Name: 주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 배우세요 Pseudomonas aeruginosa PA14NR 돌연변이 라이브러리 복제 방법을. 오염 방지와 품질 관리를 포함한 상세한 단계별 프로토콜을 통해 고품질 복제본을 생성하고, 다른 세균 라이브러리에도 적용 가능한 기술을 습득하세요.

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우리 데이터베이스 검색에 그녀의 지도 대 한 MGH 트레드웰 가상 라이브러리의 리사 Philpotts를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 낭 성 섬유 증 기초 (YONKER16G0 및 HURLEY16G0) 및 NIH NIAID에 의해 지원 되었다 (BPH와 에이드: R01 A1095338).

저자는 금융 충돌의 관심을 보고. 엘리 아나 Drenkard와 프레드릭 Ausubel PA14 비중복 transposon 돌연변이 라이브러리 생성에 참가. 브라이언 헐리 Lael Yonker 현재 집와 매사 추세 츠 종합 병원에서 소아과의 부의 일환으로 돌연변이 라이브러리를 배포.

P. 녹 농 균 PA14NR 설정 하는 것은 과학계에 대 한 귀중 한 자원 이다. Clarivate 분석의 중요 과학 지표 데이터베이스, Liberati 그 외 여러분 에서 3 월 2017 데이터 집합에 따라 (2006 년) 37, PA14NR 설정의 건설을 설명 하는 미생물학 간행물의 최고 1%에서 평가 된다. Google 학술 검색 보고 Liberati 그 외 여러분 의 600 인용 (2006 년) 8 월 2017로 원래 원고. 라이브러리는 elucidating P. 농 균 병 기본 메커니즘에서 중요 한 역할을 했다. 중요 한 것은, 96-잘 플레이트 형식 PA14NR 설정의 높은 처리량 유전 스크린을 P의 다양 한 연구 설계를 촉진 한다. 녹 농 균 돌연변이 고기44,,<sup class=...

녹 농 균 phenotypically 및 genotypically 다양 하 고 융통성 있는 그람 음성 박테리아 피부 microflora 뿐만 아니라 토양, 물, 그리고 가장 인간의 환경에 이다. 많은 세균성 종에 비해, P. 농 균 는 5.5-7 Mbp 콘텐츠 높은 G + c (65-67%)의 비교적 큰 게놈. 또한, 그것의 유전자의 상당한 비율이 변화 적응성에 참여 하 고 환경 스트레스1에 응답에 큰 유연성을 허용 하는 규제 네트워크의 부분 이다. P. 녹 농 균 독성 요인의 과다를 표현, 양식 biofilms proclivity를 전시, 통해 경로 감지 하는 여러 개의 쿼럼 응답을 조정 하는 능력을 보유 하 고 및 항생제 저항을 개발 하는 주목할 만한 용량을 표시 그리고 허용 오차2,3,,45,6,7,8. 이러한 특성 P. 녹 농 균에 한 감염 치료에 대 한 상당한 도전을 제시.
만성 피. 녹 농 균 감염 수많은 질병 상태에서 발생할 수 있습니다. 낭 성 섬유 증 (CF), 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 유전자의 돌연변이 의해 발생 하는 유전 질환 inspissated, 감염 된 분 비는 기도 내에서 결과 진보적인 기관지 확장 증 및 궁극적으로, 죽음 호흡기 장애9에서. 성인,으로 CF와 환자의 대다수는 피 녹 농 균, 병 적 상태와 사망률이 질병10와 관련 된 중요 한 역할을 만성 감염. 또한, 심한 화상 부상11, tracheostomies12, 공동 교체13또는 내재 카 테 터14 환자 양식 하는 박테리아의 기능에 관련 된 피 녹 농 균 감염에 대 한 위험에 노출 되어 biofilms 및 탈출 선 동적인 응답15호스트. 또한, 식민 경쟁 없이 선택한 후 발생 합니다 다중 항생제 내성 또는 내성 인구는 넓, 순차 항균 치료12,,1617 를 통해 , 18. 수많은 질병 상태에 대 한 중요 한 의미를 해야한다 더 나은 피 녹 농 균 의 병 인을 이해.
PAO1 PA103, PA14, 박세리, 종자를 포함 한 여러 피 농 균 임상 격리, 있다 P. 농 균 병의 다양 한 기능을 조사 하기 위해 광범위 하 게 연구 되었습니다. 긴장 PA1420 가장 일반적인 클론 그룹 전세계19,중 하나에 속해 하 고 실험실에서 광범위 하 게 passaged 하지은 임상 분리 이다. PA14is 매우 주목할 만한 내과 감염의 척추 모델에 악성 프로21, pili 구조22, pathogenicity 제도23, 유형 III 분 비 체계 (TTSS), 포유류 쪽으로 세포 독성 세포24 과 항생제 저항과 지 속성25프로 파일. 또한, PA14 또한 매우 다양 한 호스트 병원 체 모델 시스템에서 악성, 식물 잎 등 침투 모델26,27,꼬마 선 충 감염 모델28, 29, 곤충30,31, 모델 뿐 아니라 마우스 폐 렴 모델32,33 및 피부 화상 모델34.
게놈 넓은 돌연변이 라이브러리는 게놈 규모의 유전자 기능 분석을 함으로써 유 기체의 생물학을 이해 하는 매우 강력한 도구를 구성 하는 불필요 한 유전자에 있는 isogenic 돌연변이의 컬렉션입니다. 2 채도 근처 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 P. 녹 농 균 에 배포에 대 한 현재 사용할 수 있습니다. transposons의 삽입 사이트 두 라이브러리에 대 한 결정 되었습니다. 이러한 소위 비중복 라이브러리는 시간을 상당히 줄여 세균성 긴장의 게놈 넓은 연구를 촉진 하 고 비용에 관련 된 심사 새롭거나 임의의 transposon 돌연변이. P. 농 균 PAO1 transposon 돌연변이 라이브러리는 MPAO1에 스트레인 PAO1 transposons IS를 사용 하 여phoA/ 하 분리 이며lacZ/하35, Manoil 연구소, 워싱턴 대학으로 큐레이터 이다. 시퀀스 확인 컬렉션 9,437 transposon 돌연변이의 게놈 넓은 범위를 제공 하 고 대부분 유전자36두 돌연변이 포함 하는 도서관에 의하여 이루어져 있다. P. 농 균 PAO1 transposon 돌연변이 라이브러리에 대 한 정보 공개, 인터넷에서 액세스할 수 있는 Manoil 연구소 웹사이트 http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm에서 제공 됩니다. P. 농 균 스트레인 비중복 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 (PA14NR 설정) 스트레인 PA14 transposons MAR2xT7 및 테네시phoA를 사용 하 여37 에 현재 소아과의 부에 의해 배포 됩니다 PA14 매사 추세 츠 종합 병원. PA14NR 설정 불필요 한 유전자37에 단일 transposon 삽입과 이상의 5800 돌연변이의 컬렉션으로 구성 됩니다. PA14NR 설정의 건설에 대 한 내용은 온라인 검색 도구는 PA14NR의 사용을 촉진 하는 다양 한 포함 공공, 인터넷에서 액세스할 수 있는 사이트 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB에 설명 되어 있습니다. 설정 합니다.
원래 PA14NR 설정 5,459 돌연변이, 약 34000 임의의 transposon 삽입 돌연변이, 모든 예측된 PA14 유전자37의 77%를 대표 하는 4,596 예측된 PA14 유전자에 해당 하는 포괄적인 라이브러리에서 선택한 구성. 2006 년에 도서관의 건설 이후 새로운 돌연변이 추가 되었습니다, 그리고 현재 약 4600 PA14 유전자를 나타내는 이상 5800 뮤턴트38 포함 PA14NR 설정. PA14 transposon 돌연변이의 대다수는 야생 타입 배경37에서 생성 되었다. 유전적 배경를 포함 하 여 돌연변이 도서관의 각 구성원에 관한 자세한 사항은 온라인 데이터베이스 검색을 통해 또는 비중복 라이브러리 스프레드시트 (http:// PA14 웹 사이트에서 사용할 수 있는 두 기능을 다운로드 하 여 사용할 수 pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi)입니다. 돌연변이의 대다수는 MAR2xT7를 사용 하 여 만들어진 TnPhoA (phoA) transposon37을 사용 하 여 만든 작은 세트 (MrT7) transposon. 각 transposon gentamicin (MrT7) 또는 대 (phoA)를 사용 하 여 돌연변이 선택할 수 있는 항생제 저항 카세트를, 있다. 돌연변이의 PA14NR 세트 63 96 잘 접시에 저장 되어 있는 야생 타입 PA14 이루어져 있는 접시, 주사 하는 두 개의 추가 96-잘 제어를 포함 하 고 사전 설정 된 패턴에 삽입 된 uninoculated 우물. 온라인 검색 도구와 크게 결합 96 잘 접시 형식 심사 분석 사용자가 돌연변이 고기와 관련 된 유전자를 쉽게 식별할 수 있도록 사용자 지정 개발을 촉진 한다. 온라인 검색 도구는 또한 검색 및 추가 연구에 필요한 추가 관련 돌연변이의 선택을 용이 하 게.
PA14 및 PAO1 transposon 돌연변이 라이브러리는 사회 과학에 대 한 매우 중요 한 전역 리소스 그리고 그들은 알 수 없는 유전자의 기능과이 세균성 병원 체의 경로 유효성 검사에서 서로 보완. 공교롭게도, PAO1 및 PA14 transposon 돌연변이 라이브러리의 건설 이후 많은 피 농 균 분리의 전체 게놈 DNA 시퀀싱 분석이 나타났습니다 PAO1와 PA14 피 녹 농 균의 다른 주요 subclades에 속한다 계통7,39,,4041. 임상 P. 농 균 분리 하기 때문에 발견 계통, PAO1 및 PA14 다른 피 녹 농 균 에 속하는 사실 전역 배포 하위 비교에 대 한 두 개의 transposon 돌연변이 라이브러리의 가치를 향상 시킵니다. 연구입니다.
간행물 건축을 설명 하 고 세균성 돌연변이 라이브러리, P. 농 균 라이브러리35,등의 상영37,42, 문학에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리의 지식 최선을 아니 게시 프로토콜 설명 하는 자세한 절차와 기술을 복제, 사용 유지 보수 및 세균성 돌연변이 라이브러리의 유효성 검사 사용할 수 있습니다.
이 책에서 설명 하는 방법론 사용을 촉진 하는 세 가지 프로토콜의 집합 및 PA14NR 설정의 유지 관리에 설명 합니다. PA14NR 설정의 받는 사람에 게 권장 하는 대로 첫 번째 프로토콜 라이브러리의 복제를 설명 합니다. 두 번째 프로토콜 질주, 성장, 및 PA14NR 설정 사용 하 여 식별 하는 개별 돌연변이 저장에 대 한 지침을 포함 합니다. 세 번째 프로토콜 transposon 돌연변이에서 파편의 PCR 증폭 등 돌연변이 정체성을 확인 하는 후속 시퀀싱 품질 관리 기법을 설명 합니다. 프로토콜의이 세트는 복제 및 기타 세균성 돌연변이 라이브러리 또는 컬렉션의 유지 보수에 대 한 적응 하지 수도 있습니다. 세균성 돌연변이 라이브러리 또는 컬렉션의 복제 "마스터 복사"의 무결성을 유지 하기 위해 매우 좋습니다 (원래 사본을 받았다). 일상적인 실험실 사용을 위해 설정 하는 PA14NR의 여러 복사본의 복제 마스터 복사본의 interwell 오염의 가능성을 최소화합니다.

<table><tbody><tr><td>Materials for Library Replication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353072</td><td>via Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000&mu; L 딥 웰 플레이트,</td><td>Fisher Scientific</td>Nunc OmniTray를 통한 25 <td>Corning Life Sciences</td><td>3960</td></tr><tr><td>케이스(직사각형 플레이트),</td> Fisher Scientific Rectangular Ice Pan<td>을 통한</td>60 <td>Thermo Scientific Rochester</td><td>242811</td> 케이스</tr><tr><td>, Midi(4L)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>432104</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Secure-Gard Cone Mask 케이스, Fisher를 통한 300</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7509</td> 케이스 <td> Scientific</td></tr><tr><td>AluminaSeal,</td><td>Fisher Scientific</td>Breathe-Easy 멤브레인을 통한 100개의 <td>다양한 생명공학</td><td>ALUM-100</td></tr><tr>팩, <td>Sigma-Aldrich</td>멸균을 통한<td>100</td>개의 <td>다양한 생명공학</td><td>BEM-1</td> 팩</tr><tr><td>, 개별 포장, 50mL 용액 트로프/시약 저장소,</td><td>Westnet Incorporated 플레이트 롤러를 통한</td>100 <td>Sorenson</td><td>S50100</td> 케이스</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>60941-118</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Cryo Laser Labels를 통해 - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", 16매 팩</td><td>GA International</td><td>RCL-11T1-WH</td><td>via Labtag.com(Labtag.com 에서도 인쇄 템플릿 사용 가능)</td></tr><tr><td>96-well replicator</td><td>V & P 사이언티픽, Inc.</td><td>사용자 정의 407C, 3.18mm 핀 직경, V 및 를 통해 57mm 길이</td><td> P 사이언티픽, Inc.</td></tr><tr><td>Multitron Pro, 3mm 쉐이킹 인큐베이터</td><td>Infors HT</td><td>l10003P</td><td>via Infors HT</td></tr><tr><td>Picus 12 채널 50-1200&mu; L 전자 피펫</td><td>Sartorius</td><td>735491PR</td><td>via Sartorius</td></tr><tr><td>필터 팁 50-1200&mu; L, 960</td><td>Biohit</td><td>14-559-512</td> 팩을 <td>통해 Fisher Scientific; 전자 다중 채널 호환 팁 사용</td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td>사용자 특정 공급업체<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>개별 돌연변이 저장을 위한 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>피펫(P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>via Gilson</td></tr><tr><td>Materials for Quality Control PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>돔형 뚜껑이 있는 Omnistrips PCR 튜브</td><td>Fisher</td><td>Scientific</td>ART Barrier 저잔류 피펫 팁(10 uL, 100 uL, 1000 uL)을 통한 Thermo Scientific <td>AB0404Molecular</td></tr> <tr><td></td><td>BioProducts, Inc.</td><td>Z676543(10 uL), Z676713(100 uL), Z676802(1000 uL)</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Pipettes (P1000, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>via Fisherbrand</td></tr><tr><td>프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MasterPure DNA Purification Kit</td><td>Epicentre</td><td>MCD85201</td><td>via Epicentre Technologies Corp</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ThermoFisher를 통한 즉시 사용 가능한</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>RediLoad 로딩 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>750026</td><td>ThermoFisher를 통한 ThermoFisher</td></tr><tr><td>Chemicals</strong<></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Chemicals 라이브러리 및 개별 돌연변이 저장</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol MB Grade, 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr>1L dH2O당 Sigma-Aldrich<td>LB 육수를</td><td></td><td></td> 통한 G5516<td>: 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 1ml 1N NaOH(분자 생물학의 현재 프로토콜.&nbsp; Wiley, 1994.)</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>시그마 알드리치</td><td>T7293</td><td>비아 시그마-알드리치</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>시그마 알드리치</td><td>Y1625</td><td>비아 시그마-알드리치</td></tr><tr><td>소듐 클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7653</td><td>시그마-알드리치</td></tr> 수<tr><td>산화나트륨</td><td>시그마 알드리</td>치 <td>S8045</td><td>비아 시그마-알드리치</td></tr><tr><td>LB&nbsp; 한천</td><td></td><td></td><td>위의 준비를 참조하시고, 15g 바토 한천을 추가하십시오.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate, 10g</td><td>BioReagent</td><td>1405-41-0</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Ethanol, 190 proof</td><td>Decon</td><td>04-355-221</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chemicals for Quality Control PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프라이머</td><td>사용자 선호 공급업체</td><td></td><td>표 3에 나열된 프라이머 참조</td></tr><tr><td>Corning cellgro Molecular Biology Grade Water</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td>via Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Taq 중합효소 완충액</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소, 재조합</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>시그마</td><td>A9539</td> via <td>Sigma-Aldrich</td></tr></tbody></table>

주문, 녹 농 균 스트레인 pa14 transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

녹 농 균 phenotypically 및 genotypically 다양 하 고 융통성 있는 그람 음성 박테리아 인간의 환경에서 유비 쿼터 스입니다. P. 녹 농 균 은 biofilms 형성, 항생제 내성, 독성 요인, 생산 및 만성 감염 동안 빠르게 진화 수 있습니다. 따라서 피 녹 농 균 하면 둘 다 급성과 만성, 감염, 치료 하기 어려운 특정 환자 인구에 있는 중요 한 병 적 결과. P. 농 균 스트레인 PA14 다양 한 포유류 및 nonvertebrate 호스트 만들기 PA14이 병원이 체를 공부에 대 한 매력적인 스트레인 감염 보존된 게놈 구조와 인간의 임상 분리 이다. 2006 년에, 4,596 예측된 PA14 유전자에 해당 하는 5,459 돌연변이 포함 하는 비중복 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 생성 되었습니다. 그 이후, PA14 라이브러리의 연구 커뮤니티 개별 유전자의 기능 및 복잡 한 경로 P. 녹 농 균의 더 나은 이해를 허용 했다. 복제 프로세스를 통해 도서관 무결성의 유지 관리는 적절 한 처리 및 정확한 기술을 필요합니다. 이 위해,이 원고 도서관 복제, 라이브러리 품질 관리 및 개별 돌연변이의 적절 한 저장소에 단계가 자세히 설명 하는 프로토콜을 제공 합니다.

PA14NR 설정의 12 개의 새로운 복사본, 그리고 생성 하는 새 복사본의 품질 관리 평가 프로토콜 III를 사용 하 여 실시 하는 프로토콜을 사용 하 여 복제 했다.
PA14NR 설정 컨트롤 플레이트, 야생 형식 PA14로 구성 된 함께 돌연변이 판 주사 및 미리 설정 된 패턴 (그림 4A)에 삽입 된 웰 스 uninoculated, 복제 된 methology 프로토콜 I. 제어에 설명 된 다음 접시는 포함 에 판 복제를 수행할 때 가능한 interwell 오염 평가를 PA14NR 설정 합니다. 또한, 제어 플레이트는 transposon 삽입 돌연변이 포함 하는 접시에 액세스 하기 전에 연습 복제 기법을 사용할 수 있습니다. 컨트롤 플레이트의 성장 했다 파운드 한 천 배지 및 야간 보육 예상된 성장 패턴 (...

녹 농 균 감염에 취약 한 호스트 중요 한 병 적 상태를 발생합니다. P. 농 균 스트레인 PA14NR 설정으로 지정 하는 PA14의 비중복 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 수많은 프로세스에서 유전자 기능 분석을 촉진 한다. 여기에 제시 된 높은 품질 PA14NR 설정 돌연변이 라이브러리의 복사본을 생성 하는 프로토콜이입니다.

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 PA14NR 세트라고 하는 녹농균 균주 PA14의 주문된 비중복 전이 돌연변이 라이브러리의 고품질 사본을 생성하는 것입니다. 이 프로토콜은 복제 중에 PA14NR 세트의 무결성을 보존하여 이 라이브러리의 고품질 복사본을 생성합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 라이브러리 복제, 품질 관리 및 개별 돌연변이의 적절한 저장과 관련된 모든 단계에 대한 자세한 설명을 제공한다는 것입니다.이 프로토콜은 P14NR 세트를 복제하도록 설계되었지만 다른 박테리아 라이브러리를 복제하도록 조정할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 복제 과정 중 오염의 위험 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 따라서 이 프로토콜은 이러한 위험을 줄이기 위한 자세한 단계별 지침을 제공합니다.우리 실험실은 PA14NR 세트를 글로벌 과학계에 배포합니다. 또한 최종 사용자가 라이브러리를 복제하는 것이 좋습니다. 지침을 제공하기 위해 라이브러리의 고품질 복사본을 생성하는 방법을 자세히 설명하는 프로토콜을 제공합니다.이 프로토콜의 시각적 시연은 특히 교차 오염을 방지하도록 설계된 단계에서 매우 중요합니다. 자기 보호와 박테리아 배양 보호를 위해 PA14NR 세트로 지정된 P aeruginosa 균주 PA14의 비중복 전이 삽입 돌연변이 라이브러리를 취급할 때는 항상 실험실 가운, 장갑 및 마스크를 착용해야 합니다. 용융된 LB 한천을 약 60밀리리터를 직사각형 플레이트에 부어 LB 한천 플레이트를 준비합니다.사용하기 전에 멸균 후드에서 플레이트를 약 1시간 동안 건조시키십시오. 에탄올 와이프 벤치 탑에 분젠 버너로 멸균 필드를 만듭니다. 그리고 리플리케이터 핀 멸균을 위한 적절한 솔루션이 있는 용기를 설정하십시오.영하 80도의 냉동고에서 PA14NR 세트 마스터 플레이트를 꺼내 4리터 얼음 팬에 드라이아이스에 올려 놓습니다. 드라이 아이스에서 복제할 96웰 마스터플레이트를 가져와 벤치에 올려 잠시 해동할 수 있도록 합니다. 마스터 플레이트와 한천 플레이트를 왼쪽 상단 모서리에 있는 두 플레이트의 A1 좌표에 맞춥니다.직사각형 한천 플레이트에 A1 좌표의 위치를 표시합니다. 복제기 핀을 살균하려면 핀을 250ml의 0.3-0.5%차아염소산나트륨에 30초 동안 담그십시오. 복제기를 살짝 두드려 여분의 액체를 제거하고 핀을 250ml의 멸균 초순수에 10초 동안 담근 다음 250ml의 70% 에탄올을 30초 동안, 250ml의 95% 에탄올을 2분 동안 담그십시오.화염 복제기를 분젠 버너 불꽃에 수직으로 잡고 에탄올이 점화될 때까지 화염에 천천히 접근한 다음 즉시 화염에서 빼내어 복제기 핀을 살균합니다. 불꽃은 모든 에탄올이 타면 꺼집니다. 멸균 LB 한천이 들어 있는 사용하지 않는 직사각형 플레이트에 30초 동안 핀을 고정하여 핀을 식힙니다.리플리케이터 핀이 냉각되는 동안 PA14NR 세트 마스터 플레이트의 알루미늄 씰을 손으로 잠시 데운 다음 씰이 플레이트를 다시 건드리지 않도록 조심스럽게 떼어냅니다. 핀셋을 사용하여 알루미늄 씰의 잔여물을 떼어냅니다. 리플리케이터 핀을 마스터플레이트에 삽입하고 리플리케이터를 네 방향 모두로 부드럽게 밀고 스윙하여 핀이 96개의 웰 각각에 있는 동결된 박테리아 배양물과 접촉하도록 합니다.플레이트의 가장자리에 위치한 웰의 얼어붙은 배양물에 대해 리플리케이터 핀을 밀어 플레이트의 바깥쪽 가장자리에 위치한 웰에 특히 주의하십시오. 리플리케이터 핀을 한천 플레이트 표면에 부드럽게 놓습니다. 복제기를 약간의 원을 그리며 움직여 각 돌연변이 균주에 대해 약 4-5mm의 많은 잔디밭을 형성합니다.PA14NR 세트 마스터 플레이트를 새로운 멸균 알루미늄 씰로 밀봉합니다. 플레이트 롤러를 사용하여 각 웰과 플레이트의 가장자리가 완전히 밀봉되었는지 확인합니다. 96웰 마스터플레이트를 드라이아이스로 되돌립니다.PA14NR 세트를 취급한 후 모든 작업 표면을 70% 에탄올로 닦습니다. 복제된 한천 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 밤새 배양합니다. 이 절차를 시작하기 전에 층류 후드에 불필요한 장비가 없는지 확인하고 최소 10분 동안 후드 송풍기를 켜십시오.후드 표면과 후드에 놓인 모든 품목을 70% 에탄올을 사용하여 닦습니다. 50-1200 마이크로 리터 12 채널 전자 피펫을 사용하여 12 밀리리터 깊이의 웰 블록의 각 웰에 적절한 항생제가 함유 된 525 마이크로 리터의 LB 액체 육수를 채 웁니다. 그런 다음 층류 후드에서 제거하기 전에 깊은 우물 블록을 밀봉하십시오.다음으로, 채워진 매체 딥 웰 블록을 에탄올 와이프 벤치 탑으로 옮깁니다. 벤치탑에 분젠 버너가 있는 멸균 필드를 만들고 복제기 핀 멸균을 위한 적절한 솔루션이 있는 용기를 설정합니다. 앞에서 설명한 대로 리플리케이터 핀을 각 용액에 담그십시오.리플리케이터 핀을 화염 살균합니다. 그런 다음 LB 한천이 들어 있는 사용하지 않는 직사각형 플레이트에 30초 동안 고정하여 핀을 식힙니다. 성장한 돌연변이 균주가 포함된 한천 플레이트에 복제기 핀을 부드럽게 놓고 핀이 한천 플레이트의 96개 돌연변이 모두와 접촉하고 있는지 확인합니다.그런 다음 LB 액체 육수가 들어 있는 깊은 우물에 핀을 5-10초 동안 담그십시오. 핀으로 우물의 측면을 만지지 마십시오. 깊은 웰 블록을 멸균 통기성 밀봉 멤브레인으로 밀봉합니다.플레이트 롤러를 사용하여 각 개별 웰이 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오. PA70NR 세트를 취급한 후 14% 에탄올로 모든 작업 표면을 닦습니다. 접종된 액체 배양액을 섭씨 37도 및 950rpm의 고속 셰이커에서 15-16시간 동안 성장시킵니다.층류 후드를 청소하고 최소 10분 동안 후드 송풍기를 켜는 것으로 시작합니다. 모든 후드 표면과 후드에 놓인 모든 품목을 70% 에탄올로 닦습니다. 플라스틱 랩에서 96웰 플레이트를 제거합니다.각 플레이트의 플레이트 라벨을 떼어내고 대상 플레이트의 A1 - H1 웰에 가장 가까운 플레이트 가장자리를 따라 놓습니다. 대상 플레이트의 뚜껑을 살짝 들어 올리고 라벨을 아래쪽 가장자리에 놓으면 플레이트가 뚜껑으로 덮일 때 라벨이 표시됩니다. 고속 셰이커에서 깊은 웰 블록을 제거하고 블록을 멸균 층류 후드로 옮깁니다.통기성 밀봉 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 알루미늄 밀봉으로 교체하십시오. 응결을 모으기 위해 매우 낮은 속도로 깊은 우물 블록을 회전시킵니다. 배양물을 최종 플레이트로 옮기는 것은 잠재적인 웰 간 오염에 대한 가장 큰 위험을 초래하기 때문에 멸균 상태를 유지하기 위한 모든 절차를 주의 깊게 따르는 것이 중요합니다.깊은 웰 블록을 멸균 후드로 되돌립니다. 50-1200 마이크로리터 12채널 전자 피펫과 멸균 여과 팁을 사용하여 각 웰에 525 마이크로리터의 글리세롤 LB 액체 육수 혼합물을 추가합니다. 전자 피펫으로 300 마이크로리터를 위아래로 세 번 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.물이 떨어지는 것을 방지하기 위해 팁을 주입하기 전에 팁을 웰 측면에 만지십시오. 새로운 멸균 여과 팁으로 피펫을 다시 장착하고 다음 웰 열을 글리세롤 LB 액체 육수 혼합물로 채웁니다. 모든 웰에 글리세롤 LB 액체 육수 혼합물을 채운 후 12채널 전자 피펫과 여과된 팁을 사용하여 딥 웰 블록의 각 행에서 900마이크로리터의 글리세롤 돌연변이 배양 혼합물을 끌어올리고 대상 플레이트에서 해당 행의 웰에 150마이크로리터를 분배하여 라이브러리 플레이트의 사본 6개를 생성합니다.멸균 알루미늄 씰을 사용하여 각 96웰 목적지 플레이트를 덮고 플레이트 롤러를 사용하여 플레이트 가장자리와 모든 웰을 완전히 밀봉합니다. 라벨 식별자를 알루미늄 씰로 덮지 마십시오. 후드에서 밀봉된 플레이트를 제거하고 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 평평하고 평평한 표면에 놓습니다.라이브러리를 취급한 후 70% 에탄올로 모든 작업 표면을 닦아냅니다. 이 비디오에서 시연된 프로토콜을 사용하여 사전 설정된 패턴으로 삽입된 우물 유형 PA14 접종 및 접종되지 않은 웰로 구성된 대조판을 포함한 PA14NR 세트의 12개 사본을 복제했습니다. 대조판은 예상되는 성장 패턴의 존재를 확인하기 위해 LB 한천 플레이트에 복제한 후 육안으로 검사되었습니다.PA14NR 세트의 새로 생성된 사본 중 하나에서 38개의 돌연변이 균주를 무작위로 선택하고 임의의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하여 트랜스포손 돌연변이의 정체를 확인했습니다. DNA 조각의 후속 염기서열 분석은 테스트된 38개의 돌연변이 중 35개의 돌연변이 동일성을 확인했습니다. 마스터링되면 전체 라이브러리를 복제하는 데 약 80시간이 걸립니다.이 프로토콜을 사용하는 동안 항상 작업 영역의 살균 상태를 염두에 두는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 P14NR 세트 또는 기타 박테리아 라이브러리의 고품질 복사본을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 슈도모나스로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 프로토콜을 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.이 프로토콜은 Pseudomonas aeruginosa PA14 비중복 돌연변이 라이브러리를 보존하며, 이는 고처리량 스크리닝뿐만 아니라 대부분의 녹농균 유전자에서 개별 돌연변이의 공급원으로서 계속해서 중요한 자원이 되고 있습니다.

replication-ordered-nonredundant-library-pseudomonas-aeruginosa

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Kazi, M. I., et. al., 고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에서 트랜스포존 삽입 라이브러리 생성. J. Vis. Exp. (2020년)이 비디오는 카나마이신 내성을 기반으로 트랜스포존 삽입을 운반하는 그람 음성 수용자 박테리아의 선택, 정량화 및 보존을 보여줍니다.

게놈 트랜스포존 삽입을 통한 그람 음성 박테리아의 분리

여기서 우리는, 화면 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기위한 미니 himar1 마리너 트랜스포존-매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 분리 및 프로토 타입 녹농균 스트레인 PAO1 참신한 알긴산 레귤레이터를 식별한다.

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em&gt; 녹농균</em&gt; 사용 미니<em&gt; himar1</em&gt; 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

여기 우리는 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할을 테스트 하는 실험 방법 제시.

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 다양한 유형의 운동성과 관련된 유전적 요인을 식별하기 위한 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에서 운동성 표현형을 관찰하기 위한 고처리량 방법

프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

배우세요 Pseudomonas aeruginosa PA14NR 돌연변이 라이브러리 복제 방법을. 오염 방지와 품질 관리를 포함한 상세한 단계별 프로토콜을 통해 고품질 복제본을 생성하고, 다른 세균 라이브러리에도 적용 가능한 기술을 습득하세요.

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

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