Name: 에 라 골드 나노 입자 합성에 의해 급속 한 Nanoprobe 신호 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 학습하세요 금, 은, 산화철 나노입자 기반 바이오센싱에서 클로로아우릭산 환원을 이용한 신호 증폭 기법을. 이 방법은 10분 이내에 100배 신호 향상을 달성하여 저농도 분자 검출이 가능합니다.

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유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP/2007-2013) 아래 유럽 연구 위원회에서 자금 / ERC 부여 계약 번호 615458, 스웨덴 연구 위원회 및 Pronova 우수성 센터 단백질 기술 (VINNOVA-스웨덴어 혁신 시스템에 대 한 정부 기관)은 기꺼이 인정 했다.

인간의 혈 청 샘플 컬렉션, 즉국가의 법적, 윤리적 요구 사항에 따라에서 얻은 했다. 윤리 위원회의 (또는 유사한) 승인 및 기증자 로부터 서 면된 동의.
1. 향상 솔루션 준비:
<ol><li>나트륨 소금 이온된 수에 MES를 일시 중단 하 여 10mm MES pH 6 버퍼를 준비 합니다. 6 4 M NaOH 솔루션을 사용 하 여 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>5 m m 10mm MES pH 6 버퍼 (해결 방법 1)에서 HAuCl4 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>10 m m MES pH 6 버퍼 (솔루션 2) 1.027 M H2O2 솔루션을 준비 합니다. 참고: 솔루션 1과 솔루션 2 볼륨 향상 될 수와 microarrays의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어, 10 x 10 m m의 microarray 100 μ 총 볼륨 (솔루션 1 + 솔루션 2) microarray 영역 향상 솔루션 문의 되도록 필요 합니다. 희석, 후 H2O2 는 약 30-45 일 이내에 사용 되어야 한다.</li>
</ol>2. 나노 준비:
<ol><li>준비 하는 40 nm AuNPs Bastús 외에 설명 된 대로. 16 는 짧게, 2.2 m m 나트륨 구 연산 염 (149 mL)의 끓는 솔루션으로 수성 25 m m HAuCl4 전조의 1 mL를 주사. 레드 와인 색상은 관찰 될 때까지 기다립니다. 씨앗으로 나노 입자의이 솔루션을 사용 하 여 씨앗 성장 단계.</li>
	<li>90 ° C에서 60 m m 나트륨 구 연산 염 솔루션을 포함 하는 씨앗에 25 mM HAuCl4 의 1 mL 선행의 1 mL를 주사. 30 분 후 반응 완료 됩니다. 씨앗-성장 단계 반복 5 번 때까지 40 nm 나노 입자는, Bastús 외에 설명 된 대로. 16
</li>
	<li>나노 입자의 크기를 결정 하기 위한 나노 입자의 최종 솔루션의 대 한 UV 흡 광도 측정 합니다. 17 또는 전송 전자 현미경 (TEM) 수 수 인수 하 고는 나노 입자의 크기를 결정 하는 데 사용.</li>
	<li>준비 90 nm AgNPs Rivero 외에 설명 된 대로. 18 잠시, 폴 리 (아크릴산 나트륨 소금)의 적극적으로 냈다 솔루션 dimethylaminoborane (DMAB) 추가 (PAA)와 어 그 노3. 솔루션의 최종 볼륨 50 mL 및 DMAB, PAA의 최종 농도 이며 AgNO3 는 1.6 mM, 10 mM 및 3.33 m m, 각각. 참고: 100 nm IONPs 수정 carboxyl 그룹 및 50 nm carboxyl 그룹 수정 SiNPs 구입 했다.</li>
	<li>푸에르타 스 외에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 항 체와는 AuNPs를 functionalize. 19 는 짧게, 1.2x10-9 M AuNPs의 솔루션에 1mg의 COOH-말뚝-SH (5000 g·mol− 1) 추가 (10 광 밀도, OD). 12 4 M NaOH 솔루션에 pH를 조정 합니다.<ol>
<li>순 교 반 조건 하에서 하룻밤, 실내 온도 (~ 22 ° C)에 품 어 솔루션을 보자.</li>
		<li>15 분 13800 x g에서 솔루션 centrifuging 말뚝의 과잉을 제거 합니다.</li>
		<li>이온된 수의 500 μ와 펠 릿 resuspend</li>
		<li>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N의 5 μmol와 페그 수정 AuNPs를 품 어 '-37 ° c.에 30 분 동안 ethylcarbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 N-hydroxysulfosuccinimide 나트륨 소금 (sulfo NHS) 10mm MES ph 6의 7.5 μmol 버퍼</li>
		<li>5 분 13800 x g에서 솔루션 centrifuging EDC와 sulfo NHS의 과잉을 제거 합니다.</li>
		<li>10 m m MES 버퍼 pH 6의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 100 g·mL-1 항 체의 추가. 솔루션 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어 보자</li>
		<li>10 분 13800 x g에서 솔루션을 두 번 centrifuging 여 항 체의 과잉을 제거 하 고 10 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 0.3 M NaCl 버퍼의 500 μ에 펠 릿을 resuspend. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어 솔루션을 보자</li>
		<li>10 분 13800 x g에서 솔루션을 두 번 centrifuging 여 난다 바인딩된 항 체를 제거 하 고 10 m m MES pH 6 버퍼에 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 500 μ에 펠 릿을 resuspend. 4 ° C에서 샘플을 밤새 품 어.</li>
		<li>두 번, 10 분 13800 x g에서 솔루션 centrifuging와 10mm MES 버퍼 pH 6의 500 μ에 펠 릿을 resuspending 하 여 BSA의 초과 씻어.</li>
		<li>따라 EDC와 sulfo NHS의 수량을 조정 하는 항 체와 SiNPs의 2.5.9 5 M AgNPs, IONPS의 0.5 mg을 0.5 mg의 수정에 대 한 통해 2.5.1 단계를 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수직 흐름 종이 기반 분석 실험:
<ol><li>Microarrays는 로봇 프린터 니트로 종이 막에 G 단백질의 그라데이션 농도 입금 하 여 준비 합니다. 인쇄, 후 microarrays 실내 온도 (~ 22 ° C)에서 하룻밤을 건조 시킬.</li>
	<li>필터 홀더에 막으로 수직 흐름 시험을 실시 합니다. 1 mL·min− 1의 속도로 울트라-주사기 펌프를 사용 하는 IgG 수정 AuNPs의 8 M 솔루션 흐름. 17 M IgG 수정 AgNPs의 솔루션으로이 단계를 반복 하 여 0.1 mg·mL− 1 IgG 수정 SiNPs 및 0.1 mg·mL− 1 IgG 수정 IONPs.</li>
	<li>30 분 동안 실내 온도 (~ 22 ° C)에 말리 고 4800 dpi의 해상도에 평판 스캐너에서 스캔 microarrays 하자. 24-비트 컬러 TIFF 파일 이미지를 저장 합니다.</li>
</ol>4. 상업 유리 기반 분석을 참조:
<ol><li>실 온에서 4 다른 인간의 혈 청 샘플 구성 요소 알레르겐의 검출에 대 일 분에 대 한 두 개의 유리 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>Microarrays 이온된 물으로 린스.</li>
	<li>품 한 슬라이드는 형광 활용 된 안티 인간 IgE 항 체로 30 분 안티 인간 IgE와 품 두 번째 슬라이드에 대 한 실 온 (~ 22 ° C)에서 항 체-수정 AuNPs 실 온에서 30 분.</li>
	<li>Microarrays 이온된 물으로 린스.</li>
	<li>형광 안티 인간 IgE 항 체와 알을 품는 레이저 장치를 스캔 microarray의 형광 강도 측정 합니다. 이었다 incubated 안티 인간 IgE 항 체 수정 AuNPs 색도계 신호 수집을 위한 테이블 탑 스캐너로 microarray 디지털화</li>
	<li>디지털화, 후 5 분 동안 실내 온도 (~ 22 ° C)에 향상 솔루션 microarray를 품 어.</li>
	<li>이온된 수와 센서를 헹 구 고 실내 온도 (~ 22 ° C)에서 10 분 동안 말리는 것을 그것 허용.</li>
	<li>색도계 신호 수집을 위한 4800 dpi의 해상도-탁상용 스캐너는 microarray를 디지털화. 이미지 저장할 16 비트 회색조 TIFF 파일.</li>
</ol>5. Microarray 인큐베이션 향상 솔루션:
<ol><li>솔루션 1과 솔루션 2의 동일한 금액을 미리 혼합 또는 센서의 표면에 직접 그들을 혼합 하 고는 microarray에 관심 분야 솔루션의 혼합물으로 덮여 확인 합니다.</li>
	<li>최대 5 분 이상 보육에 시간 얻을 수 있습니다 향상 된 감도 특히 microarrays 종이-기반에 대 한 높은 잡음/신호 비율에 대 한 하자 센서 향상 솔루션으로 실 온에서 품 어.</li>
	<li>5 한 번 이온된 물에 잠수 하 여 있는 microarray를 씻어 미 실 온에서 건조 두고. 참고: 건조 단계에 있는 microarray 자료에 따라 달라 집니다. 종이 기반 microarray 건조 단계 약 30 분 필요합니다. 유리 기반 microarray 건조 단계 약 5-10 분 필요합니다.</li>
</ol>6. 영상 분석:
<ol><li>소프트웨어 도구와 형광 강도 분석. (DfU)를 사용 하 여 센서 제조 업체의 지시에 따라 0.3 Isac 표준화 단위 (ISU) 보다 크거나 중인 모든 결과를 고려 하십시오.</li>
	<li>소프트웨어 도구를 사용 하 여 색상 채도 농도 분석 합니다. 이미지 파일을 반전, 각 명소의 강도 측정 하 고 평균 픽셀 강도 계산. 세 가지 뜻 자리 픽셀 농도의 뜻으로 최종 신호 값을 계산 하는 triplicate 명소의 값을 사용 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

현재, nanoprobe 기반 탐지와 분석에 대 한 신호 향상 기법 중 효소 기반12, 대상 검색 nanoprobes21 나노 입자의 두 번째 집합을 필요로 또는, 기법, 얼룩의 경우에 제한 됩니다. AuNPs 또는 감지 프로브로 AgNPs의 사용. 22 여기, 간단, 신속 하 고 효소 없는 메서드 nanoprobe 탐지 기반 분석 실험의 신호 향상을 위한 설명 되어 있습니다. 이 방법으로, 그것은 nanoprobes의 4 종류에서 제공 하는 색도계 신호를 향상 시킬 수: AuNPs, AgNPs, IONPs 및 SiNPs.
Nanoprobes의 각 집합에 대 한 관찰된 증폭 요인은 향상 요인의 정량화 사전 향상 신호의 부족으로 인해 가능 하지 않았다 SiNPs 제외한 약,의 이었다. 이 향상 요인은 모든 유형의 nanoprobes 프로토콜의 효율성은 유사한 나왔다. 또한, 향상 프로토콜 재고 AuNPs 현 탁 액의 희석 시리즈 인쇄 된 종이 지원에 실행 되었다 때 10000-fold 증폭 요인은 관찰 되었다. 향상, AuNPs의 낮은 번호 표시 장소에 이전 했다 약 10000 나노 인쇄 되었다 향상 후 10 나노 입자를 은닉 하는 관광 명소 보이게 되었다. 20
여기 제시 향상 프로토콜에 대 한 설립 조건 Au3 + 의 감소의 Au0 최소에 배경 잡음을 유지 하면서 신호 향상을 위한 활용 수 있다. 분석 결과 뿐만 아니라에 대 한 최대 저장 된 microarrays에 몇 달 후 분석 결과 수행한 수행 된 후 바로 향상을 수행할 수 있습니다. 솔루션 1과 솔루션 2의 1:1 혼합 향상 솔루션에 의하여 이루어져 있다. 두 솔루션 이전 혼합 하거나 직접는 microarray에 pipetted 때 혼합 될 수 있습니다. 미리 혼합 또는 직접 혼합의 차이만-수명 향상 솔루션의 영향을 줍니다. 때 미리 혼합 선반-인생은 그렇지 않으면 30-45 일을 증가 하는 5-7 일의 사전 혼합.
추가 분석 결과의 향상 메서드는 바이오 센서의 정량 분석 방해 하지 않습니다 나타났습니다. 관찰 하는 강도와 분석의 농도 사이의 선형 상관 관계 (표 1)를 유지 했다. 4 미리 특징이 임상 샘플 표준 형광 탐지 및 색도계 검출, 유리 기반 알레르기 구성 요소 microarray immunoassay를 사용 하 여 얻은 데이터 두 검출 방법 사이 좋은 일치를 보였다. 말은 형광 강도 (MFI)와 평균 색도계 강도 (MCI), 평균 R2 비교 = 0.08 ± 0.79 데이터가 10-양 축 로그온 때 얻은. 이 실험이 보여주었다는 nanoprobes를 사용 하 여 검색 하거나 nanoprobe 기반 탐지에 대 한 적용할 수 있습니다 경우 향상 방법 상업 키트에 적용할 수 있습니다.
향상 방법 효능 두 중요 한 측면에 의존합니다. 솔루션 1의 혼합 보장 하는 것이 중요 하다 고 솔루션 2 균질 성 이다. 동질적인 혼합물을 없이 센서 솔루션 1 또는 2는 다른 기준으로 주된 향상 솔루션의 접촉 될 것입니다. 그의 Au3 + Au0, 따라서 손상 강화의 효율 감소의 효율성을 줄일 것입니다. 그것은 또한 잠복기 동안 향상 솔루션 접촉 microarray의 관심의 전체 영역을 갖는 것이 중요.
신호의 磁 향상을 위해 향상 솔루션와 함께 긴 부 화 시간 (약 5 분) 하셔야 합니다. 신호 획득을 방해할 수 있는 배경 잡음의 개발을 방지 하려면 microarray 표면 해야 이전 차단 (예: BSA, 못) 골드의 Au0 및 결과 형성의 신속한 난다 증 착을 방지 하기 위해 레이어입니다.
향상 방법에 한계는 분석 결과의 본질적인 효능 이다. 분석 결과 부정적이 고 긍정적인 컨트롤 신호 향상 관찰 확인 하십시오 데 true 긍정적인 결과에 표시 될 수 있습니다 필요 합니다. 경우에 대상으로는 nanoprobes의 일반적인 상호 작용을, 신호 인수 후 향상 유효 하지 않을 것 이다.
다른 향상 기법 중 나노 집계에 따라 또는 향상 된 신호 수집을 허용 하는 재료와 나노 입자의 얼룩 있습니다. 검색 사이트에서 나노 입자의 수의 집회를 홍보 하 여 신호 수집 가능한 것도 시각적으로 또는 UV에 대 한 측정. 5 이러한 신호 향상 기법 2 단계 탐지 시스템, 관심과 기자 초기 감지 구조에 바인딩할 필요는 두 번째 단계는 분석의 초기 검색에 의존 합니다. 이러한 전략의 분석 결과의 각 유형에 대 한 특정 향상 프로토콜 최적화의 요구 사항으로 인해 보편성을 부족합니다.
얼룩, 훨씬 여기 제시, 프로토콜 같은 실버 등 착 색 향상 기법, 신호 검색 구문 직접 향상을 수 있습니다. 그러나, 여기에 표시 되는 프로토콜, 달리 실버 얼룩만 보였다 AuNPs 또는 AgNPs에 적용할. 6 , 7 , 8 , 9
이 방법의 적용 가능성이 탐지 요원 AuNPs, AgNPs, IONPs 또는 SiNPs를 사용 하는 분석 결과 걸쳐 수 있습니다. 추가 작업은 다른 물자의 구성 된 센서에서 방법의 응용 연구를 수행 되 고.

금 나노 입자 (AuNPs) 또는 산화 철 나노 입자 (IONPs)와 같은 나노 재료를 사용 하 여 향상 된 감도와 다목적 바이오 센 싱에 응용 프로그램을 허용 했다. 1 볼륨 비율, 그들의 높은 표면의 활용으로 다양 한 ligands와 나노 입자의 표면 훈장을 위해 개발 된 방법의 과다 향상 된 감도와 센서의 디자인을 활성화 했습니다. 2 그럼에도 불구 하 고, 바이오 센 싱 도구 감지 신호를 달성 하는 데 필요한 nanoprobes의 수에 따라 달라 집니다. 예를 들어 40의 경우 nm UV vis 분광학, 약 90 × 106 nanoprobes 통해 신호를 얻으려고 AuNPs 관심의 목표를 효과적으로 탐지 하는 데 필요한. 3 이 nanoprobe 밀도 제한 신호 증폭을 통해 피할 수 있습니다. 이러한 전략4 interparticle 집계 또는 덩어리, 처음에 nanoprobes의 두 번째 세트를 축적 하 여 초기 nanoprobes의 밀도 증가 하는 어디를 기반으로 될 수 있습니다. 5 센서 표면에 주어진된 위치에 나노 입자의 수를 증가 visual 또는 UV 마주 신호 수집 수 있습니다. 그러나, 분석 결과의 감도 nanoprobes의 초기 설정으로 나노 입자의 두 번째 집합의 대상 능력에 본질적으로 링크 될 것입니다. 금색과 은색 nanoprobes의 얼룩에 의존 하는 다른 전략. 6 , 7 visual 또는 UV에 대 한 감지 하는 나노 입자의 표면에은 이온의 감소를 통해 이루어집니다는 얼룩. 8 이러한 방법 향상 금 기존 신호 또는 공명 표면 플라스몬 potentiating 여은 nanoprobes 신호, 보조 대상 사건 interparticle 덩어리 방법 따라 하지. 그러나,은 착 색 방법만 금 또는 nanoprobes의 사용으로 보고 되었다. 8 , 9
2005 년에, Zayats 외. 10 Au 금 nanoprobes 표면 플라스몬 공명 신호 증가 표면에 이온의 감소를 보고 했다. 이 효소 종속 작업에서 과산화 수소 및 chloroauric 산의 감소를 허용 하는 cetyltrimethylammonium 염화 함께 포도 당 산화 효소 촉매 작용에 의해 생성 되었습니다.
최근 왕은 외. 기존 nanoprobes의 표면에 골드 레이어 생성 향상 방법 보고. 11 이 확대 nanoprobes 표시 기판 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) 육안에 의해 밝은 파란색의 시각화를 사용에 대 한 과산화 효소와 같은 촉매 활동.
스티븐 스 외. plasmonic ELISA 기반 분석 결과의 개발을 보도 했다. 12 전통 ELISA 전략을 통해 전립선 특정 항 원 (PSA)의 검색, 이차 항 체 카 탈 라 제와 함께 표시 했다 incubated 센서는 센서에에서 젖 었습니다 과산화 수소를 포함 하는 솔루션 및 chloroauric 산입니다. 보조 catalase 수정 항 (긍정적 결과)의 존재는 과산화 수소, chloroauric 산 감소 둔화와 붉은 색으로 준 구형 monodispersed AuNPs 저조한의 소비를 홍보 것 이다. 과산화 수소 농도를 그대로, 따라서 빠른 chloroauric 감소를 추진 하 고 병이 정의 형태학 파란색/보라색 색상에 대 한 책임으로 AuNPs 저조한 유지를 허용 하는 catalase 수정 항 체 (부정적인 결과)의 부재 . 카 탈 라 제의 활동에 의해 결정 되는 과산화 수소의 농도의 분석의 농도에 상관 될 표시 했다. Catalase 수정 이차 항 체 및 촉매 활동의 조건의 제어에 대 한 필요는이 방법의 보편성을 방해 하는 두 가지 요인이 있습니다. 또한, 기존 AuNPs의 독립적인 골드 클러스터의 형성 배경 잡음 문제 확대 전략을 소개 합니다.
위에서 언급 한 기술도 몇 가지 다른13,14,15, 가능 하 게 만든 그것은 전통적인 기술 파 탐지의 한계를 달성 하기 위해 nanoprobe 기반 바이오 센서에 대 한.
여기, 소설 금 향상 방법 시연 되는 기존 nanoprobe의 신호는 potentiating 또는 표면 플라스몬 공명 신호를 도입 하 여 증폭 하는. 센서는 과산화 수소와 2-(N-Morpholino) chloroauric 산의 혼합물의 솔루션으로 품 어 수 후 검색 실시 하는 골드, 실버, 실리 카 또는 산화 철 나노 입자의 사용과, ethanesulfonic 산 (MES) pH 6 버퍼. 향상 솔루션의 구성 요소의 농도 Au0 기존 nanoprobes의 표면에 증 착을 최적화 했다. 모든 nanoprobe 유형, 즉를 공부 했다. AuNPs, 실버 나노 입자 (AgNPs), 실리 카 나노 입자 (SiNPs)와 IONPs, 병이 정의 하는 계층의 형성 굴복 하거나 감지 또는 증가 보이는 신호 귀착되는 빛의 산란을 증강. 종이 유리 기반 microarrays에 nanoprobes에 대 한 100 증폭 계수와 신호 증가 달성 하 고 프로세스는 신호를 얻으려고 5 분 미만 소요. 육안에 의해 신호 수집을 할 수 있는 UV vis 분광학 또는 이미징 탁상 스캐너 또는 디지털 카메라와 같은 낮은-엔드 도구. 또한, 그것은이 향상 프로토콜 적용할 수 있는 즉시 상용 알레르기 진단 분석 결과에서 특정 최적화를 필요로 하지 않고 시연 했다.

<table><tbody><tr><td>클로로오우릭산</td><td>시그마-알드리치</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>시트르산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S4641 시그마-알드리치</td><td></td></tr><tr><td>디메틸아미노보란&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>476668 알드리치</td><td></td></tr><tr><td>폴리(아크릴산, 나트륨염)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>실버 니트레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm 자성 나노 입자</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm 실리카 나노 입자</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&nbsp;</td><td>RAPP 폴리머</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>1.06462&nbsp; EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>03449&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-하이드록시설포숙신이미드 나트륨 염&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>56485&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>IgG 항체</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>342483&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>소 세럼 알부민</td><td>VWR&nbsp;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Thermo Scientific</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 종이 멤브레인</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 로봇 프린터</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 홀더</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 Ultrasyring 펌프</td><td>Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-human IgE 항체 변형 AuNPs&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탁상용 스캐너 이미지 스캐너 Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>형광 결합 항인간 IgE 항체&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Phadia 마이크로어레이 이미지 분석기 MIA 1.2.4&nbsp;</td><td>써모피셔</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에 라 골드 나노 입자 합성에 의해 급속 한 nanoprobe 신호 향상

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

높은 감도 편리한 색도계 판독 등 금은, 실리 카 또는 산화 철 나노 입자 생물 분석 실험 시 약 검색으로 nanoprobes 사용 하 여 설정할 수 있습니다. 그러나, 나노 입자의 높은 밀도 일반적으로 검색 필요 합니다. 사용할 수 있는 합성 기반 향상 프로토콜 중 골드 및된 실버 나노 입자 또는 정확한 효소 제어 및 최적화. 여기, 선물이 골드, 실버, 실리 카, 산화 철 nanoprobes의 색도계 판독을 강화 하는 프로토콜. 그것은 10000-fold 요소까지 색도계 신호에 의해 향상 시킬 수 있습니다 관찰 했다. 이러한 신호 향상 전략에 대 한 Au3 + Au0의 화학 감소 이다. Au3 + Au0의 감소를 사용할 수 있는 여러 화학 반응 있다. 프로토콜에서 좋은 버퍼 및 H2O2 는 사용 하 고 누구나0 의 새로운 금 나노 입자의 형성에 기존 nanoprobes의 표면에 증 착을 부탁 수 있습니다. Chloroauric 산 및 H2O2 에 2-(N-morpholino)으로 구성 된 솔루션으로는 microarray의 외피의 프로토콜 구성 ethanesulfonic 산 성 pH 6 버퍼 nanoprobe 기반 탐지 분석 결과 따라. 향상 솔루션은 종이 유리 기반 센서에 적용할 수 있습니다. 또한, 그것은 사용할 수 있습니다 상용 immunoassays에 상업 알레르기 microarray 방법의 응용 프로그램에서와 같이. 신호 개발 향상 솔루션 외피의 5 분 미만 필요 하 고 판독 육안 또는 탁상 스캐너 또는 디지털 카메라 등 저가형 이미지 수집 디바이스 평가할 수 있습니다.

분석 결과, 실행 된다 nanoprobes를 사용 하 여 검색 요원으로 후 센서 탐지 영역 nanoprobes (그림 1a)로 채울 수 있습니다. 비주얼 검색 제한 아래 nanoprobes의 수를 실행 하는 경우는 분석의 검색, 처음, 간주 됩니다 부정. (그림 1b)를 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하는 nanoprobes의 신호는 Au그림 1(c)의 병이 정의 층을 도입 하 여 potentiated입니다.
단백질 G의 탐지를 위한 종이 기반 immunoassay 향상 프로토콜 (그림 2)의 효과 보여주는로 실시 됐다. AuNPs, AgNPs, SiNPs, IONPs IgG 항 체와 수정 그리고 사용 및 검색 에이전트. 종이 microarrays 자리 당 단백질 G 분자의 수의 그라디언트로 준비 했다.
그것을 관찰 분석 결과, 실시 후 수정 된 AuNPs (IgG-AuNPs) 낮은 자리 (그림 2는) 당 2 × 105 분자 검출 수 있었다 IgG, IgG 수정된 AgNPs (IgG-AgNPs) 2 × 104 낮은 검색 수 있었다 자리그림 2(c) 당 분자, IgG 수정 IONPs (IgG-IONPs) SiNPs (IgG-SiNPs) ( 시각적 신호를 제공 하지 못했습니다 당 2 × 107 분자 (그림 2e) 자리와 IgG 수정 낮은 검색 수 있었다 그림 2g).
그건 약에 의해 신호를 높일 수 향상 솔루션 microarrays, 배양 하 여 사용 하는 나노 입자의 모든 종류에 걸쳐. SiNPs, 경우 향상 솔루션 가능 하 게 했다 시각적 신호 향상 솔루션 없이 관찰 되었다 신호를 관찰 하는 것 (그림 2b, 2d, 2 층 2 h).
기존 상업 immunoassay 방법의 적용 가능성 평가 했다. 강화 유리 기반 알레르기 구성 요소 microarray immunoassay에 실행 되었다. 4 세트 유효성 검사 및 혈 청 알레르기 환자에서 샘플은 microarray와 평가 했다 특징 (샘플 a, b로 지정 되었다 c와 d). 이 분석 결과의 표준 fluorometric 감지 안티-IgE AuNPs 신호 (그림 3)의 향상에 따른 분류와 얼룩이 비교 되었다. 향상, 이전에 아무 반점 microarrays는 감지 안티-IgE AuNPs를 표시와 함께 실시 되었다 어디에 발견 했다. 향상, 후 여러 관광 명소 육안으로 표시 되었고 그들의 강도 이미지 디지털화 (그림 3)에 의해 등록 되었다. 형광 탐지와 관광 명소의 다양 한 했다 감지 (그림 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> 그림 1 . 일러스트 레이 션 단계는 microspot 향상 된 신호를 분석 감지에서 수행 됩니다. 는 microspot, 향상 프로토콜 microarray의 부 화 (b)와 nanoprobes 항 체 수정 및 (의 후속 씨앗 성장에 움직일 수 있는 분석의 검색 (한) 2 항 체 수정 nanoprobes c) microspot는 nanoprobes의 크기 5 분 향상 솔루션 잠복기 후 증가. 이 그림에서 디아스 외dapted 되었습니다. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> 그림 2 . G. 단백질의 검출을 위한 microarrays의 디지털된 이미지 각 microarray의 왼쪽에는 탐지 (로한) (c) (e) IgG AgNPs IgG AuNPs 수행의 향상 이전에 관찰 된 마이크로 IgG IONPs 및 (g) IgG-SiNPs. (B) (d) (f) IgG AgNPS IgG AuNPs의 향상 후는 마이크로 각 microarray의 오른쪽에는 IgG IONPs와 (h) IgG-SiNPs. 단백질 G의 각 농도 3 중에 microarray에 입금 했다. 단백질 G 이루어졌다 단백질의 농도에 따라 수의 계산 각 microspot에 인쇄. 이 그림에서 디아스 외적응 되었습니다. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> 그림 3 . 형광 강도 분석 실험에 대 한 얻은 색도계 강도 사이 상관 관계 상업 알레르기 진단 분석 결과 함께 실시. 형광 강도 (MFI) 의미 고 색도계 강도 (MCI) a, b, 샘플에 알레르기 검출을 위한 측정을 의미 c 및 d. 인세트 로그 10 변형 데이터 간격 두 방법 사이의 선형 상관 관계가 관찰 되었다. 마이크로 fluorophore 수정 항 체 (Fluorophore-Ab)에 따라 검색에 대 한 관찰의 강도 형광 방출. 마이크로 Ab AuNPs 분석 결과에 따라 검색에 대 한 관찰의 밝기는 microarray를 디지털화 하 고 이미징 소프트웨어 사용 하 여 이미지를 반전 후 얻은 것입니다. Microarrays는 맨 오른쪽 하단에 형광 검출에 대 한 긍정적인 컨트롤과 세로 triplicates로 설계 되었습니다. 다른 3 개의 모서리는 소프트웨어 평가에 사용 됩니다. 이미지는 16 비트 회색조로 분석 되었다. 이 그림에서 디아스 외적응 되었습니다. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>R2 사전 향상</td>
			<td>향상 후 R2</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG AuNPs</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG AgNPs</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG IONPs</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG SiNPs</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. R2 검색 향상, 나노 입자의 다른 세트를 사용 하 여 전후의 단백질 G, 이전 값. R2 값은 측정 분석의 농도와 관광 명소의 강도 상호 연결 후 얻은 했다.

이 작품에서는, nanoprobe 기반 바이오 센 싱의 신호 향상을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜은 금은, 실리 카 또는 산화 철 나노 입자의 구성 된 기존 nanoprobes의 표면에 chloroauric 산의 감소를 기반으로 합니다.

에 라 골드 나노 입자 합성에 의해 급속 한 Nanoprobe 신호 향상

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

이 절차의 전반적인 목표는 종이 또는 유리 지지대에서 수행된 분석에서 나노 입자 기반 프로브의 신호를 증폭하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 10개의 나노 입자를 포함하는 스폿에 대한 비색 신호를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양성입니다.그것은 종이, 유리 및 잠재적으로 다른 지지체의 다른 나노 입자에 큰 변형 없이 적용할 수 있습니다. 절차를 시작하려면 탈이온수에 최소 10ml의 10mmolar MES 용액을 준비합니다. 4몰 수산화나트륨 용액으로 용액의 pH를 6으로 조정합니다.다음으로, 1.2 곱하기 10의 1 밀리리터에서 40 나노 미터 금 나노 입자의 마이너스 9 대구치 현탁액을 1 밀리그램의 알파 메르 캅토 오메가 카르복시 PEG와 결합하고 혼합물을 와류로 만듭니다. 4 몰 수산화 나트륨 용액으로 혼합물의 pH를 12로 조정하십시오. 혼합물을 실온에서 밤새 부드럽게 저어줍니다.그런 다음, 3, 800회 G에서 15분 동안 혼합물을 원심분리하고 상층액을 버린다. 부드러운 피펫팅으로 PEG 변형 금 나노 입자 펠릿을 500마이크로리터의 탈이온수에 재현탁시킵니다. 다음으로, 250마이크로리터의 10밀리몰 pH 6 MES 완충액에 5마이크로몰의 EDC를 용해시킵니다.7.5마이크로몰의 sulfo-NHS를 또 다른 250마이크로리터의 MES 완충액에 용해시킵니다. 이러한 용액을 PEG 변형 금 나노 입자와 결합하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 혼합물을 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.펠릿을 MES 버퍼 500마이크로리터에 재현탁합니다. 현탁액에 밀리리터당 100피코그램의 항체 농도를 위해 충분한 양의 IgG 항체를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.혼합물을 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 펠릿을 MES 버퍼 500마이크로리터에 재현탁시키고 원심분리를 반복합니다. 그런 다음 펠릿을 탈이온수에 10 밀리몰 인산나트륨과 0.3 몰 염화나트륨의 pH 7.5 버퍼 500 마이크로리터에 재현탁시킵니다.혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 앞서 설명한 대로 혼합물을 10분 동안 두 번 원심분리합니다. 펠릿을 10밀리몰 pH 6MES 완충액에 1%BSA 500마이크로리터에 재현탁시키고 혼합물을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.혼합물을 10분 동안 두 번 원심분리합니다. 마지막으로, 펠릿을 500마이크로리터의 MES 완충액에 재현탁시켜 IgG 변형 금 나노입자를 얻습니다. 로봇 프린터를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 단백질 G 농도 구배의 마이크로어레이를 증착합니다.다음으로, 적절한 크기의 스테인리스강 필터 홀더에 마이크로어레이를 로드합니다. IgG 변형 금 나노 입자의 8피코몰 현탁액이 들어 있는 주사기를 필터 홀더의 입구에 연결합니다. 주사기 펌프에 주사기를 장착합니다.필터 홀더에서 배출구를 수집하기 위해 50ml 튜브를 설정합니다. 그런 다음 필터 홀더를 통해 분당 1ml의 속도로 서스펜션을 흘려보냅니다. 그런 다음 마이크로어레이를 실온에서 30분 동안 건조시킵니다.필터 홀더를 물과 여과지로 청소하고 말리십시오. 4, 800DPI로 평판 스캐너에서 건식 마이크로어레이를 스캔하고 이미지를 24비트 컬러 TIFF 파일로 저장합니다. 다음으로, 10 밀리몰 pH 6 MES 완충액에 5 밀리몰 클로로오우르산 용액과 1.027 몰 과산화수소 용액을 모두 준비합니다.강화 용액을 미리 혼합하려면 마이크로 원심분리기 튜브에 클로로오우르산과 과산화수소 용액을 동일한 값으로 놓고 용액을 완전히 혼합합니다. 미리 혼합된 강화 용액을 마이크로어레이 센서 표면에 적용합니다. 또는 동일한 부피의 chloroauric acid와 과산화수소 용액을 센서 표면에 바르고 센서에서 직접 완전히 혼합합니다.최대 5분 동안 센서를 강화 용액으로 배양한 다음 마이크로어레이를 탈이온수에 5초 동안 담가 강화 용액을 헹굽니다. 마이크로어레이를 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다. 향상될 각 마이크로어레이에 대해 이 프로세스를 반복합니다.향상된 마이크로어레이를 스캔하고 이미지를 저장합니다. 표준 종이 기반 면역 분석법에서 IgG 변형 금,은 및 산화철 나노 입자는 반점당 각각 10에서 5분의 2, 10에서 4분의 2, 2 배 10에서 7분의 2 분자에서 단백질 G 농도를 감지했습니다. IgG 변형 실리콘 나노 입자에서 시각적 신호가 관찰되지 않았습니다.강화 용액에서 마이크로어레이를 배양한 결과 금, 은 및 산화철 나노 입자의 신호가 100배 증가했습니다. 실리콘 나노 입자의 경우,이 향상으로 시각적 신호를 관찰 할 수있었습니다. 이 향상은 4개의 인간 혈청 샘플에 대한 상업용 유리 기반 알레르겐 성분 마이크로어레이 면역분석법에 적용되었습니다.항-IgE 표지된 금 나노입자로 염색하고 신호를 강화하면 표준 형광 분석법과 유사한 결과를 얻을 수 있었습니다. 평균 형광 강도와 평균 비색 강도 사이의 평균 선형 상관 관계는 0.79였습니다. 한 번 배우면 이 기술을 올바르게 수행하면 10분 이내에 완료할 수 있습니다.

rapid-nanoprobe-signal-enhancement-situ-gold-nanoparticle

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

Plasmonic 핀셋 및 광자 크리스탈 nanostructures는 광학 트래핑 마이크로 및 나노 입자의 효율성과 방향 제어에 유용 향상을 생산하기 위해 표시됩니다.

향상된 마이크로 및 Nanoparticle 조작에 대한 Plasmonic 및 광자 크리스탈 Nanostructures 활용

우리는 은색 씨앗 중재의 성장 방법을 사용하여 별 모양의 골드 nanostars을 합성. nanostars의 직경이 200-300 nm의 범위에서 및 도움말의 숫자 7에서 10에 따라 다릅니다. nanoparticles는 가까운 적외선 중심으로 광범위한 표면 plasmon 공진 모드를있다.

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우리는 전자 micrographs에 휘황 태그 단백질을 지역화하는 방법을 설명합니다. 형광 먼저 ultrathin 섹션에 사진 활성 현지화 현미경을 사용하여 지역화되어 있습니다. 이러한 이미지는 다음 같은 섹션의 전자 micrographs으로 정렬되어 있습니다.

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본 프로토콜은 새로운 자가핵형성 억제 메커니즘 기반 금 나노입자 합성 기술을 사용하여 세포에서 메탈로티오네인 태그가 부착된 단백질을 검출하기 위한 클로너블 전자 현미경 표지 기술을 설명합니다.

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학습하세요 금, 은, 산화철 나노입자 기반 바이오센싱에서 클로로아우릭산 환원을 이용한 신호 증폭 기법을. 이 방법은 10분 이내에 100배 신호 향상을 달성하여 저농도 분자 검출이 가능합니다.

에 라 골드 나노 입자 합성에 의해 급속 한 Nanoprobe 신호 향상

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