인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

이 모델의 전반적인 목표는 여러 실험 조건에서 입은 부상을 효율적이고 동시에 비교할 수 있도록 96웰 형식으로 임상적으로 관련된 신경 외상 표현형을 만드는 것입니다. 이 모델의 주요 목적은 인간 유도 만능 줄기세포 유래 뉴런을 사용하여 신경 외상에서 고함량 표현형 약물 발견 스크리닝을 가능하게 하는 것입니다. 이 모델에 사용된 플레이트는 업계 표준 96웰 플레이트 형상을 유지하여 로봇 팔 및 자동 현미경과 같은 기존 고함량 스크리닝 기계와의 호환성을 유지합니다.

시작하려면 바닥이 없는 96웰 플레이트 바닥면을 위로 향하게 하여 200와트 플라즈마 클리너 내부에 고출력으로 60초 동안 놓습니다. 다음으로, 갓 준비한 200%APTES 200ml에 플레이트를 탈이온수에 넣고 바닥이 아래를 향하도록 하여 흄 후드에서 20분 동안 놓습니다. 배양 10분 후 집게를 사용하여 7.5 x 11cm 양피지 직사각형 위에 플라즈마 처리된 실리콘 멤브레인을 배치하고 플레이트 제작 클램프의 아래쪽 부분에 7.5 x 11.05cm 알루미늄 슬래브를 정렬합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 실리콘 멤브레인과 양피지를 알루미늄 슬래브에 정렬합니다. 코팅 기간이 끝나면 APTES 수조에서 바닥이 없는 플레이트를 제거하고 여분의 용액을 털어냅니다. 바닥이 없는 플레이트를 2회 연속 200ml 탈이온수 수조에 5초씩 담글 때마다 담그고 여분의 물을 털어냅니다.

압축 공기로 완전히 건조시킨 후 바닥이 없는 플레이트를 플레이트 제작 클램프의 상부에 놓고 클램프를 부드럽게 닫아 바닥이 없는 플레이트와 실리콘을 함께 누릅니다. 인덴터 블록을 정렬하려면 스테이지 클램프를 사용하여 플레이트를 라이브 피드가 있는 카메라 아래 스트레치 장치의 스테이지에 고정하고 장치 위에 돔 조명을 놓습니다. 부상 장치에 연결된 컴퓨터에서 기기 제어 소프트웨어를 실행하고 실행 창을 클릭하여 체외 신경 외상 프로젝트를 실행합니다.

프로젝트 창에서 Motion Control and Position Tracker 가상 계측기를 두 번 클릭합니다. 부상 장치를 둘러싼 케이지를 닫고 모션 제어 가상 기기의 화살표를 클릭하여 기기를 실행합니다. 하단 근처를 클릭하여 스테이지를 인덴터와의 접촉 후 2mm 이내로 낮춘 다음 중지를 클릭하여 가상 계측기를 중지합니다.

프로젝트 창에서 Axis One을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Interactive Test Panel을 클릭합니다. 창의 Target Position 필드에 500 단위를 입력하면 단계 크기가 50 마이크로미터로 설정됩니다. 그런 다음 플레이트가 먼저 인덴터와 접촉할 때까지 Go를 반복해서 클릭하여 카메라에 표시되는 라이브 이미지의 접촉을 확인합니다.

수직 스테이지 위치는 대화형 테스트 패널 창의 왼쪽 상단에 보고됩니다. 모든 웰이 인덴터에 닿을 때까지 플레이트를 더 낮추고 필요에 따라 카메라와 스테이지를 움직여 전체 플레이트를 봅니다. 모든 포스트가 접촉할 때 보고된 수직 스테이지 위치를 기록하고 대화형 테스트 패널을 닫습니다.

그런 다음 모션 제어 가상 악기를 실행하고 Top을 클릭하여 스테이지를 올리고, 스테이지가 제자리에 있을 때 정지 버튼을 사용하여 가상 악기를 중지합니다. 도어를 열어 장치를 비활성화한 다음 먼저 접촉한 모서리의 세트 나사를 풀어 모서리를 내리고 반대쪽 나사를 조여 마지막으로 접촉한 모서리를 올립니다. 플레이트가 모든 압자와 동시에 접촉할 때까지 블록을 내리고, 관찰하고, 조정하는 작업을 반복합니다.

인덴터 블록의 신중한 정렬은 플레이트의 모든 웰에서 균일한 부상을 달성하는 데 중요합니다. 도어를 열어 장치를 다시 비활성화하고 타이다운 나사를 인덴터 블록의 구멍에 삽입합니다. 그런 다음 나사를 제자리에 조이고 플레이트가 접촉할 때 대화형 테스트 패널에서 보고한 스테이지 위치를 확인합니다.

플레이트를 늘리려면 위치 검사 가상 기기의 File Path(파일 경로) 필드에 있는 파일 이름을 고유한 파일 이름으로 변경하고 Run(실행) 화살표를 클릭합니다. 움푹 들어간 곳의 깊이와 지속 시간, 그리고 Injury and Injury Duration 필드를 movement control panel 가상 악기에서 설정합니다. 플레이트가 0 위치에 있는 상태에서 이동 제어 패널 가상 기기를 실행하고 Injure를 클릭하여 플레이트를 움푹 넣습니다.

상단을 클릭하여 스테이지를 위로 이동하고, 플레이트가 상단 위치에 있을 때 중지를 클릭하고, 도어를 열어 부상 장치를 비활성화합니다. 그런 다음 위치 추적기 가상 기기에 표시된 스테이지의 변위 이력을 검사하여 지정된 최대 변위가 적용되었는지 확인하고 데이터를 적절한 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다. 실리콘 멤브레인의 신축을 평가하려면 플라즈마 처리 후 플레이트를 부드러운 표면에 놓고 영구 마커 펜의 잉크로 스탬프의 작은 돌출부를 프라이밍합니다.

삽입할 stamp를 테스트할 첫 번째 웰에 넣고 탭하여 잉크가 잘 전달되도록 합니다. 모든 웰이 스탬핑되면 렌즈를 가장 작은 번호가 매겨진 F-stop으로 설정하고 시야에 3x4 그리드에 12개의 압자가 포함되도록 부상 장치 위의 붐 스탠드에 고속 카메라를 배치합니다. 영점 위치에 있는 상태에서 카메라 소프트웨어의 녹화 버튼을 한 번 클릭하여 트리거를 읽고 밝은 확산 축 광을 켭니다.

그런 다음 방금 설명한 대로 플레이트를 움푹 넣고 축 방향 조명을 끕니다. 세포 배양을 손상시키려면 플라즈마 처리된 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 라미닌 처리, 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 추가하고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣기 전에 실온에서 15분 동안 세포가 플레이트 바닥에 부착되도록 합니다. 2-3일간의 배양 후 부상 장치 스테이지에 플레이트를 고정하고 배양물을 주변 공기에 노출시키지 않고 플레이트를 고정하기 위해 뚜껑의 위치를 조정합니다.

그런 다음 플레이트를 영점 위치에 놓고 방금 설명한 대로 플레이트를 들여씁니다. 손상되지 않은 최적의 배양액은 5개 이상의 세포 덩어리가 거의 없으며, 신경돌기는 개별적이고, 길고, 가늘고, 구부러져 있으며, 구슬 모양이 거의 또는 전혀 없습니다. 이상적인 조건에서 배양물의 생존력은 제조업체의 데이터 시트에 명시된 생존력에 근접해야 하며, 실리콘의 배양은 기존의 경질 배양 기질에서 유지되는 것과 유사해야 합니다.

세포 밀도를 높이면 배양에서 형성되는 덩어리의 수와 크기가 증가하는 반면, 라미닌 농도를 높이면 일반적으로 이러한 효과가 상쇄됩니다. 57%의 피크 균주로 손상된 배양물에서는 손상 후 4시간이 지나면 신경돌기가 짧아지거나 누락되며, 일부는 남아 있는 생존 가능한 세포에 의해 응집된 구슬이 있습니다. 특히, 고용량 라미닌 처리는 농도 의존적 방식으로 세포 배양에 대한 손상의 심각성을 감소시키며, 이는 고용량 라미닌 처리 배양에서 신경돌기 길이와 세포 생존율의 증가로 입증되었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 리드 타임을 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 멤브레인 해독에는 3일이 걸리며 제조된 플레이트는 사용하기 전에 하룻밤 동안 경화되어야 합니다. 부상 장치에는 움직임을 구동하는 강력한 음성 코일이 포함되어 있으며, 장치가 활성화되어 있을 때는 항상 장치를 멀리해야 하며 무대가 트래블의 맨 위에 있을 때만 장치의 전원을 꺼야 합니다.