주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

이 프로토콜의 전반적인 목표는 PA14NR 세트라고 하는 녹농균 균주 PA14의 주문된 비중복 전이 돌연변이 라이브러리의 고품질 사본을 생성하는 것입니다. 이 프로토콜은 복제 중에 PA14NR 세트의 무결성을 보존하여 이 라이브러리의 고품질 복사본을 생성합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 라이브러리 복제, 품질 관리 및 개별 돌연변이의 적절한 저장과 관련된 모든 단계에 대한 자세한 설명을 제공한다는 것입니다.

이 프로토콜은 P14NR 세트를 복제하도록 설계되었지만 다른 박테리아 라이브러리를 복제하도록 조정할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 복제 과정 중 오염의 위험 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 따라서 이 프로토콜은 이러한 위험을 줄이기 위한 자세한 단계별 지침을 제공합니다.

우리 실험실은 PA14NR 세트를 글로벌 과학계에 배포합니다. 또한 최종 사용자가 라이브러리를 복제하는 것이 좋습니다. 지침을 제공하기 위해 라이브러리의 고품질 복사본을 생성하는 방법을 자세히 설명하는 프로토콜을 제공합니다.

이 프로토콜의 시각적 시연은 특히 교차 오염을 방지하도록 설계된 단계에서 매우 중요합니다. 자기 보호와 박테리아 배양 보호를 위해 PA14NR 세트로 지정된 P aeruginosa 균주 PA14의 비중복 전이 삽입 돌연변이 라이브러리를 취급할 때는 항상 실험실 가운, 장갑 및 마스크를 착용해야 합니다. 용융된 LB 한천을 약 60밀리리터를 직사각형 플레이트에 부어 LB 한천 플레이트를 준비합니다.

사용하기 전에 멸균 후드에서 플레이트를 약 1시간 동안 건조시키십시오. 에탄올 와이프 벤치 탑에 분젠 버너로 멸균 필드를 만듭니다. 그리고 리플리케이터 핀 멸균을 위한 적절한 솔루션이 있는 용기를 설정하십시오.

영하 80도의 냉동고에서 PA14NR 세트 마스터 플레이트를 꺼내 4리터 얼음 팬에 드라이아이스에 올려 놓습니다. 드라이 아이스에서 복제할 96웰 마스터플레이트를 가져와 벤치에 올려 잠시 해동할 수 있도록 합니다. 마스터 플레이트와 한천 플레이트를 왼쪽 상단 모서리에 있는 두 플레이트의 A1 좌표에 맞춥니다.

직사각형 한천 플레이트에 A1 좌표의 위치를 표시합니다. 복제기 핀을 살균하려면 핀을 250ml의 0.3-0.5%차아염소산나트륨에 30초 동안 담그십시오. 복제기를 살짝 두드려 여분의 액체를 제거하고 핀을 250ml의 멸균 초순수에 10초 동안 담근 다음 250ml의 70% 에탄올을 30초 동안, 250ml의 95% 에탄올을 2분 동안

화염 복제기를 분젠 버너 불꽃에 수직으로 잡고 에탄올이 점화될 때까지 화염에 천천히 접근한 다음 즉시 화염에서 빼내어 복제기 핀을 살균합니다. 불꽃은 모든 에탄올이 타면 꺼집니다. 멸균 LB 한천이 들어 있는 사용하지 않는 직사각형 플레이트에 30초 동안 핀을 고정하여 핀을 식힙니다.

리플리케이터 핀이 냉각되는 동안 PA14NR 세트 마스터 플레이트의 알루미늄 씰을 손으로 잠시 데운 다음 씰이 플레이트를 다시 건드리지 않도록 조심스럽게 떼어냅니다. 핀셋을 사용하여 알루미늄 씰의 잔여물을 떼어냅니다. 리플리케이터 핀을 마스터플레이트에 삽입하고 리플리케이터를 네 방향 모두로 부드럽게 밀고 스윙하여 핀이 96개의 웰 각각에 있는 동결된 박테리아 배양물과 접촉하도록 합니다.

플레이트의 가장자리에 위치한 웰의 얼어붙은 배양물에 대해 리플리케이터 핀을 밀어 플레이트의 바깥쪽 가장자리에 위치한 웰에 특히 주의하십시오. 리플리케이터 핀을 한천 플레이트 표면에 부드럽게 놓습니다. 복제기를 약간의 원을 그리며 움직여 각 돌연변이 균주에 대해 약 4-5mm의 많은 잔디밭을 형성합니다.

PA14NR 세트 마스터 플레이트를 새로운 멸균 알루미늄 씰로 밀봉합니다. 플레이트 롤러를 사용하여 각 웰과 플레이트의 가장자리가 완전히 밀봉되었는지 확인합니다. 96웰 마스터플레이트를 드라이아이스로 되돌립니다.

PA14NR 세트를 취급한 후 모든 작업 표면을 70% 에탄올로 닦습니다. 복제된 한천 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 밤새 배양합니다. 이 절차를 시작하기 전에 층류 후드에 불필요한 장비가 없는지 확인하고 최소 10분 동안 후드 송풍기를 켜십시오.

후드 표면과 후드에 놓인 모든 품목을 70% 에탄올을 사용하여 닦습니다. 50-1200 마이크로 리터 12 채널 전자 피펫을 사용하여 12 밀리리터 깊이의 웰 블록의 각 웰에 적절한 항생제가 함유 된 525 마이크로 리터의 LB 액체 육수를 채 웁니다. 그런 다음 층류 후드에서 제거하기 전에 깊은 우물 블록을 밀봉하십시오.

다음으로, 채워진 매체 딥 웰 블록을 에탄올 와이프 벤치 탑으로 옮깁니다. 벤치탑에 분젠 버너가 있는 멸균 필드를 만들고 복제기 핀 멸균을 위한 적절한 솔루션이 있는 용기를 설정합니다. 앞에서 설명한 대로 리플리케이터 핀을 각 용액에 담그십시오.

리플리케이터 핀을 화염 살균합니다. 그런 다음 LB 한천이 들어 있는 사용하지 않는 직사각형 플레이트에 30초 동안 고정하여 핀을 식힙니다. 성장한 돌연변이 균주가 포함된 한천 플레이트에 복제기 핀을 부드럽게 놓고 핀이 한천 플레이트의 96개 돌연변이 모두와 접촉하고 있는지 확인합니다.

그런 다음 LB 액체 육수가 들어 있는 깊은 우물에 핀을 5-10초 동안 담그십시오. 핀으로 우물의 측면을 만지지 마십시오. 깊은 웰 블록을 멸균 통기성 밀봉 멤브레인으로 밀봉합니다.

플레이트 롤러를 사용하여 각 개별 웰이 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오. PA70NR 세트를 취급한 후 14% 에탄올로 모든 작업 표면을 닦습니다. 접종된 액체 배양액을 섭씨 37도 및 950rpm의 고속 셰이커에서 15-16시간 동안 성장시킵니다.

층류 후드를 청소하고 최소 10분 동안 후드 송풍기를 켜는 것으로 시작합니다. 모든 후드 표면과 후드에 놓인 모든 품목을 70% 에탄올로 닦습니다. 플라스틱 랩에서 96웰 플레이트를 제거합니다.

각 플레이트의 플레이트 라벨을 떼어내고 대상 플레이트의 A1 - H1 웰에 가장 가까운 플레이트 가장자리를 따라 놓습니다. 대상 플레이트의 뚜껑을 살짝 들어 올리고 라벨을 아래쪽 가장자리에 놓으면 플레이트가 뚜껑으로 덮일 때 라벨이 표시됩니다. 고속 셰이커에서 깊은 웰 블록을 제거하고 블록을 멸균 층류 후드로 옮깁니다.

통기성 밀봉 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 알루미늄 밀봉으로 교체하십시오. 응결을 모으기 위해 매우 낮은 속도로 깊은 우물 블록을 회전시킵니다. 배양물을 최종 플레이트로 옮기는 것은 잠재적인 웰 간 오염에 대한 가장 큰 위험을 초래하기 때문에 멸균 상태를 유지하기 위한 모든 절차를 주의 깊게 따르는 것이 중요합니다.

깊은 웰 블록을 멸균 후드로 되돌립니다. 50-1200 마이크로리터 12채널 전자 피펫과 멸균 여과 팁을 사용하여 각 웰에 525 마이크로리터의 글리세롤 LB 액체 육수 혼합물을 추가합니다. 전자 피펫으로 300 마이크로리터를 위아래로 세 번 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.

물이 떨어지는 것을 방지하기 위해 팁을 주입하기 전에 팁을 웰 측면에 만지십시오. 새로운 멸균 여과 팁으로 피펫을 다시 장착하고 다음 웰 열을 글리세롤 LB 액체 육수 혼합물로 채웁니다. 모든 웰에 글리세롤 LB 액체 육수 혼합물을 채운 후 12채널 전자 피펫과 여과된 팁을 사용하여 딥 웰 블록의 각 행에서 900마이크로리터의 글리세롤 돌연변이 배양 혼합물을 끌어올리고 대상 플레이트에서 해당 행의 웰에 150마이크로리터를 분배하여 라이브러리 플레이트의 사본 6개를 생성합니다.

멸균 알루미늄 씰을 사용하여 각 96웰 목적지 플레이트를 덮고 플레이트 롤러를 사용하여 플레이트 가장자리와 모든 웰을 완전히 밀봉합니다. 라벨 식별자를 알루미늄 씰로 덮지 마십시오. 후드에서 밀봉된 플레이트를 제거하고 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 평평하고 평평한 표면에 놓습니다.

라이브러리를 취급한 후 70% 에탄올로 모든 작업 표면을 닦아냅니다. 이 비디오에서 시연된 프로토콜을 사용하여 사전 설정된 패턴으로 삽입된 우물 유형 PA14 접종 및 접종되지 않은 웰로 구성된 대조판을 포함한 PA14NR 세트의 12개 사본을 복제했습니다. 대조판은 예상되는 성장 패턴의 존재를 확인하기 위해 LB 한천 플레이트에 복제한 후 육안으로 검사되었습니다.

PA14NR 세트의 새로 생성된 사본 중 하나에서 38개의 돌연변이 균주를 무작위로 선택하고 임의의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하여 트랜스포손 돌연변이의 정체를 확인했습니다. DNA 조각의 후속 염기서열 분석은 테스트된 38개의 돌연변이 중 35개의 돌연변이 동일성을 확인했습니다. 마스터링되면 전체 라이브러리를 복제하는 데 약 80시간이 걸립니다.

이 프로토콜을 사용하는 동안 항상 작업 영역의 살균 상태를 염두에 두는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 P14NR 세트 또는 기타 박테리아 라이브러리의 고품질 복사본을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 슈도모나스로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 프로토콜을 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

이 프로토콜은 Pseudomonas aeruginosa PA14 비중복 돌연변이 라이브러리를 보존하며, 이는 고처리량 스크리닝뿐만 아니라 대부분의 녹농균 유전자에서 개별 돌연변이의 공급원으로서 계속해서 중요한 자원이 되고 있습니다.