화</li>
	<li>다음날 아침 (주 2), 두 배 배가 좌초 하는 (ds) RNA 1mm IPTG의 최종 농도 추가 하 고 37 ° c.에 40 분 동안 흔들어 여 HT115 세균성 문화에 rec-8 W02A2.6의 생산을 유도</li>
	<li>유도 후 NGM/IPTG 접시 HT115 rec-8 박테리아의 100-200 µ L 씨 하 고 어두운 하룻밤 (3 일)에 실 온에서 접시를 저장.</li>
	<li>다음날 아침 (4 일), 단계 2.1 아래에 설명 된 대로 유도 HT115 rec-8 박테리아 접시에 원하는 선 충 스트레인을 추가 합니다.</li>
</ol>2. 생성 하 고 Tetraploids ( 그림 2에서 4-16 주) 분리
<ol><li>하루 4, L4 (4 애벌레) 단계 광고에 나온 것 NMG/IPTG 접시에 원하는 2 중 긴장의 하루 전에 유발 했다 HT115 rec-8 박테리아와 시드 3-4 영 장소 (위에 1.5, 단계). 어둠 속에서 15 ° C에서 선 충을 성장.</li>
	<li>3 일 전에 해당 단계에서 첫 번째 자손 (F1s) L4s 될 것입니다 1.3과 1.4 단계 2.1, 후에 3 일을 시작 단계 반복 합니다. 이 단계의 타이밍 15 ° c.에 얼마나 빨리 선 충 스트레인 성장에 따라 달라 집니다. 일부 2 중 돌연변이 체 긴장은 느린 재배 자, 그리고이 타이밍 잘 필요 tetraploids을 분리 하려면.</li>
	<li>( Rec-8 RNAi 먹이 치료의 4 일) 후 8 일, 20 (2 광고에 나온 것/페 트리 접시)는 F1 (첫 번째 자식 세대) L4 광고에 나온 것 갓 유도 HT115 rec-8 RNAi에 HT115 rec-8 박테리아에서의 전송 및 허용 그들 self-fertilize입니다.<ol>
<li>또는,에 HT115 rec-8 박테리아에서 갓 재배는 F1 L4 광고에 나온 것의 전송 20 HT115 rec-8 RNAi 박테리아 같은 스트레인 (2 광고에 나온 것 4-6 남성/플레이트)의 치료 남성 함께 유도.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하루 13, 시작 나타나는 긴 자손 F2 (2 자식 세대)에 대 한 심사 (Lon)에 전체 보다 크거나 야생 유형; 다음 대장균 박테리아의 일반적인 OP50 또는 HB101 변종에 개별 론 동물 전송. 계속 심사 F3 (3 자식) 자손; 그러나, 동일한 접시에서 F3 자손 이라고 할 수 없다 독립 긴장 그들이 설립 될 경우, 그들은 수 있기 때문에 같은 형제 이미 F2 어머니를 설립. 참고: 그들은 명확 하 게 diploids 이상 때문에 상 상속 tetraploids 식별 쉽게 됩니다. 야생 타입 광고에 나온 것은 tetraploids 보다 짧은 3 분의 2. 그것은 더 이상, 때문에 tetraploid 몸 만드는 여분의 차례 꼬리 (그림 3A) 머리에서 정현파 몸 절곡 파도 생성 하 여 앞으로 이동.</li>
	<li>Self-fertilize 하 론 자손만 rec-8 RNAi 치료의 부재에 낼지는 론 자손을 선택 하 여 전파 론 웜 수 있습니다. 이 2 ~ 3 추가 세대를 걸릴 수 있습니다. 론 벌레는 자주 살 균 하 고 자손을 생성 하지 않습니다.</li>
</ol>3. 확인 Tetraploid 긴장 (영화 1와 그림 3A, B)
참고: Tetraploid 긴장 그들의 unfertilized oocytes에서 염색체의 수를 계산 하 여 유효성 수 있습니다. 형광 현미경 검사 법을 사용할 수 있는 경우 변형 염색체에 대 한 형광 성 감 적 (meiotic 사단), 이전 unfertilized 2 중 oocytes에서 염색체 쌍의 수에 대 한 화면. 염색체 형광 표식 부재, tetraploid nematodes 선 충 및 DNA 염료;와 얼룩에 의해 상영 수 있습니다. 에탄올 및 전체 동물 4 '에 대 한 프로토콜에 대 한 아래 참조 6-Diamidine-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) 얼룩.
<ol><li>전체 동물 DAPI 얼룩 참고: 12 연결 된 염색체 쌍을 들고 Tetraploid 긴장 DAPI 이러한 동물을 얼룩이 지 고는 unfertilized oocytes에 DAPI 시체의 수를 계산 하 여 유효성 수 있습니다.<ol>
<li>현미경 슬라이드에 M9 버퍼31 10 µ L 장소 5 다음 드롭 6-10 선 충을 전송.</li>
		<li>해 현미경 보풀 청소 조직으로 선 충을 제거 하지 않고 사용에서 M9의 대부분을 그립니다. 그런 다음, 즉시 벌레에 90% 에탄올의 10 µ L 드롭 추가. 몇 초 보다는 더 이상 벌레 완전 하 게, 하지만 대 한 건조를 허용 합니다.</li>
		<li>최대한 빨리 에탄올 증발 (이 볼 수 있습니다 해 현미경 발생), 90% 에탄올 벌레에의 한 추가 10 µ L을 추가.</li>
		<li>3.1.3 단계 세 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>일단 마지막 한 방울까지 에탄올의 증발 했다, 선택 (예를 들어 m 9에 2 ng / µ L DAPI 재고 농도의 1:1,000 희석)의 설치 미디어에서 권장된 하는 최종 농도에 DAPI 또는 Hoechst 염료의 6 µ L를 추가 합니다. 슬라이드의 장기 저장을 위한 0.5 %p-phenylenediamine M9, 대신 20 mm Tris HCl, pH 8.8, antifade 솔루션으로 90% 글리세롤에 녹을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>coverslip로 슬라이드에 벌레를 커버 하 고 매니큐어와 coverslip의 가장자리를 밀봉. 형광 현미경 (단계 3.1.7) 점수는 coverslip 추가한 후 적어도 10 분. Antifade 없이 슬라이드 전에 득점, 4 ° C에서 몇 일 동안 저장 될 수 있다 하지만 형광의 품질 몇 일 후 감소 하기 시작 합니다.</li>
		<li>바로 옆에 spermatheca 이며는 spermatheca 아직 입력 하지 않은 가장 성숙한 unfertilized oocyte에서 단일 DAPI 시체 (아마도 단일 염색체 쌍)의 수를 점수 100 배 확대에 형광 현미경을 사용 하 여 또는 자 궁입니다.<ol>
<li>점수는 oocyte의 핵 내에서 개별 DAPI 시체, 현미경의 정밀한 초점을 사용 하 여 천천히 oocyte 핵의 위쪽에서 아래쪽으로 계산 하는 동안. 그런 다음, DAPI 시체의 계산된 수를 확인 하는 반대 방향으로 (즉, 핵의 맨 아래에서)에 포커스를 이동 하는 동안 동일한 핵 재검표.</li>
		</ol>
</li>
		<li>가장 성숙한 unfertilized oocyte 안정적 Lon 스트레인 당 적어도 10 광고에 나온 것에 2 개의 생식 기의 각 점수. 야생 타입 oocytes 6 DAPI 시체 평균, 5 autosome 쌍과 성 염색체 쌍에 있다. 안정적인 론 종자는 oocyte에서 12 DAPI 시체의 존재 나타냅니다이 긴장에 동물 부분 (4 세트 Autosomes, 3 X-chromosomes의) 또는 (4 세트 Autosomes, 4 X-chromosomes) tetraploids.</li>
		<li>DAPI 시체 스트레인 당 여러 개의 (10) oocytes에서 관찰의 평균 수를 계산 합니다. 일부 염색체 쌍을 감동 것입니다 또는 오른쪽에 하나의 또 다른, 그래서 DAPI 수는 oocyte에서 시체의 상단은 종종 염색체 쌍의 실제 번호 보다 작습니다.</li>
		<li>(선택 사항) 더 안정적인 론 긴장 DAPI 시체의 평균 수는 전체 (4A, 4 X) 인지 부분 (4A, 3 X) 여부를 테스트 하려면 12 확인 tetraploids 면역 형광 검사 HTP-332같은 염색체 축 단백질에 대 한 얼룩에 의해. 이 얼룩 부분 tetraploid에 단일 연결 되지 않은 염색체에서 십자형 패턴을 보여주는 염색체 쌍 구분 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

단일 (n) gametes의 생산에서 수정 (2n) 2 중 접합 자 생성에 열쇠 이다. 게놈의이 감소는 단일 게놈 복제 후 2 연속 셀 구역으로 감수 분열 동안 수행 됩니다. 단일 생성 하 gametes, C. 선 충, 대부분 다른 metazoans와 마찬가지로 분리 1 부에 임산부 및 paternally-파생 homologs 반면 각 체에서 chromatids 2 부에 분리 하는 여동생. 그 전체 게놈 polyploidy 자연에서 발생 하는 방법 하나는 감수 분열 동안에 그들의 절반 크기의 게놈을 실패 하는 gametes의 세대를 통해입니다.
그것은 잘 알려져 있다 50 년 이상 그 tetraploid C. 선 충 선 충은 실용적이 고 비옥한. Nigon23, 그리고 이후 Madl와 허먼22, 생성 meiotic 염색체 분리를 방해 하 여 선 충 C. tetraploids의 소수를 식별 열 충격 처리를 사용 하 고 각각 유전자 표시를 사용 하 여. 단일 추가 C. briggsae tetraploid 스트레인 30 년 이상이 프로토콜을 사용 하 여 파생 된 이후24. 이러한 tetraploids 어떻게 C. 선 충 결정 될 남성 또는 자웅 동체, ploidy 성장 및 크기를 조절 하는 방법 하 고 페어링 및 감수 분열25,26, 에서 synapsis 분석 조사를 이용 하였다 38 , 39 , 40. 아직 이들과 특정 tetraploids 또는 triploid 종자의 사용을 필요로 하는 다른 연구가 메서드에서 tetraploid 종자 생성에 어려움에 의해 제한 되었다.
여기에 설명 된 프로토콜 통해 안정적인 전체 4A, 4 X 세대 및 부분 4A, 3 X tetraploid 꼬마 선 충 종자에서 2 중 유전 배경 초기 또는 karyotype 유전자 표시의 사용 없이.
Tetraploidy C. 선 충에 메커니즘 중 하나 이상에 의해 발생할 수 있습니다.
Madl와 허먼은 생성 가능성이 tetraploid 긴장 triploid 중간 상태에서 파생 된 제안 했다. 그들의 긴장은 여러 세대에 걸쳐 또는 상 상속 triploid 2 중 남성22중간을 횡단 하 여 선택을 통해 얻은 했다. Rec-8 돌연변이에 준다 오 2 중 oocytes와 정자를 분할 하는 염색체에 결함 tetraploid 동물 rec-8 RNAi 체계27발생할 수 있는 다른 가능한 메커니즘을 제안 합니다.
rec-8 RNAi 대우 광고에 나온 것은 2 중 oocytes 및 수정 시 tetraploid 동물을 야기할 것 이라고 spermatocytes 생산할 수 있습니다. 이 가능성과 일치 하는 복제 f 2 광고에 나온 것 중 일부 상승 했다 안정적인 론 계통에 제안 그 다음 세대에는 복제 론 F2 광고에 나온 것 하는 사실 이다 이미 tetraploid 어디. 횡단 계획에서 rec-8 RNAi 대우 광고에 나온 것의 1 세대 치료 남성으로 건 넜 다. 2 중 spermatocytes 수 여전히 남성 십자가 rec-8 dsRNA를 표현 하는 박테리아의 존재 하 고 따라서, 남성에 노출 되는 rec-8 RNAi 적어도 3 일 동안 짝짓기 하는 동안 때문에 발생 합니다. 따라서, cross-fertilizing 체계에 론 polyploids 수 또한 2 중 oocytes의 수정에서이 2 중 정자 형성 했습니다. 안정적인 tetraploid 긴장 사이 2 중 gametes 중 수정 또는 변수 ploidy의 oocytes를 포함 하는 단일 정자를 생산 하는 2 중 동물과 triploid 동물 크로 싱에서 발생할 수 있습니다.
중요 한 고려 사항:
자기-십자가 구조 대:
자체 기름 rec-8 RNAi의 계획 f 1 광고에 나온 것을 취급 하 고 치료 남성과 두 광고에 나온 치료 것의 교차점을 포함 하는 계획이 4A, 4 배 상승 했다 및 4A, 3 X tetraploid 긴장. 더 많은 polyploids 처음 자체 기름 체계에서 고립 되었다, 비록 더 이다 동물의 살 균 되었고 따라서 두 구성표는 마찬가지로 tetraploid 안정적인 종자 생산에 효율적. 증가 성공 자체 기름 체계에 불 임에 대 한 이유를 알 수 없는 남아 있습니다. 두 구성표는 마찬가지로 효율적인, 자체 기름 체계가 쉽습니다 짝짓기에 대 한 남성의 격리를 필요로 하지 않습니다. 또한, 관심의 변형 비효율적 이거나 짝짓기에 결함이 있는 경우 자체 기름 체계는 것이 좋습니다 것입니다. Cross-fertilizing 체계는 단일 염색체의 두 개 이상의 버전을 포함 하는 복잡 한 tetraploids를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
수정 및 제한:
현재,이 프로토콜 rec-8 유전자에 대 한 dsRNA를 표현 하는 박테리아를 먹이로 rec-8 RNAi 치료를 포함 한다. 따라서, 먹이, 또는 조직41,,4243사이 RNAi의 환경 또는 조직 확산에 결함이 있는 돌연변이이 프로토콜 꼬마 종 RNAi 응답에서 작동 하지 않습니다. 이 문제는 생식에 직접 관심의 dsRNA의 직접 주입 RNAi 치료를 도입 하 여 잠재적으로 해결 될 수 있습니다.
이 제도 안정적인 triploid 종자44,45를 생성 하지 않습니다 때문에 그것은 파생 된, 2 중 동물에 게는 tetraploid로 triploid 동물을 생성 되어야 합니다. 계란의 15%만 물려받은 triploids 해치에 의해 그리고 그들의 자손은 주로 메 마른 자손 이수성 때문. 또한, 몇 살아남은 비옥한 자손 세대 이내 완료 또는 diploids 근처 하 경향이 있다. 이것은 아마, 적어도 부분, oocytes는 부분적으로 첫 번째 meiotic 부문에 북극 몸으로 세 번째 염색체를 분리 하 여 trisomy를 수정 하기 때문에.
이 프로토콜의 insuperable 한계는 그것 때문에 그들은 RNAi 치료46에 저항력이 RNAi 기계의 구성 요소에 영향을 주는 돌연변이의 tetraploids을 만들기 위한 작동 하지 않습니다 이다.
문제 해결:
rec-8 RNAi.
몇 가지 고려 사항은 성공 하려면이 프로토콜에 대 한 중요 한입니다. 첫 번째 rec-8 dsRNA 생산 rec-8 (W02A2.6) 복제를 들고 박테리아 HT115 박테리아에서의 유도 대 한 신선한 IPTG와 갓 만든된 IPTG NMG 플레이트를 사용 하는. IPTG는 빛에 민감한 고 번호판에 빛 노출을 줄이기 위해 하는 것이 중요 하다. IPTG 접시 어둠 속에서 4 ° C에서 한 달에 저장할 수 있습니다. 둘째, rec-8 (W02A2.6) RNAi 세균 HT115 변종 (Kamath 및 Ahringer 2003) Ahringer 라이브러리에서 다른 사용 가능한 rec-8 보다 더 강한 rec-8 형 HT115 클론을 얻지 못했다.
Tetraploid 스트레인 유지 보수:
Tetraploid 긴장 매우 느리게 성장 하 고 세대47당 최대 50 progenies 생산. 모든 확인 된 tetraploid 긴장은 상대적으로 안정적인, 하지만 그들은 무 너 뜨 리 수 있는 2 중 때 스트레스 (조나단 Hodgkin 개인 통신 및 우리의 되지 않은 관찰) 되 고. 따라서, 그것은 tetraploid 긴장 굶 어, 열 충격, 25 ° C에서 재배 하거나 냉동 고 녹여, 그들은 신속 하 게 되돌릴 수 diploidy, 그래서 계속 이러한 긴장을 녹이는 때 론 동물을 선택 하는 것이 중요 하다 또는 때 주의 하는 것이 중요 복귀 하도록 발생할 수 있습니다 스트레스 조건 이러한 긴장을 노출 합니다.
가능한 응용 프로그램:
효과의 조사 또는 전체 게놈 진화, 세포 주기, 유전자 발현 및 다세포 유기 체에서 개발 polyploidization의 역할 사이의 비교에 의존 하고있다: 다른 ploidy, 같은 셀을 포함 하는 유기 체에서 세포 형식에 밀접 하 게 관련 다른 ploidy와 종 또는 받은 진화론 최근 polyploidization 이벤트와 물리적으로 격리3,,56,7,8 종 ,11,18,19,20,,4849,50. Tetraploids 제 브라와 마우스 모델 시스템에서 파생 될 수 있다, 그들의 자손은 멸 균 또는 embryonically 치명적인16,17. 또한, 이러한 모델 시스템 C. 선 충 에 비해 긴 수명 주기 있고 사용할 수 있는 방법 이다 동물을 생성 하는 복잡 하 고 비효율적인. 따라서, C. 선 충 종자가 메서드에서 파생 효과 및 전체 게놈 다세포 생물에서 polyploidy의 역할에 어떤 조사를 발전에 대 한 수단이 될 것입니다.
Diploids, triploids, 및 게놈의 사본의 수만 다른 tetraploids 비교 독특하고 전례 없는 기회를를 제공 합니다 이후는 triploid 원래 2 중에 tetraploid 건너는 tetraploid에서 파생 될 수 있다, 다른 게놈 크기 (또는 유전자 복용량) 해당 동물/장기/셀을 평가 합니다. 유연성과 쉽게 여기에 설명 된 계획의 다른 유전자 2 중 배경 또는 karyotypes 수십 tetraploid 종자의 생성을 허용 했다. 이러한 긴장의 일부 이미 쿼리 메커니즘 synapsis 동종 염색체 쌍의 감수 분열27동안 사용 되었다.
형광 마커를 들고 야생 유형 및 돌연변이 tetraploid 긴장의 스케일링, 전체 게놈 세포내/휴대/기관 및 전체 동물에 게놈 크기와 핵/cytosol 비율 간의 관계를 이해 하는 새로운도 제공할 것입니다. 적응, 종 분화, 유전자 복용량 및 표현과 조직 및 장기 개발에 polyploidization. 생물 학적 스케일링의 연구 뿐만 아니라 tetraploid 긴장의 세대 것 이다 크게 더 근본적인 생물학 질문 extracellular 신호, 게놈 불안정성, endoreduplication, 전체 게놈 관련 쿼리 복제, 유전자 노출량, 스트레스, 약물, 그리고 종 형성 메커니즘을 개발에 적응.

전체 게놈 polyploidy 자연에 걸쳐 존재 하 고는 종종 적응, 종 형성, organogenesis, 상처 치유, 및 생물 학적 스케일링;에서 필요한 단계 그것은 또한 암 및 저항 마약1,2,3,,45,6,7,8, 에 알려져 9 , 10 , 11 , 12. 농업 및 어업 산업 생성 이다 식물, 생선, 그리고 조개 화학 치료 (예를 들어, 콜 히 친 고 orzalin) 빠른 성장 속도 및 bulkier 작물과 가축13, , 14,15. Tetraploids의 실험 및 비효율적인 생산 마우스와 zebrafish 모델 시스템16,17에 대 한 존재합니다. 그러나, 대부분의 또는 모든 이다 다세포 동물 생성 embryonically 치명적인 또는 살 균 및 따라서 다세포 생물에서 polyploidy의 효과 대 한 실험실 연구에 대 한 좋지 않은 있습니다. 따라서, 다세포 생물에 전체 게놈 polyploidization의 어떤 이해 제한 되었습니다 밀접 하 게 관련 종 진화 최근 polyploidization 이벤트18,19,20 . 생물학 역할의 쿼리 또는 polyploidization의 결과를 경로 C. 선 충 모델 시스템의 사용 이다. 중요 한 것은, C. 선 충 은 일반적으로 존재 하는 2 중으로, 5 autosomes (A) 그리고 게놈 당 1 개의 성 염색체 (X)를 포함, vivo에서 생물 학적 과정의 관찰에 대 한 투명 한 수 세공 유전자 시스템 및 (성적으로 성숙한 성인에 게 계란)에서 3-4 일의 짧은 라이프 사이클 있다. C. 선 충 전체 게놈 자연에서 polyploidy의 가장 일반적인 유형인 tetraploid로 재현할 수 표시 되었습니다. Triploid 동물 diploids와 함께 tetraploids로 생성 될 수 있습니다 하지만 그들의 ploidy 안정적 이며 긴장 될 몇 세대 내 2 중.
지난 몇 십년에 한 줌의 실용적이 고 비옥한 C. 선 충 tetraploids 긴장 고립 되었다 실험실에서 힘 드는 이며 제한 된 유형의 긴장21,22, 를 생성 하는 전략을 사용 하 여 23.이 전략 C. 선 충 tetraploids 여 생성 열 충격 처리는 아마도 유전자 표시를 사용 하 여 상 상속 이다 동물에 대 한 심사 뒤 gametes에서 염색체 분리에 영향을 줍니다. 이 tetraploids이 선 충이 류 남성 또는 자웅 동체 될 것인지를 결정 하는 방법의 문의에 매우 유용 했다. 나중 연구 조사, 유전자 복용량, 성장과이 선 충21,,2425,26감수 분열 동안 synapsis의 규정을 사용할 수 있는 긴장을 사용. 불행 하 게도, 이러한 연구는 새로운 tetraploid 긴장과 배경 유전자 표시 포함 된 이러한 변종 생성 어려움에 의해 제한 되었다. 여기에 표시 된 감수 분열27동안 synapsis의 규칙을 공부 하는 긴장을 생성 하는 데 사용 되었습니다는 안정적인 tetraploids, 생성 하 간단 하 고 빠른 프로토콜이입니다.
자연에서 polyploidization 단일 gametes 대신 2 중의 형성에 의해 발생할 수 있습니다. 감수 분열-특정 cohesin 구성 요소 돌연변이 rec-8 2 중 정자 생성 및 oocytes 표시 rec-8 유전자를 노크 하는 우리의 찾는 tetraploid 자손 (그림 1)27의 생산 귀 착될 것입니다. , 2829. 노크 rec-8 phenocopy rec-8 순서로 2 세대에 대 한 RNA 간섭 (RNAi)에 의해 2 중 gametes 돌연변이 포함 됩니다 단순히 tetraploid 긴장을 생성. 상 상속 polyploids 그들의 이상으로 쉽게 식별할 수 있습니다 정상적인 신체 크기 보다. Polyploids는 일단 안정적인 라인 설립 핵 당 염색체의 수를 계산 하 여 전체 또는 일부 tetraploids로 확인 됩니다.
여기에 설명 된 전략 초기 2 중 유전 배경 또는 karyotype 유전자 표시의 사용 없이 안정적인 tetraploid 꼬마 선 충 종자의 생성 수 있습니다. 이 프로토콜 더 다재 다능 한, 효율적이 고 이전에 사용 하는 제도 보다 간단한 이기 때문에, 그것은 개발, 게놈 안정성 및 다세포에 진화의 기본적인 과정에 polyploidization의 역할을 쿼리 하는 데 필요한 도구를 확장 됩니다. 유기 체입니다. 이 프로토콜의 사용에만 예측 가능한 한계 유전 배경 RNAi를 저항에 이다.

<table><tbody><tr><td>해부 현미경</td><td>모션 현미경</td><td>SMZ171</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>NGM 한천 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60mm x 15mm 페트리 접시, 멸균</td><td>Tritech 연구</td><td>T3305</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 15mm 페트리 접시, 멸균</td><td>Tritech Research</td><td>T3500</td><td></td></tr><tr><td>세균 한천, 5kg</td><td>VWR</td><td>89140-850</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, 생명 공학 등급</td><td>VWR</td><td>97061-278</td><td></td></tr><tr><td>펩톤, BD Bacto</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 삼수화물</td><td>VWR</td><td>97062-300</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, 다이옥산이 없는</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Growth Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Lennox Broth</td><td>IBI Scientific</td><td>89126-176</td><td></td></tr><tr><td>이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>LB 한천 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 Lennox</td><td>IBI Scientific</td><td>89126-182</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td> 카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate</td><td>VWR</td><td>97062-300</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td> 카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrate</td><td>Biotium</td><td>40045</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호 </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ethanol Fixation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP</td><td>Koptec, VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>M9 완충액</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, 생명공학 등급</td><td>VWR</td><td>97061-278</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기성 무수 등급</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨, 일염기성 이수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC271750025</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>RNAi Clones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td><td>Source Bioscience</td><td>W02A2.6</td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td><td>Dharmacon</td><td>RCE1182-202299820</td><td></td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충 에 ploidy의 조작

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

개발 및 진화; 전체 게놈 polyploidy 놀이 중요 한 역할을 포함 하는 메커니즘 또한, tetraploid 세포의 비정상적인 생성은 암 진행 및 약물 저항의 개발 관련 된 되었습니다. 지금까지, 그것은 쉽게 주로 살 균 자손을 생성 하지 않고 다세포 동물의 ploidy 조작 가능 하지 않았습니다. 여기는 tetraploid 꼬마 선 충 을 생성 하기 위한 간단 하 고 빠른 프로토콜 제시 어떤 2 중 긴장에서 동물. 이 메서드를 사용 하면 궁극적으로 증가 ploidy C. 선 충에서 감수 분열 동안 염색체 분리에는 바이어스를 만들 수 있습니다. 이 전략의 rec-8 진 2 중 gametes를 생성 하는 식의 일시적 감소에 의존 합니다. Rec-8 돌연변이 잠재적으로 수정 시 tetraploids를 생산할 수 있는 2 중 gametes를 생성 합니다. 이러한 세공 구조는 돌연변이 염색체 재배열 페어링 및 synapsis 감수 분열에서 염색체 역학과 상호 작용에 대 한 통찰력을 얻기 위해 들고 tetraploid 긴장을 생성 하 사용 되었습니다. 이 방법은 유전자 표시 없이 안정적인 tetraploid 긴장을 생성 하기 위한 효율적인, 어떤 2 중 긴장에 적용 될 수 이며 triploid C. 선 충을 파생 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 간단한 메서드는 다른 근본적인 생물학 질문 게놈 불안정성, 유전자 노출량, 생물학 확장, extracellular 신호, 적응 스트레스, 약물, 저항의 개발 관련 조사 및 종 형성의 메커니즘입니다.

Rec-8 2 중 Gametes에 Meiotic Cohesin 구성 요소 함수 결과의 장애:
Cohesin 구성 요소 돌연변이 rec-8 의 meiotic 부분의 이미징 정자와 oocytes tetraploid 동물 (그림 1)27,,2933생성 가능한 메커니즘 밝혀. Mechanistically, rec-8 돌연변이 정자와 oocyte의 meiotic 부문 결함 다르다; 그러나, 둘 다 남성과 여성 2 중 gametes는 rec-8 돌연변이 의해 생산 됩니다.
야생 타입 감수 분열에서 상 동 염색체 일시적으로 크로스 오버 재결합에 의해 서로 연결 되 고 단위 또는 (그림 1A)가 첫 번째 meiotic 부문 입력34. 첫 번째 부분 동안 동종 염색체 (homologs) 분리, 서로 떨어진 반면 자매 각 체에 chromatids 2 부까지 함께 남아 있다. 비록 염색체 분리의 패턴은 여성 및 남성 gametes에 동일, oocyte 부서는 반면 spermatocyte 분할 대칭 이며 전문된 cytokinesis 받아야 비대칭. 각 부문에는 oocyte 작은 북극 몸으로 부문 제품의 절반을 삭제합니다. 따라서, 각 oocyte 전조는 단일 단일 oocyte와 두 극 시체 (그림 1B, C)35에 상승을 제공합니다. 반대로, 단일 spermatocyte 전조 2 개의 대칭 사단을 겪고 하 여 4 개의 기능 spermatids에 상승을 제공 합니다. 2 부는 잔여 시체에서 떨어져 싹 트는 4 개의 spermatids와 절정. 이 cytokinesis가입니다 특별 한 패턴 및 spermatids의 수 centrosomes36에 의해 결정 됩니다.
Rec-8 돌연변이 gametes에 전조에서 상 동 염색체 사이 크로스 오버 재결합 일어나지 않는다 하 고 homologs로가 첫 번째 meiotic 부문29,34의 시작 부분에 연결 되지 않은. 야생 타입 gametes에서와 마찬가지로 각 체의 자매 chromatids 1 부 2 부까지 함께 남아 대신에 서로에서 분리. 흥미롭게도, 2 부 중 rec-8 돌연변이 표현 형은 다른 남성과 여성 gametes에 oocytes 반면 spermatocytes 받아야 비교적 정상적인 cytokinesis (그림 1B- 는 cytokinesis을 실패 F) 27 , 28 , 29. 2 중 oocytes 두 번째 부문에서 그들은 염색체 분리 및 cytokinesis 실패 하기 때문에, 따라서 그들은 두 번째 극 시체 (그림 1B, C)을 돌출 하지 않습니다. Rec-8 germlines에 있는 spermatocytes spermatid 신진 또는 cytokinesis, 받을 하지만 종종 spermatids 2 중 spermatid 및 spermatid chromatin 부족에 한 염색체의 두 세트를 분리 (그림 1D- F)27. Rec-8 정자 부족 chromatin의 비율의 정량화는 그림 1 층에 표시 됩니다.
Rec-8 돌연변이에 여성 및 남성 2 중 gametes의 형성이 돌연변이 표현 형 잠재적으로 전체 게놈 tetraploid 긴장을 생성 하는 데 사용 될 수 제안 했다.
Tetraploid C. 선 충 종자의 생성:
모든 생성 된 tetraploid 긴장에 rec-8 유전자에 돌연변이의 존재는 뚜렷이 RNAi29,37여 rec-8 내려 노크 하 여 피할 수 있습니다. Rec-8 돌연변이 할29,37RNAi rec-8 기능 감소 전체 게놈 tetraploid 동물, 잠재적으로 증가 줄 수 있는 2 중 gametes을 생성 것 이라고 가정 한다. 이 프로토콜에 필수적인 rec-8 돌연변이 2 중 gametes을 합리적으로 많은 젊은 aneuploid gametes와 치명적인 주로 살 균 또는 배아/애벌레를 다른 meiotic 뮤턴트 반대를 폐하입니다.
여러 tetraploid 긴장 ( 프로토콜, 그림 2및 표 1참조) 두 가지 전략 중 하나를 사용 하 여 rec-8 dsRNA를 표현 하는 선 충 C. 박테리아를 먹이로 생성 했다27. Tetraploids 자체 기름 광고에 나온 것으로 접시에 2 ~ 3 세대에 대 한 rec-8 dsRNA를 표현 하는 박테리아를 생성할 수 있습니다. 자웅 동체에 갓 배치는이 전략에 의해 만들어진된 rec-8 RNAi 접시와 그것의 자손 갓 유도 rec-8 RNAi 표현 박테리아 ( 프로토콜참조)와 함께 새로운 접시에 나중에 몇 일 전송 됩니다. 또한, tetraploids rec-8 dsRNA ( 를 표현 하는 박테리아와 rec-8 dsRNA 접시에서 동일한 유전자 형의 치료 남성을 표현 하는 박테리아를 먹이 광고에 나온 것의 1 세대를 건너 통해 생성 될 수 있습니다. 그림 2). 이 경우에, 십자가에서 남성에서에서 노출 됩니다 rec-8 RNAi 박테리아에 L4 단계 이후, 짝짓기 하는 동안. 두 구성표 tetraploid 동물27을 일으키 다. 표 1 은 여기에 제시 된 계획을 사용 하 여 얻은 tetraploid 종자를 보여준다. Triploid 및 tetraploid C. 선 충 보다는 더 큰 크기에서 diploids, 하지만 triploid 종자 불안정 tetraploid 긴장은 상대적으로 안정적인22,23반면 하나 또는 두 개의 세대 2 중 될 경향이 있다. 상 상속 tetraploid 종자는 원래 스트레인 (Lon) 광고에 나온 것만 론 자손 (그림 3A)를 물려받은 그 보다 더 큰 것으로 확인 되었다. 론 동물 쉽게 확인-야생 타입 2 중 동물 tetraploids의 길이의 2/3 고 그들의 시체 앞으로 정현파 움직임 (그림 3A) 동안 발견 될 수 있는 여분의 벤드를 만들지 않는다.
Tetraploid 종자는 tetraploid 광고에 나온 것 2 중 광고에 나온 것 (그림 3BC, 그리고 영화 1)의 oocytes에서 6 개의 염색체 쌍에 비해 oocytes에서 12 염색체 쌍의 존재에 대 한 심사에 의해 확인 되었다.
Tetraploid 클래스:
두 가지 유형의 tetraploid 광고에 나온 것이 확인 되었다: 하나의 물려받은 남성 2 중 광고에 나온 것, 다른 비슷한 주파수에서 물려받은 남성이 훨씬 더 높은 주파수 (표 1). 이러한 두 종류 tetraploid 광고에 나온 것의 비슷합니다 2 중 남성의 클래스 생성 주파수는 tetraploid 모든 염색체 (4A, 4 배), 대 한 남성의 생산 클래스 높은 주파수는 다 표시 되었습니다. 광고에 나온 것 autosomes 하지만 성 염색체 (4, 3 X)에 대 한 triploid tetraploid입니다. Tetraploids의 최신 클래스 안정 되며 4A, 3 X 광고에 나온 것과 4A, 2 X 남성 생산.
Tetraploid 긴장 느리게 성장 하 고 생산 감소 가만히 크기 이전 방법22,23생성 된 변종 처럼 그들은에서 파생 했다 diploids에 비해. 그러나 Madl와 허먼22 제안 tetraploid 긴장에서 죽은 태아의 증가 비율에는 oocyte 이수성 때문일 수 있었다,이 수가 상승 tetraploid 종자의 표면 검사 충분히 공개 하지 않았다 oocytes도 비정상적인 oocyte 또는 spermatocyte 사단 무리 크기 (영화 2및 그림 3C, D)에서 관찰 된 감소를 위한 계정.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig1.jpg"> 그림 1: rec-8 돌연변이에 Gametogenesis 의미 안정 이다 얼룩 생성 가능한 메커니즘. 야생 유형 및 rec-8 돌연변이 meiotic 부문에서 염색체 조직 및 분리 패턴의 (A) 도표. 야생 타입 감수 분열에서 상 동 염색체 첫 번째 meiotic 부문에서 분리합니다. 각 체에 자매 chromatids 동일한 스핀 들 극 쪽으로 방향을 설정 하 고 2 부까지 함께 남아. Rec-8 돌연변이, homologs 크로스, 형성 하지 않는다 고 따라서 연결 되지 않은. 반면에 야생 유형, rec-8 자매 chromatids 서로에서 방향 및 첫 번째 meiotic 부문에서 분리. 야생 유형 및 돌연변이 oocytes 여성 pronucleus 및 돌출된 극 시체 (남성 pronucleus 묘사 되지 않습니다)의 (B) 도표. 야생 타입 oocytes, 2 개의 비대칭 meiotic 사단 2 극 시체의 압출에 결과. 그러나 Rec-8 돌연변이에, 두 번째 극 몸 돌출 실패 2 중 oocyte에서 발생 합니다. (C) 야생 유형 및 rec-8 mCherry::histone H2B 표현 된 돌연변이 oocytes의 이미지. 화살표는 두 개의 북극 야생 타입 oocyte에서 몸과 rec-8 돌연변이에 하나를 나타냅니다. 눈금 막대는 5 µ m. (D 및 E) 라이브 이미지 야생 유형 및 rec-8 mCherry::histone H2B (마젠타) 표현 된 돌연변이 동물에서 spermatids의. 화살촉은 anucleate spermatids를 나타냅니다. 눈금 막대는 2 µ m. (D) Spermatocytes 야생 유형 및 rec-8 돌연변이에서 두 번째 (신진) 사단을 겪고. 야생 타입 spermatocytes 대칭 사단을 4 신진 spermatids, 각각 단일 염색체 보완 결과 받 다. Rec-8 돌연변이 spermatocytes, 염색체 분리 2 부에 손상 이다. 가장 자주 chromatin의 단일 질량 남아 잔여 몸 (RB) 또는 두 자매 중 두 번째 meiotic 부문에서 spermatids. 이 anucleate rec-8 돌연변이 정자 (화살촉으로 표시) 또는 2 중 정자에 상승을 제공 합니다. (E) 야생 유형 및 rec-8 돌연변이 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 시각에서 포스트 신진 spermatids의 라이브 이미지. 모든 야생 타입 spermatids 유사한 chromatid 대 중 있다. rec-8 돌연변이 spermatids anucleate 정자 형성. (F) 야생 유형 및 rec-8 돌연변이 anucleate 정자의 정량화. rec-8 돌연변이의 anucleate 정자에서 야생 타입 미만 1.6%에 비해 38.5% 생산. 피셔의 정확한 시험 rec-8 돌연변이의 anucleate (p ≤0.0001) 야생 타입에 비해 상당히 높은 발생률을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig2.jpg"> 그림 2: 생성 하 고 어떤 긴장에서 tetraploid C. 선 충 분리에 대 한 체계. 오른쪽에 화살표 프로토콜 하루 1에서 시작 하 고 하루 17에 진행의 타임 라인을 나타냅니다. 하루 9에 치료 되지 않는 남성에 게 교차점 광고에 나온 것으로 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 괄호는 시간 표시 막대에 단계의 묘사를 연결합니다. 치료 되지 않는 동물 오렌지, 치료 동물 들은 빨간색, 론 동물 크기에 더 큰, rec-8 dsRNA 박테리아 표현로 서 투명 한 붉은 배경 및 일반 OP50 박테리아 투명 판 투명 한 회색에 그려진 그려져 배경 접시입니다. 달리 명시 되지 않은 절차 15 ° C에서 이루어집니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig3v2.jpg"> 그림 3: Tetraploid 예. (A) tetraploid (MSC2) 동물 및 2 중 변형 (AV740)에서 파생 된 그것의 밝은 분야 심상. Tetraploid C. 선 충 보다는 2 중에 있는 전반적으로 크고 긴 (경도). 몸 크기에이 차이 이동 tetraploid 본문의 추가 사인 곡선 귀착되 고 tetraploid 파생 상품에 대 한 화면을 기준으로 사용할 수 있습니다. 눈금 막대는 0.1 m m. (B, C) 형광 이미지 (AV740) 2 중 및 tetraploid (MSC1) 가장 성숙한 unfertilized oocyte nulcei, meiotic 사업부 이전. 2 차 심사는 같이 영화 1 에서 Mcherry::H2B 및 GFP::β-Tubulin는 생식에 표현 MSC1 스트레인에 대 한 설립된 론 긴장의 unfertilized oocytes에서 염색체 쌍의 수를 관찰 하 여 수행 됩니다. 눈금 막대는 일반적으로 정상적인 감수 분열을 묘사한 tetraploid oocyte meiotic 사단의 시간 경과 (동영상 2)에서 5 µ m. (D) 이미지입니다. 극 지 시체를 표시 하는 화살표 머리와 점선 안에 spermatheca oocyte의 피 질을 표시 하 고 둘러싸인 정자; t = 시간 분에 타락 한. 눈금 막대는 10 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유전자 형</td>
			<td>Tetraploid 파생 (Autosomes의 설정: # X-chromosomes의) *</td>
			<td>부모의 부담 (2 중)</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs16 [파이-1p::mCherry:: 그의 58 + unc-119(+)];</td>
			<td>MSC1 (4A:4 X)</td>
			<td rowspan="6">MSC0</td>
		</tr>
<tr>
<td>
ruIs57 [파이-1p::GFP::b-tubulin + unc-119(+)]
</td>
			<td>MSC2 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC3 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC5 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC6 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC8 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">unc-119(ed3) III; ddIs6; ddIs6 [tbg-1::GFP + unc-119(+)]; ltIs37; ltIs37 [pAA64; 파이-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] 4</td>
			<td>MSC14 (4A:3 X)</td>
			<td rowspan="3">TMR17</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSC15 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSC16 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>spo-11 (me44) / nT1 IV; + nT1 [qIs51 [묘 2::gfp Ppes-10::gfp, PF22B7.9::gfp]] V</td>
			<td>AV800&amp;
</td>
			<td>AV776</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs8 [파이-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II;</td>
			<td rowspan="3">AV809&amp;
</td>
			<td rowspan="3">AV727</td>
		</tr>
<tr>
<td>ltIs37 [파이-1p::mCherry:: 그의 58 + unc-119(+)] IV;</td>
		</tr>
<tr>
<td>ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs8 [파이-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; mnT12 (X; 4)</td>
			<td>AV826&amp;
</td>
			<td>AV695</td>
		</tr>
<tr>
<td>mIn1 [dpy-10(e128) mIs14 [묘 2::gfp pes-10::gfp]] /</td>
			<td rowspan="2">AV810&amp;
</td>
			<td rowspan="2">DR2078</td>
		</tr>
<tr>
<td>
bli-2(e768) unc-4(e120) II </td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">
ruIs32 [파이-1::GFP::H2B + unc-119(+)] III </td>
			<td>AV822&amp;
</td>
			<td rowspan="2">AZ212</td>
		</tr>
<tr>
<td>AV823&amp;
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. briggsae-mfIs42 [Cel-시드-2 + Cel-묘-2::DsRed]</td>
			<td>AV824&amp;
</td>
			<td>JU1018</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: Tetraploid 긴장 생성. * Oocytes 물려받은 남성의 비율 뿐만 아니라 meiotic 사단 이전에 bivalents (연결 된 동종 쌍) 및 univalents (개별 homologs)의 수를 채 점 하 여 추론.
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57296/57296video1.jpg"> 영화 1: 안정적인 론 종자 인지 전체 또는 부분 tetraploids를 확인 하는 심사. 영화 시작 지역 강조는 야생 타입 자웅 동체의 다이어그램 염색체 쌍을 계산 하 여 tetraploids를 식별 하기 위해 (unfertilized oocytes) 몇 군데. 다이어그램, 따라 Z-스택 영화와 예측의 시리즈 DAPI 스테인드 고정 하는 2 중 고 tetraploid 동물의 생식 선 표시 또는 Mcherry::H2B 히스톤을 표현 하는 긴장의 이미지 라이브. 심사는 unfertilized oocytes에 연결 된 상 동 염색체 쌍의 수를 계산 하면 됩니다. MCherry 또는 DAPI 계산 묻은 시체 spermatheca ("-1 oocyte")를 저장 하는 정자에 가장 가까운 unfertilized oocyte에서 이루어집니다. 이 oocyte에서 염색체 가장 응축 하 고 보다 정확한 체 쌍 수에 대 한 수 있도록, 서로에서 분리. 스트레인 당 10 이상 동물-1 oocyte 염색체 수가 정확 했다 되도록 상영 했다. 스택 두께 0.2 µ m. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/Movie1.mov" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이 비디오를 볼 것 이다. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57296/57296video2.jpg"> 영화 2: Tetraploid oocyte 사단 정상 나타납니다. 히스톤 Mcherry::H2B와 GFP::β-Tubulin tetraploid 스트레인의 oocyte 분할의 시간 경과. 타이밍 및 패턴 부분의 정상 표시 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/Movie2.mov" target="_blank">제발 2.5 분 마다 촬영 한 이미지를이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

이 메서드는 모든 2 중 부담에서 tetraploid 및 triploid 꼬마 선 충의 세대에 대 한 수 있습니다. 이다 긴장이이 메서드에 의해 생성 된 meiotic 의향에서 염색체 상호 작용을 공부 하는 데 사용 되었습니다 그리고이 메서드는 셀을 개발, 진화, 그리고 암 생물학에서 중요 한 기본적인 질문을 검토 하는 데 유용.

꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

이 방법론의 전반적인 목표는 생물학적 과정에서 전체 게놈 배수체화의 역할 또는 결과를 연구하기 위해 모든 유전자형 또는 핵형의 이배체에서 안정적인 사배체 균주를 도출하는 것입니다. 이 방법은 유전자 투여량, 생물학적 스케일링, 세포 외 신호전달, 게놈 불안정성, 약물에 대한 내성 발달, 스트레스에 대한 적응 및 종분화 메커니즘에 대한 전체 게놈 배수체화의 역할을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효율적이고 다재다능하며 간단할 뿐만 아니라 다세포 유기체에서 유일하게 사용할 수 있는 기술로서 모든 이배체 균주에서 안정적이고 비옥한 사배체를 생성할 수 있다는 것입니다.저는 정모세포와 난모세포에서 rec-8 돌연변이의 염색체 분리 표현형을 분석하면서 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. Rec-8 돌연변이는 이배체 정자와 난모세포를 생성하는데, 이는 rec-8 유전자 발현 수준을 낮추면 수정 시 사배체 자손이 생성될 수 있음을 나타냅니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Katherine Rivera Gomez입니다.대장균에서 rec-8 이중 가닥 RNA 발현을 유도하려면 1밀리몰 IPTG와 암피실린 1밀리리터당 100마이크로그램으로 NGM 한천 플레이트를 준비합니다. 이 플레이트는 섭씨 4도의 어두운 곳에서 최대 4주 동안 보관하십시오. 이제 적절한 rec-8 클론을 운반하는 박테리아를 준비합니다.적절한 항생제가 들어 있는 접시에 박테리아를 줄무늬로 넣고 섭씨 37도에서 밤새 박테리아를 배양합니다. 다음 날, 플레이트의 단일 콜로니를 동일한 항생제 농도로 4ml의 LB에 접종하고 교반으로 섭씨 37도에서 밤새 박테리아를 성장시킵니다. 다음 날, 최종 농도가 1밀리몰 IPTG가 될 때까지 IPTG를 첨가하여 이중 가닥 RNA의 생산을 유도합니다.그런 다음 40분 동안 배양을 계속합니다. 다음으로, 준비된 NGM IPTG 플레이트를 파종합니다. 플레이트에 100-200 마이크로 리터의 배양액을 추가하고 실온에서 밤새 어둠 속에서 배양합니다.다음 날 아침, 3-4개의 어린 L4기 자웅동체를 rec-8 박테리아 플레이트에 놓고 어둠 속에서 섭씨 15도에서 자라게 합니다. 약 3일 후, F1 자웅동체가 L3에서 L4 유충 단계에 이르면 더 많은 rec-8 RNAi 박테리아 플레이트를 만들기 시작합니다. rec-8 박테리아 플레이트에서 약 4일 후, F1 L4 청년 자웅동체 20개를 갓 유도된 rec-8 RNAi 플레이트에 옮기고 자가 수정하도록 합니다.동일한 균주의 치료되지 않은 수컷 4-6마리를 포함하는 것도 가능합니다. 나중에 긴 표현형을 가진 F2 자손을 확인하십시오. 그들은 야생형보다 전반적으로 더 크며 몸이 앞으로 나아갈 때 머리에서 꼬리까지 정현파 몸을 굽히는 파동을 생성하면서 추가로 회전합니다.이러한 추정 사배체를 일반 OP50 또는 HB101 대장균 박테리아에 옮깁니다. F3 자손도 판을 가리십시오. 그러나 이러한 F3는 동일한 F2 어머니의 형제 일 수 있기 때문에 독립적 인 균주로 간주 될 수 없습니다.수집된 긴 벌레가 번식하기 위해 자가 수정하도록 합니다. 긴 자손만 나올 때까지 각 세대에서 3-6마리의 긴 동물을 새 접시로 계속 옮깁니다. 이것은 벌레가 종종 불임이고 자손을 낳지 않기 때문에 몇 세대가 걸릴 수 있습니다.사배체 균주에는 12개의 염색체 쌍이 있으며, 이는 수정되지 않은 난모세포에서 DAPI 염색체를 계수하여 검증할 수 있습니다. 이렇게 하려면 5-10마이크로리터의 M9 버퍼를 슬라이드에 떨어뜨리고 6-10개의 추정 사배체를 드롭으로 옮깁니다. 해부 현미경으로 대부분의 M9를 보푸라기가 없는 세척 티슈에 조심스럽게 흡수합니다.그런 다음 10 마이크로 리터의 90 % 에탄올을 웜에 떨어 뜨리고 에탄올이 완전히 증발하는 것을 지켜보십시오. 증발이 끝나자마자 에탄올을 첨가하는 과정을 반복하고 증발하는 것을 관찰하십시오. 총 4가지 응용 분야에서 10마이크로리터를 추가합니다.마지막 한 방울이 증발한 후 마이크로리터당 2나노그램 또는 이와 유사한 염색으로 6마이크로리터의 DAPI를 첨가합니다. 슬라이드를 장기간 보관하려면 시중에서 판매하거나 집에서 만든 페이드 방지에 웜을 장착하십시오. 그런 다음 커버슬립을 추가하고 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다.매니큐어가 건조된 후 슬라이드를 득점할 수 있습니다. 형광 현미경과 100X 배율을 사용합니다. 먼저 정자에 바로 인접해 있고 아직 정자나 자궁에 들어가지 않은 가장 성숙한 수정되지 않은 난모세포를 찾습니다.여기서 DAPI 몸체는 아마도 단일 염색체 쌍일 것입니다. 다음으로, 난모세포의 핵에 초점을 맞추고 현미경의 미세 초점을 사용하여 DAPI 본체를 세면서 위에서 아래로 천천히 스캔합니다. 그런 다음 초점을 아래에서 위로 이동하여 동일한 핵에 있는 DAPI 본체를 자세히 계산합니다.야생형 난모세포는 평균적으로 6개의 DAPI 바디를 가지고 있습니다. 12 개의 DAPI 시체가 존재한다는 것은이 균주의 동물이 부분 또는 완전한 사배체임을 나타냅니다. 균주당 최소 10마리의 동물을 분석합니다.종종 염색체 쌍은 매우 가깝거나 접촉하기 때문에 DAPI 본체의 수는 종종 실제 염색체 쌍의 수보다 작습니다. rec-8 이중 가닥 RNA를 발현하는 예쁜꼬마선충 박테리아에 공급하여 여러 사배체 균주를 생성했습니다. 사배체는 2-3 세대 동안 자웅 동체를 자체 수정하거나 1 세대 자웅 동체를 동일한 유전자형의 치료되지 않은 수컷과 교배하여 발생할 수 있습니다.후자의 시나리오에서, 십자가의 수컷은 짝짓기 동안 L4 단계부터 rec-8 RNAi 박테리아에 노출됩니다. 사배체 균주는 이배체 자웅동체의 난모세포에서 발견되는 6개의 염색체 쌍과 비교하여 사배체 자웅동체의 난모세포에서 발견되는 12개의 염색체 쌍의 존재를 스크리닝하여 확인되었습니다. 두 가지 유형의 사배체 자웅동체가 확인되었습니다.하나는 이배체 자웅동체와 비슷한 빈도로 수컷을 낳았고 다른 하나는 훨씬 더 높은 빈도로 수컷을 낳았습니다. 전자는 모든 염색체에 대해 사배체이고 후자는 모든 상염색체에 대해 사배체이지만 성염색체에 대해서는 삼배체입니다. 사배체 균주는 느리게 성장하고 더 작은 무리를 생산합니다.사배체 균주에 대한 피상적 검사에서는 관찰된 부양 크기의 감소를 설명할 수 있을 만큼 충분히 증가된 이수성 난모세포나 비정상적인 난모세포 또는 정자 세포 분열이 나타나지 않았습니다. 개발 후 이 기술은 발달 암 및 진화 생물학 분야의 연구자들이 다양한 생물학적 기능에 대한 전체 게놈 배수체화의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 기술을 사용할 때는 항상 새로운 NGM IPTG 플레이트를 사용하여 이중 가닥 RNA의 박테리아 발현을 유도해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.모든 것이 순조롭게 진행된다면 사배체는 3주 이내에 생산될 수 있습니다.

manipulation-of-ploidy-in-caenorhabditis-elegans

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기에서는 고정되고 손상되지 않은 선충에서 게놈 DNA를 시각화하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다. 이 비디오에는 수정되지 않은 예쁜꼬마선충 난모세포에서 염색질을 계수하는 프로토콜의 예가 포함되어 있습니다.

에탄올 고정 및 DAPI 염색: 예쁜꼬마선충에서 DNA를 시각화하는 방법

우리는 생식계열 독성을 평가하는 데 사용되는 선충 Caenorhabditis elegans에서 고처리량 화학 분석의 세부 단계를 설명합니다. 이 분석법에서는 화학 물질 노출에 따른 생식세포 기능의 중단을 이수성 배아에 특이적인 형광 리포터를 사용하여 모니터링합니다.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

배수성 조작 수정 된 프로토콜은 초기 배아 세포질 분열에 한 사이클 실속을 유도하는 열 쇼크를 사용한다. 이 프로토콜은 제브라에서 설명되지만, 다른 종에도 적용 할 수있다.

열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

이것은 항체 염색을 통해 면역형광을 위한 생식계열 샘플을 생성하거나 DNA를 시각화하기 위한 간단한 DAPI 염색을 위해 C. elegans 생식선 해부 후 동결 균열에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 연구실과 과정 기반 학부 연구 경험의 학부생에게 성공적이었습니다.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에서 감수분열 동안 교차 빈도 및 분포를 측정하는 방법을 제공합니다. 염색체의 기원을 결정하기 위해 Real-time PCR을 사용한 single-nucleotide polymorphism genotyping을 사용했습니다. 4점 매핑을 통해 각 염색체의 왼쪽, 중앙 및 오른쪽 팔 영역의 교차 분포를 결정할 수 있었습니다. ...

Real-time PCR을 이용한 SNP 유전형 분석에 의한 Caenorhabditis elegans 감수분열의 교차 빈도 및 분포

배우세요 꼬마 선 충에서 rec-8 RNAi를 이용한 안정적인 사배체 및 삼배체 생성 방법입니다. 이 기술은 전체 게놈 배수성 조작이 유전자 용량, 생물학적 스케일링 및 종 분화 메커니즘에 미치는 영향을 연구하는 데 필수적입니다.

꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작

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