Name: 인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 인간 유도만능줄기세포 유래 신경세포를 이용한 96웰 고속 스트레치 부상 모델 제작 방법을. 이 기법은 신경외상 연구 및 고내용량 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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이 작품은 건강의 국가 학회 (R21NS098129)에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 됩니다. SueSan 첸, 조나단 탄, 코 티 카 나, 시 카이 니 Feng 위안 부, 누가 설계 및 구조 지원 고속 이미징 실험이이 원고에서 설명 하는 동안 사용 되는 조명 내장에서 우수한 기술 지원을 인정 하 고 싶습니다. .

<ol><li>Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+brain+injury+in+the+United+States%3A+emergency+department+visits%2C+hospitalizations%2C+and+deaths%2C+2002-2006%22">Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006</a>. , (2010).</li>
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<li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li>
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<li>Kang, W. H., Morrison, B. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li>
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<li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray%5BTitle%5D)+AND+%22Stapp+Car+Crash+J%22%5BJournal%5D)">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li>
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<li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li>
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<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

일관 된 취득의 열쇠, biofidelic 표현 형이이 모델에 일관 된 biofidelic 기계 모욕을 적용 합니다. 이 모델 기간이 10-15 ms와 유사한 시체 실험12,13에 따라 인간의 머리 영향에 대 한 펄스 기간 짧은 펄스를 생성할 수 있습니다. 이 모욕의 일관성 indenter 블록 플레이트의 맞춤은 indenters의 일관 된 윤 활에 따라 다릅니다. 때 indenter 블록 정렬 잘 있다 아무 추세 적용 된 스트레인에 행 또는 열 (그림 2C). 윤활제의 얇은 레이어는 일반적으로 두꺼운 층 마찰 만들고 점성 윤활제는 실리콘 파울 현미경 중 빛의 통로 방해 때문에 권장 하지 않습니다. 실제 무대 변위 진폭 수 짧은을 실질적으로 된 변위 진폭 때 많은 indenters을 사용 하 고 소정의 단계 변위 진폭 큰 (> 3 m m) 이다. 그러나, 실제 변위는 큰 진폭에 소정의 변위 보다, 하는 동안 반복 (그림 2B) 남아 있다. 따라서, 큰, 실제 변위 진폭 원하는 값 초과 된 값을 입력 하 여 안정적으로 얻을 수 있습니다. 변위 진폭 피크 막 스트레인, 병 리를 유도 기계 모욕을 직접 측정에 대 한 쉽게 기록 된 프록시 때문에 중요 합니다. 따라서, 단계 진지 변환에서 막 부담을 결정에 대 한 설명 하는 절차가 중요 합니다. 접시와 indenters, 예를 들어 다른 간의 상호 작용에 영향을 주는 시스템에 변경 내용이 있는 주요 경우이 프로세스를 반복 해야 직경 indenters, 다른 indenter 자료 또는 코팅, 실리콘의 종류 바닥된 플레이트 사용 됩니다. 각 실험의 시작에 indenter 블록을 재조정 하 고 제로 위치를 결정 하는 과정을 반복 한다. 스트레칭 장치의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. CAD 모델 장치를 재현 하는 데 필요한 보충 자료로 제공 됩니다: ' 부상 장치-전체 어셈블리-일반 3D. 단계 '; 제공 되는 자료의 관련된 법안으로보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치-BOM.xlsx. 또한 보충 테이블 2 96 잘 접시 _loader - 핀 배선 Diagram.xlsx, 시스템의 다양 한 구성 요소를 연결 하는 케이블 연결 설명 참조. 'Interconnector_circuit_board.dip'는 케이블을 상호 연결 하는 회로 보드에 설명 합니다.
여행 중간 근처 무대 장치를 비활성화 하는 경우 그것은 스프링 때문에 전원 차단 후 무대 이동 합니다. 전원이 복원 되 면 피드백 루프 마지막 알려진된 된 위치와 실제 위치 사이의 큰 차이 감지 합니다. 이 위치로 갑자기 이동 무대 장치가 비활성화 되었습니다 때 발생 합니다. 않으므로 주의 한다 그것은 그것의 전원이 꺼져 있는 휴식 여행 상단에 위치 하는 경우에 장치를 비활성화 하려면이 갑자기 모션 인코더의 출력에서 오류를 발생할 수 있습니다.
제조 클램프는 최적의 결합을 허용 하는 방식으로 함께 접시 신체와 실리콘 바닥을가지고 설계 되었습니다. 이 위해, 있는 세 가지 핵심 기능 추가 파일에서 제공 하는 디자인 ' 프레스 다이-일반 3D. 단계 '. 첫째, 클램프 플레이트 몸 홀더 실리콘 바닥에 평행 하다. 이 제대로 빌드된 경우 초기 설치 후 아무 조정이 필요 합니다. 둘째, 클램프에 거품 고무의 레이어 클램프 폐쇄 때 완전히 딱딱한 시스템 이론적으로 무한 한 클램핑 힘을 제로 클램핑 힘에서 급격 한 증가 경험으로 접시, 아래 준수의 작은 금액을 제공 합니다. 크로스바의 위치와 클램프의 나사는 클램프의 두 측면 사이의 거리는 괜찮을 수 있다 그래야 조정 가능 하다.
모든 노력 스트레인 특성 실험 중 점 뒤에 밝은, 흰색 배경 잘 하단에 제공 하 여야 한다. 더 나은 대비 이러한 이미지에 쉽게 될 것입니다 높이 교환원 큰 실험 분석에 대 한 지루한 될 수 있는 도트의 너비를 측정 하는 과정을 자동화. 96 잘 접시에 우물의 바닥의 고속 videography 우물의 벽 그림자 경향이 있기 때문에 도전을 선물 한다. 돔 빛 또는 카메라의 시선에 따라 이미지를 왜곡 없이 밝히는 수 확산 축 빛의 사용은 그림자 또는 반사 반사 기존의 광원으로 발생 하는 것을 제거 합니다. 밝은 빛 소스 밝은 조명 이미지 짧은 노출 시간으로 획득 될 수 있기 때문에 사용 되어야 한다. 짧은 노출 시간 동작 흐림 효과 최소화합니다. 확산 축 빛의 발광 다이오드 (Led)를 업그레이드 중 고속 비디오 짧은 노출 시간을 허용 한다. Led Led 주식 제거 확산 축 빛을 개방 하 여 업그레이드할 수 있습니다, 그리고 장착 4 높은 전원 LED Led 홀더를 사용 하 여, 일정 한 현재 전력 공급에 연결 하 고 확산 축 빛 (참조 테이블의 재조합 백 창 배열 재료 카탈로그 번호). 업그레이드 하는 Led의 단점은 과열 될 위험이 몇 초에 대 한 수 동적으로 냉각된 Led 유지할 수 없는. 따라서, 다른 빛 후 블록 및 카메라 조정의 필요 합니다.
점 막에 스탬프의 팽창 측정 하 여 막 스트레인 측정의 표시 방법은 상대적으로 원유, 하지만 그것은 강력한 방식으로 여러 우물 확장할 수 있습니다. 잘 아래쪽 스트레인 필드 디지털 이미지 상관 관계를 사용 하 여 좀 더 자세하게에서 특징 수 있습니다. 이 기술은 포함 한다 우물의 기지에 얼룩 덜 룩 한 패턴을 분사 하 고 다음에 그것을 이미징 변형 중 고속. 상용 소프트웨어는 다음 얼룩 덜 룩 한 패턴의 진화를 추적 하 여 이미지의 모든 지점에서 스트레인 척도를 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 hiPSCNs에 다 면, 임상 관련, 스트레칭 상해 형을 생성합니다. 세포 죽음, neurite 변성 및 neurite 구슬 인간에서 TBI의 모든 문서화 sequelae 이며 동물 모델15. 이 모델에서 성공의 열쇠는 설정 이며 건강 한 문화를 유지 하. 일반적으로 말하자면, 기존의 경직 된 플레이트와 개발 세포 문화 프로토콜 stretchable 격판덮개 문화에 대 한 가치 있는 출발점입니다. 그러나, 문제의 세포 실리콘에 다르게 응답할 수 있습니다 가능성 항상 고려 되어야 한다. 이 문화 상황에 매우 민감한 hiPSCNs의 특히 사실 이다. 셀 밀도 laminin 농도 최적화의 몇 가지 예는 (그림 3, 그림 4) 대표적인 결과 섹션에서 제공 됩니다. 플라즈마 처리 된 실리콘의 활성화는 생명 이다. 실리콘은 소수 성 그리고 unreactive; 자연 상태에서 그것은 하지 laminin 또는 셀 첨부를 홍보 하는 데 사용 하는 다른 분자에 바인딩합니다. 플라즈마 처리는 친수성 표면을 렌더링 하 고 반응 그룹 노출. 이러한 변화 접착 분자 실리콘 바인딩할 홍보 셀 첨부 파일을 허용 합니다. 그것은 중요 한 플라즈마 처리 효과 표면, 액체에 빠져들 고 그래서 최대한 빨리 활성화 된 표면 건조를 포함 하는 절차를 수행 해야 분 이내 사라지는 것. 플라즈마 처리의 효과 없어진 경우 확인 하는 간단한 방법은 표면에 물 한 방울을 배치 하는 것입니다. 플라즈마 처리 실리콘에 밖으로 전파 하는 반면 치료 실리콘에는 물방울을 구슬 것입니다. 우리가 사용 하는 hiPSCNs와 ( 재료의 표참조), 제조업체 셀 서 스 펜 션 보다는 사전 코팅 laminin 추가 것이 좋습니다. 이 프로토콜은이 접근을 성공적으로 통합 했다. 세분화, 이론적으로, 달성 될 수 있다 오픈 소스 소프트웨어 또는 범용 프로그래밍 언어, 하는 동안 이러한 도구와 능력의 높은 학위 좋은 결과 얻기 위해 필요 합니다. Neurites는 자주 그들은 너무 슬림 하기 때문에 배경 신호 로부터 구별 하기 어렵다입니다. 따라서, 우리는 그들이 사용할 수 있는 경우 전용 모듈 세분화와 뉴런의 정량화에 대 한 높은 콘텐츠 현미경 회사에서 배포 하는 상용 소프트웨어 도구를 사용 하 여를 권장 합니다. 상용 소프트웨어와도 시각적으로 정확도 확인 하기 위해 세분화의 이미지를 내보낼 현명 하다.
기존의 경직 된 플레이트 작업에 비해 stretchable 접시에서 일하고와 관련 된 몇 가지 제한이 있습니다. Stretchable 접시 공기 목표와 정상적으로 몇 군데 될 수 있습니다. 그러나, 집중 목표와 이미징 매우 어렵습니다. 렌즈 오일 실리콘을 손상 될 수 있습니다. 또한, 목표 위쪽으로 이동할 때 실리콘 막에 압력을 미치는. 이 압력 배 수량 막 수직, 어렵게 초점으로 샘플을가지고. 현재 판 제조에 사용 되는 실리콘 막 약 250 µ m 두께입니다. 이 두께 많은 높은 전력, 침수 목표의 초점 거리를 초과합니다. 특별 한 배려는 현미경에 필요한 평탄도 달성 하기 위해 클램핑 하기 전에 완벽 하 게 평면 멤브레인을가지고 한다. 자동 초점 시스템 어느 정도 완성 된 플레이트의 평탄도에 편차를 보정할 수 있습니다. 이후 버전의 프로토콜 평탄도 보장 하기 위해 접시 위쪽에 접착은 전에 막을 긴장 미리 수 있습니다. 플레이트 최고14 에 실리콘 막 본딩 접착제 없는 절차에는 현재 프로토콜의 중요 한 힘으로 간주 됩니다. 그것은 평탄도 접착제 층의 비균일 두께 때문에 neurotoxicity 어떤 편차 및 접착제에서의 위험을 제거합니다.
다중 전극 배열 일반적으로 그들의 성숙과 기능을 평가 하기 위해 hiPSCNs와 함께 실험에 사용 됩니다. 셀 문화 기판은 엄밀한 때문에 불행 하 게도, 이러한 시스템이 모델과 호환 되지 않습니다. Stretchable 다중 전극 어레이 만들, 비록이 지금까지 입증 되었습니다 하나의 잘 포맷16,17가능 하다. Note는 indenters에서에서 제거할 수 있습니다 개별적으로 indenter 블록을 일부 우물 들여쓰기 되지 shams로 사용할 수 있습니다. 제거 하 고 indenter 들여쓰기를 방지 하지만 기계적 로드 이므로 우물에 있는 액체의 여전히 관성 모션 스테이지를 이동 하는 동안 완전히 제거 하지 않습니다. 그것은 결코 단계 모션 움직임의 어떤 병 적인 영향을 측정에 적용 했다 플레이트에 웰 스 이 우물 비교 가치가 있다. 또한, 블록에 indenters의 배열 bisymmetric (앞 뒤쪽으로 대칭과 좌우로) 이어야 한다. 이 경고는 무대 옆으로 기울기 하지 않으며 그들의 베어링에 바인딩할 막대를 원인이 되도록 들여쓰기, 중 접시 로드 균등 하 게 보장 합니다.
Neurotrauma 치료 혁신을 주요 과제 중 하나입니다 복잡 하 고이 조건. 외상에 적용 됩니다 멀티 모달 스트레스 중앙 신경 시스템에 모든 셀 형식을 동시에. 신경 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 안정적으로 생성 된 고 널리 상용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. 혁신은이 분야에서 신속 하 게 진행 되 고 이다18 microglia19 같은 다른 신경 세포 유형 또한 hiPSCs에서 파생 되 고. 곧 체 외에 외상 그리고 공동 문화 다른 세포 유형 그들은 외상 후 통신 하는 방법을 이해 하는 것이 세포 유형의 각각의 셀 자치 응답 분리 수 수 있습니다. 이 방법에서는, 궁극적으로 철저 하 게 인간의 시스템에 그것을 이해 하는 바닥에서 임상 도전 최대 다시 수 수 있습니다. 이 방법은 다른 설치류 모델에 의존 하는 기존의 접근 이며이 일반적인, 엄청난, 그리고 다루기 힘든 조건에 대 한 첫 번째 치료를 이끌어 내는 새로운 통찰력을 생성 하는.

TBI 일으키는 약 52000 죽음과 275000 입원 마다 년1사망률과 질병 률, 미국에서의 주요 원인입니다. TBI에 대 한 후보 치료제의 임상 시험을 30 개 이상의 단일 성공2없이 실시 되었습니다. 이 유니폼 실패 인간-특정 프로세스에서 일반적으로 사용 되 전 임상 설치류 모델에서 관찰 하는 이상 인간의 TBI를 별도 나왔다.
HiPSCNs의 출현 neurotrauma 인간의 생체 외에서 모델을 공부 하는 기회를 창조 했다. 약 hiPSCN 기반 모델 심사는 설치류 셀을 채용 하는 모델 보다 더 많은 임상 성공의 예측 결과 제공할 수 있습니다. 또한, hiPSCNs는 격리 하 고 병 리3개별 인간의 유전 이체의 효과 연구 유전으로 조작할 수 있습니다.
이 원고에 설명 된 메서드는 neurotrauma을 모델링 하는 hiPSCN 기반 질병의 독특한 장점을 설계 되었습니다. Neurotrauma의 스트레치 부상 모델에 생체 외에서 잘 설립된4,5,6 주 쥐 세포와 인간의 신경 암 세포 라인은. 이러한 모델의 대부분은 공기 실리콘 막 로드 하 여 스트레치를 생성 합니다. 이 방법은 단일 잘 형식에 효과적입니다 하지만 다 잘 형식7최대 규모 어려운 입증 되었습니다. 결과적으로, 결코 스트레치 부상된 신경 치료 하는 에이전트에 대 한 높은 처리량 화면 계속 있다.
이 모델에서 막 때문에 엄밀한 indenter와 밑에서 들여쓰기 펼쳐져 있습니다. 이 방법은 단일 잘 시스템8,,910관련 임상 병리학에 생체 외에서 생성 하 반복적으로 표시 되었습니다. 우리의 최근 작품으로는 쉽게 확장 96 잘 서식 하는 도메인의 닫히는 머리 영향 이벤트12,13시간 펄스 기간 수십 밀리초11, 순서를 유지 하면서 나타났습니다.
요약 하자면,이 생체 외에서 부상 모델의 주요 장점에 96 잘 형식, hiPSCNs의 사용 및 모욕의 임상 관련 시간 도메인.

<table><tbody><tr><td>.010" 실리콘 시트</td><td>Specialty Manufacturing, Inc</td><td>#70P001200010</td><td>폴리디메틸실록산(PDMS) 시트</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc</td><td>256665 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>#12-565-600</td><td>Bottomless 96 Well Plate</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>#PDC-001-HC(</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyl) triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#440140</td><td>APTES</td></tr><tr><td>양피지</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>돔 라이트 전원 공급 장치</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>축 방향 확산 조명 장치&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>시멘스</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td><td>확산 축 방향 광</td></tr><tr><td>고출력 LED 어레이&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>고출력 LED 어레이&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>LED 홀더</td><td>Molex</td><td>1807200001</td><td>LED 홀더&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>LED 전원 공급 장치</td><td>Mean Well</td><td>HLG-320H-36B</td><td>정전류 전원 공급 장치&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>FastCam Viewer 소프트웨어&nbsp;</td><td>Photron</td><td></td><td>카메라 소프트웨어</td></tr><tr><td>Fastcam Mini UX50</td><td>Photron</td><td>N/A</td><td>고속 카메라</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>#1455</td><td>고속 카메라 렌즈</td></tr><tr><td>0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>iCell 미디어</td><td>셀룰러 다이나믹스 인터내셔널</td><td>#NRM-100-121-001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>iCell 보충제</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#H3570 Calcein AM</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#C3099</tr><tr><td>보이스 코일 액추에이터&nbsp;</td><td>BEI Kimco</td><td>LA43-67-000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>광학 리니어 엔코더&nbsp;</td><td>레니쇼</td><td>T1031-30A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>서보 드라이브</td><td>Copley Controls</td><td>Xenus XTL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>컨트롤러</td><td>: National Instruments</td><td>cRIO 9024 실시간 PowerPC 컨트롤러&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cRIO 섀시</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9113</td><td></td></tr><tr><td>디지털 입력 모듈</td><td>National Instruments</td><td>NI 9411</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 섀시</td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>계측기 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

외상 성 뇌 손상 (TBI)은 높은 사망률과 사망 주요 임상 도전 이다. 전 임상 연구의 십 년간에 불구 하 고 아니 입증 된 치료 TBI에 대 한 개발 되었습니다. 이 문서는 기존 전 임상 모델을 보완 하기 위한 전 임상 neurotrauma 연구에 대 한 새로운 메서드를 제공 합니다. 그것은 인간의 이상 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 (hiPSCNs)를 통해 소개합니다. 그것은 로드 펄스 달성 기간 임상의 로딩 기간 유사한 폐쇄 머리 영향 부상. 그것은 높은 처리량 실험을 용이 하 게 하 고 비싼 셀 및 문화 시 약의 효율적 사용 96-잘 형식을 사용 합니다. 실리콘 막 신경 uncured 폴리머를 제거 하려면 먼저 처리 되며 다음 stretchable 96 잘 접시를 만드는 상업적인 96 잘 접시에 보 세. 사용자 장치는 기계적으로 우물에 문화에 있는 세포를 손상 equibiaxial 기계적인 긴장을 유도 아래에서 잘 바닥의 일부 또는 전부를 사용 됩니다. 들여쓰기 깊이 기계적 스트레인의 관계 경험 잘 바닥의 고속 videography를 사용 하 여 들여쓰기 중 결정 됩니다. HiPSCNs를 포함 하 여 셀, 기존의 세포 배양 프로토콜의 수정된 버전을 사용 하 여 이러한 실리콘 막에 배양 수 있습니다. 세포 배양의 형광 현미경 이미지는 취득 하 고 반자동 방식에 각 잘 상해의 수준을 계량으로 부상 후 분석. 제시 하는 모델은 hiPSCNs에 최적화 되어 있지만 수 이론에서에 적용할 다른 세포 유형.

들 것 장치는 (그림 2A) 펄스의 진폭에 따라 펄스 기간이 짧은 10-15 ms와 오래전 무대를 이동 수 있습니다. 펄스 진폭 높게 반복 가능 하지만 펄스 기간 약 1 다릅니다 반복 사이 ms. 우물의 많은 수는 로드 하 고 소정의 진폭은 실제 펄스 진폭 된 펄스 진폭에서 다른 ( 그림 2B참조). 3mm 넘어 무대 변위의 진폭 증가로 실제 변위 진폭 점점 미치지 된 변위 진폭 ( 그림 2B참조). 조심 게시물 블록의 맞춤 행 또는 열 (그림 2C) 막 스트레인에 어떤 추세 든 지 제거. 3.5 m m 52 우물 들여쓰기 단계 변위 진폭 (3.3 m m 실제 변위 진폭) 처방, 모든 잘 지역에 걸쳐 평균 Lagrangian 긴장 했다 0.451 (모든 위치에 대 한 의미의 표준 편차 = 0.051, 평균 표준 편차 모든 위치에 대 한 = 0.065, n = 잘 당 5 측정). 이러한 결과 비록 그들 중 일부는 이미 보고 된11완전성에 대 한 여기 표시 됩니다.
최적, 손상 되지 않은 문화는 5 개 이상의 세포의 경우 몇 덩어리로 있을 것 이다. 개별, 슬림, 길고 긴장 또는 구슬 (그림 3A)의 거의 없거나 전혀 없는 기호로 곡선 Neurites 있을 것입니다. 이상적인 조건 하에서 문화의 생존 제조업체의 데이터 시트 (일반적으로 60-70%)에 지정 된 생존 접근 밀접 하 게 해야 하 고 실리콘에 문화는 기존의 경직 된 문화 기판 ( 유지 그 유사 합니다. 그림 3B). Neurites 되거나 저전력 밝은 분야 현미경에 표시 되지 않을 수 있습니다. Laminin 농도 세포 밀도 및 부상 후 기준선에 영향. 셀 밀도 증가 수 및 문화에서 형성 하는 덩어리의 크기를 증가 했다. 종종 laminin 농도 증가 counteracted이 효과 (그림 3A). 그러나, 부상 (그림 4) 문화의 감도 무디게 하 너무 많이 집중 된 laminin 증가. 손상 되지 않은 문화에 대 한 최적의 laminin 농도 50 µ g/mL laminin (그림 3), 하지만 가짜 고 스트레치 부상된 인구 사이 최적의 분리 laminin (그림 4)의 10 µ g/mL에서 얻은 했다. 높은 laminin 농도 점에서 긴 시간 (예를 들어, 7 일) 향상 된 초기 세포 생존 능력 뿐만 아니라 짧은 시간 포인트 (그림 4), 부상 문화의 감도 감소. 요약 하자면, 그것은 각 실험 시나리오에 대 한 laminin 농도 최적화 가치가입니다.
막 긴장, 후 부상 영상 시간, laminin 농도, 및 세포 밀도 모든 셀 당 neurite 길이에 고도의 통계적으로 중요 한 주요 효과 발휘 (ANOVA, p &lt; 0.001). 셀 당 neurite 길이에 막 긴장의 효과 했다 후 부상 이미징 시간 지점과 laminin 농도와 높은 통계적으로 중요 한 상호 작용 (ANOVA, p &lt; 0.001)와 셀와 통계적으로 중요 한 상호 작용을 밀도 (ANOVA, p &lt; 0.05). 마찬가지로, 막 긴장, 후 부상 밀도, 셀 시간 포인트, 이미징 및 모든 laminin 농도 세포 생존 능력에 높은 통계적으로 중요 한 주요 효과 발휘 (ANOVA, p &lt; 0.001). 세포 생존 능력에 막 긴장의 효과 했다 후 부상 이미징 시간 포인트와 높게 통계적으로 중요 한 상호 작용을 (ANOVA, p &lt; 0.001) 및 셀 밀도 (ANOVA, p 와 통계적으로 중요 한 상호 작용을 &lt; 0.05). 이러한 결과 타이밍, 세포 밀도, 그리고 laminin 농도 발휘 적용된 모욕 및 실험 결과 관계에 중요 한 영향을 미치는 그래서 각 신중 하 게 최적화 되어야 합니다 증명.
낮은 세포 생존 능력 및 저하 neurite 성장, 함께 파란색된 neurites 독성 문화 조건에서 부적절 하 게 발생할 수 있는 실리콘 준비를 나타냅니다. 건너뛰기 또는 물 담가 또는 건조 오븐 단축 수 흡수 에탄올 떠나거나 미디어로 확산 하 고 셀 강조 수 있는 멤브레인, 각각, 물. 세포 생존 능력, 단축 또는 누락 neurites, 파란색된 neurites, 및 긴장 된 또는 데크에 neurites 잘 부상된 문화 감소 됩니다. 부상 수 있습니다 잘 분산 된 사전 부상 했다 세포 배양에 응집을 유도 하 고 있다. 큰 덩어리는 형태소 분석을 혼동 수 있습니다. 형태소 분석에 대 한 눈에 띄는 변화가 발생 하지만 셀은 여전히 일부 neurites 함께 존재 하는 상해 수준을 조정 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> 그림 1 : A 라는 부상 장치 회로도. (A) 평면도, 아이소메트릭 뷰 (B), (C) 전면 보기, (D) 오른쪽 보기. 눈금 막대는 직교 뷰 (A, B, D)에 적용 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> 그림 2 : 기계적 모욕의 운동학. (A) 단계 변위 기록 된 진폭 (범례에 나열 된 진폭)의 범위에서 5 펄스 동안 아무 웰 스는 로드 되었을 때. (B) 단계 변위 기록 된 진폭 (범례에 나열 된 진폭)의 범위에서 10 펄스 동안 52 웰 스는 로드 되었을 때. (C) 각 잘 3.3 m m의 무대 변위 진폭의 평균 변형 (n = 5 측정 음, 당 평균 표준 오차 잘 당 0.029 =). C4-f 4와 c 9 f 9는 스트레치 제어 우물 note. 이 그림에서 셔먼 외 수정 되었습니다. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> 그림 3 : 문화의 최적화 실리콘에 조건. (A) 다양 한 실리콘에 hiPSCN 문화에 셀 밀도 laminin 농도의 효과. 셀 밀도 증가 laminin 농도 감소와 응집 증가 합니다. 셀 밀도 laminin 농도 문화 모노 분산을 달성 하기 위하여 낙관 되어야 한다. 모노 분산 문화는 덜 취약 아티팩트를 정량화 하는 동안. 참고 동적 범위는 neurites의 시각화를 최적화 하기 위해 조정 되었습니다. 결과적으로, 많은 밝은 소마 포화 됩니다. 이 프레 젠 테이이 션은 많은 주차 neurites 거의 보이지 않는 렌더링 소마에 대해 동적 범위를 최적화의 대안을 선호. 빨간색 사각형으로 강조 표시 조건 스트레치 부상 실험 체 외에 대 한 최적의 간주 했다. (B) 최적의 조건에서 실리콘 막에 문화 유사 하 게 나타납니다 기존의 딱딱한 기판에 문화. 왼쪽된 패널 hiPSCNs 33,750 셀/cm2 (셀 문화 기판은 취급 하는 조직 문화 주기적 올레 공동 중합체) 기존의 엄밀한 96 잘 접시에 laminin의 3.3 µ g/mL에서 교양 보여줍니다. 오른쪽 패널 (A)에서 빨간색으로 설명 패널을 재현 합니다. 바 규모 = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> 그림 4 : 부상 표현 형 및 그것의 의존 laminin 농도. (A) 건강 한 문화, 10 µ g/mL laminin 및 67,500 셀/c m2를 사용 하 여. Neurites 아무 구슬과 오래 있습니다. 몇 가지 죽은 핵, 그리고 몇 덩어리 있다. (B) 문화 같은 문화 조건, 57% 피크 스트레인 부상 4 h. Neurites 단축 후 몇 군데 또는 누락 된, 그리고 일부는 구슬 (화살표로 표시). 적은 Calcein 오전-긍정적인 세포 그리고 있다 더 많은 Calcein 오전 음수가 핵 (즉, 죽은). 부상 가운데 살아남은 세포 응집을 증가 했다. (C) 부상 후 4 h, 셀 당 neurite 길이 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (D) 부상 후 4 h, 세포 생존 능력 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (E) 부상 후 24 h, 셀 당 neurite 길이 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (F) 부상 후 24 h, 세포 생존 능력 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (n = 4 당 바, 오차 막대는 ± 1 표준 편차, 스케일 바 = 100 µ m). 스트레인 값은 셔먼 외. 여 이전 게시에서 데이터를 사용 하 여 단계 변위에서 추론 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1:는 indenter의 드로잉 기술. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 테이블 2: 96 잘 접시-로더 핀아웃 배선도. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 1: 부상 장치의 컴퓨터 지원 설계 도면. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 2: 플레이트 제작 클램프의 컴퓨터 지원 설계 도면. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 3: 스탬프 형상, 3D 프린터와 함께 사용 하기 위해 적합 한 3D 표현. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 4: SubVI MuStLiMo_si_initialize.vi, 인 motion_control.vi 위한 SubVI에 대 한. 모션에 대 한 매개 변수를 대화 상자에 항목을 변환합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 5: SubVI 여러 직선 라인 Moves_simplified.vi, 인 motion_control.vi 위한 SubVI에 대 한. 모션에 대 한 매개 변수를 대화 상자에 항목을 변환합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 6: SubVI position_tracker.vi에 대 한. 카운터 트랙 치환 선형 인코더에서 입력입니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 7: 기반 LabVIEW 프로젝트. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 8: 탑 이동 장치 레벨 VI. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 9: SubVI motion_control.vi에 대 한. 접시를 뻗어 급속 한 변위를 실행 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 10: SubVI motion_control.vi에 대 한. 스테이지를 이동 하는 느린 변위를 실행 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 11: SubVI motion_control.vi에 대 한. Motion_control.vi 컨트롤 패널에서 (보통 언더샘플링된) 변위 역사를 플롯합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 12: 변위 역사를 기록 하는 레벨 6 톱. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 13: 포함 Variable2, motion_control.vi와 position_tracker.vi 사이 통신. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 14: 인쇄 회로 기판에 대 한 도식. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 15: 인쇄 회로 보드 레이아웃. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 선물이 외상 영향 관련 날짜 표시줄에 96-잘 형식에서 스트레치 상해의 모델 인간 생체 외에서 하는 방법. 이 기계적 모욕, 경작 및 셀 부상, 이미징, 및 상해 계량 높은 콘텐츠 분석 측정 stretchable 번호판 조작에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

이 모델의 전반적인 목표는 여러 실험 조건에서 입은 부상을 효율적이고 동시에 비교할 수 있도록 96웰 형식으로 임상적으로 관련된 신경 외상 표현형을 만드는 것입니다. 이 모델의 주요 목적은 인간 유도 만능 줄기세포 유래 뉴런을 사용하여 신경 외상에서 고함량 표현형 약물 발견 스크리닝을 가능하게 하는 것입니다. 이 모델에 사용된 플레이트는 업계 표준 96웰 플레이트 형상을 유지하여 로봇 팔 및 자동 현미경과 같은 기존 고함량 스크리닝 기계와의 호환성을 유지합니다.시작하려면 바닥이 없는 96웰 플레이트 바닥면을 위로 향하게 하여 200와트 플라즈마 클리너 내부에 고출력으로 60초 동안 놓습니다. 다음으로, 갓 준비한 200%APTES 200ml에 플레이트를 탈이온수에 넣고 바닥이 아래를 향하도록 하여 흄 후드에서 20분 동안 놓습니다. 배양 10분 후 집게를 사용하여 7.5 x 11cm 양피지 직사각형 위에 플라즈마 처리된 실리콘 멤브레인을 배치하고 플레이트 제작 클램프의 아래쪽 부분에 7.5 x 11.05cm 알루미늄 슬래브를 정렬합니다.그런 다음 집게를 사용하여 실리콘 멤브레인과 양피지를 알루미늄 슬래브에 정렬합니다. 코팅 기간이 끝나면 APTES 수조에서 바닥이 없는 플레이트를 제거하고 여분의 용액을 털어냅니다. 바닥이 없는 플레이트를 2회 연속 200ml 탈이온수 수조에 5초씩 담글 때마다 담그고 여분의 물을 털어냅니다.압축 공기로 완전히 건조시킨 후 바닥이 없는 플레이트를 플레이트 제작 클램프의 상부에 놓고 클램프를 부드럽게 닫아 바닥이 없는 플레이트와 실리콘을 함께 누릅니다. 인덴터 블록을 정렬하려면 스테이지 클램프를 사용하여 플레이트를 라이브 피드가 있는 카메라 아래 스트레치 장치의 스테이지에 고정하고 장치 위에 돔 조명을 놓습니다. 부상 장치에 연결된 컴퓨터에서 기기 제어 소프트웨어를 실행하고 실행 창을 클릭하여 체외 신경 외상 프로젝트를 실행합니다.프로젝트 창에서 Motion Control and Position Tracker 가상 계측기를 두 번 클릭합니다. 부상 장치를 둘러싼 케이지를 닫고 모션 제어 가상 기기의 화살표를 클릭하여 기기를 실행합니다. 하단 근처를 클릭하여 스테이지를 인덴터와의 접촉 후 2mm 이내로 낮춘 다음 중지를 클릭하여 가상 계측기를 중지합니다.프로젝트 창에서 Axis One을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Interactive Test Panel을 클릭합니다. 창의 Target Position 필드에 500 단위를 입력하면 단계 크기가 50 마이크로미터로 설정됩니다. 그런 다음 플레이트가 먼저 인덴터와 접촉할 때까지 Go를 반복해서 클릭하여 카메라에 표시되는 라이브 이미지의 접촉을 확인합니다.수직 스테이지 위치는 대화형 테스트 패널 창의 왼쪽 상단에 보고됩니다. 모든 웰이 인덴터에 닿을 때까지 플레이트를 더 낮추고 필요에 따라 카메라와 스테이지를 움직여 전체 플레이트를 봅니다. 모든 포스트가 접촉할 때 보고된 수직 스테이지 위치를 기록하고 대화형 테스트 패널을 닫습니다.그런 다음 모션 제어 가상 악기를 실행하고 Top을 클릭하여 스테이지를 올리고, 스테이지가 제자리에 있을 때 정지 버튼을 사용하여 가상 악기를 중지합니다. 도어를 열어 장치를 비활성화한 다음 먼저 접촉한 모서리의 세트 나사를 풀어 모서리를 내리고 반대쪽 나사를 조여 마지막으로 접촉한 모서리를 올립니다. 플레이트가 모든 압자와 동시에 접촉할 때까지 블록을 내리고, 관찰하고, 조정하는 작업을 반복합니다.인덴터 블록의 신중한 정렬은 플레이트의 모든 웰에서 균일한 부상을 달성하는 데 중요합니다. 도어를 열어 장치를 다시 비활성화하고 타이다운 나사를 인덴터 블록의 구멍에 삽입합니다. 그런 다음 나사를 제자리에 조이고 플레이트가 접촉할 때 대화형 테스트 패널에서 보고한 스테이지 위치를 확인합니다.플레이트를 늘리려면 위치 검사 가상 기기의 File Path(파일 경로) 필드에 있는 파일 이름을 고유한 파일 이름으로 변경하고 Run(실행) 화살표를 클릭합니다. 움푹 들어간 곳의 깊이와 지속 시간, 그리고 Injury and Injury Duration 필드를 movement control panel 가상 악기에서 설정합니다. 플레이트가 0 위치에 있는 상태에서 이동 제어 패널 가상 기기를 실행하고 Injure를 클릭하여 플레이트를 움푹 넣습니다.상단을 클릭하여 스테이지를 위로 이동하고, 플레이트가 상단 위치에 있을 때 중지를 클릭하고, 도어를 열어 부상 장치를 비활성화합니다. 그런 다음 위치 추적기 가상 기기에 표시된 스테이지의 변위 이력을 검사하여 지정된 최대 변위가 적용되었는지 확인하고 데이터를 적절한 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다. 실리콘 멤브레인의 신축을 평가하려면 플라즈마 처리 후 플레이트를 부드러운 표면에 놓고 영구 마커 펜의 잉크로 스탬프의 작은 돌출부를 프라이밍합니다.삽입할 stamp를 테스트할 첫 번째 웰에 넣고 탭하여 잉크가 잘 전달되도록 합니다. 모든 웰이 스탬핑되면 렌즈를 가장 작은 번호가 매겨진 F-stop으로 설정하고 시야에 3x4 그리드에 12개의 압자가 포함되도록 부상 장치 위의 붐 스탠드에 고속 카메라를 배치합니다. 영점 위치에 있는 상태에서 카메라 소프트웨어의 녹화 버튼을 한 번 클릭하여 트리거를 읽고 밝은 확산 축 광을 켭니다.그런 다음 방금 설명한 대로 플레이트를 움푹 넣고 축 방향 조명을 끕니다. 세포 배양을 손상시키려면 플라즈마 처리된 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 라미닌 처리, 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 추가하고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣기 전에 실온에서 15분 동안 세포가 플레이트 바닥에 부착되도록 합니다. 2-3일간의 배양 후 부상 장치 스테이지에 플레이트를 고정하고 배양물을 주변 공기에 노출시키지 않고 플레이트를 고정하기 위해 뚜껑의 위치를 조정합니다.그런 다음 플레이트를 영점 위치에 놓고 방금 설명한 대로 플레이트를 들여씁니다. 손상되지 않은 최적의 배양액은 5개 이상의 세포 덩어리가 거의 없으며, 신경돌기는 개별적이고, 길고, 가늘고, 구부러져 있으며, 구슬 모양이 거의 또는 전혀 없습니다. 이상적인 조건에서 배양물의 생존력은 제조업체의 데이터 시트에 명시된 생존력에 근접해야 하며, 실리콘의 배양은 기존의 경질 배양 기질에서 유지되는 것과 유사해야 합니다.세포 밀도를 높이면 배양에서 형성되는 덩어리의 수와 크기가 증가하는 반면, 라미닌 농도를 높이면 일반적으로 이러한 효과가 상쇄됩니다. 57%의 피크 균주로 손상된 배양물에서는 손상 후 4시간이 지나면 신경돌기가 짧아지거나 누락되며, 일부는 남아 있는 생존 가능한 세포에 의해 응집된 구슬이 있습니다. 특히, 고용량 라미닌 처리는 농도 의존적 방식으로 세포 배양에 대한 손상의 심각성을 감소시키며, 이는 고용량 라미닌 처리 배양에서 신경돌기 길이와 세포 생존율의 증가로 입증되었습니다.이 절차를 시도하는 동안 리드 타임을 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 멤브레인 해독에는 3일이 걸리며 제조된 플레이트는 사용하기 전에 하룻밤 동안 경화되어야 합니다. 부상 장치에는 움직임을 구동하는 강력한 음성 코일이 포함되어 있으며, 장치가 활성화되어 있을 때는 항상 장치를 멀리해야 하며 무대가 트래블의 맨 위에 있을 때만 장치의 전원을 꺼야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 흥분성 피질 뉴런을 생성하는 방법을 보여줍니다. 독시사이클린 유도 시, hiPSC는 신경 특이적 전사 인자인 뉴로게닌-2를 과발현합니다. 특정 배지를 사용하고 성상세포와 공동 배양함으로써, 이 과정은 hiPSC가 시냅스 연결을 가진 뉴런으로 분화하는 것을 용이하게 합니다.

Differentiating human-induced pluripotent stem cells into neurons on micro-electrode arrays (인간 유도 만능 줄기세포를 마이크로 전극 어레이의 뉴런으로 분화)

이 비디오는 인간의 iPSC를 운동 뉴런으로 분화하는 과정을 보여줍니다. 그 이유는 특정 전사 인자를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 iPSC를 활용하는 것입니다. 독시사이클린을 함유한 배지에서 배양하면 이 항생제는 전사 인자의 발현을 유발하여 운동 뉴런 전구체로의 iPSC 분화를 촉진합니다. 궁극적으로, 전구 세포는 성숙하고 기능적인 운동 뉴런을 생성하기 위해 뉴런 배지에서 배양됩니다.

공학적 인간 유도 만능 줄기세포를 기능적 운동 뉴런으로 분화시키기

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런(hiPSCN)에 스트레치 손상을 유도하는 과정을 보여줍니다. 세포는 실리콘 멤브레인이 부착된 바닥이 없는 다중 웰 플레이트에서 채취됩니다. 제어된 기계적 응력이 세포막에 가해져 세포골격 파괴 및 세포막 손상을 유도하여 세포에 스트레치 손상 표현형을 유도합니다.

An In Vitro Model of Stretch Injury in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

선물이 여기 각 somite 파생 (myotome, sclerotome, dermatome, 및 syndetome)에 인간 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대 한 프로토콜 정의 화학적 조건에서 미래의 질병 모델링에 응용 프로그램에는 고 정형 외과에서 세포 기반 요법입니다.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

배우세요 인간 유도만능줄기세포 유래 신경세포를 이용한 96웰 고속 스트레치 부상 모델 제작 방법을. 이 기법은 신경외상 연구 및 고내용량 약물 스크리닝에 활용됩니다.

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

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